편모 모터 기능의 생물 물리학 적 특성

요약

최근의 연구 결과에 따르면 박테리아 편모 모터는 다양한 환경 신호를 감지하고 이에 반응하여 리모델링을 합니다. 여기에서 논의된 비드 분석은 환경 스트레스 요인에 대한 세포 적응에서 리모델링의 역할을 설명하는 데 도움이 될 것으로 예상됩니다.

초록

박테리아 운동성과 화학주성에서 편모 모터의 역할은 잘 알려져 있습니다. 최근의 발견에 따르면 편모 모터는 다양한 환경 자극에 반응하여 리모델링할 수 있으며 표면 집락 및 감염의 유발 요인 중 하나입니다. 모터가 세포 적응을 리모델링하고 촉진하는 정확한 메커니즘은 주요 모터 속성에 따라 달라질 수 있습니다. 여기에 제시된 광전자 증배관 기반 비드 추적 기술을 사용하면 모터 속도 및 스위치 역학의 적응을 포함하여 모터 기능의 정확한 생물물리학적 특성을 분석할 수 있습니다. 이 접근 방식은 실시간 추적의 이점과 장기간에 걸쳐 모터 동작을 프로브할 수 있는 기능을 제공합니다. 논의된 프로토콜은 다양한 박테리아 종의 편모 모터를 연구하기 위해 쉽게 확장될 수 있습니다.

서론

편모 모터는 나선형 외 필라멘트를 회전하여 수영을 셀 수 있습니다. 모터가 편모 (즉, 점성 부하)의 소정 기간 동안 생성 할 수있는 토크의 양이 수영 속도를 결정한다. 한편, 회전 방향을 전환 할 수있는 능력은 화학 약품, 화학 주성으로 공지 된 과정에 응답하여 세포 이동을 제어한다. 화성과 운동성되는 독성은 ^1-3, 편모 모터는 년 ^4로 잘 특성화 된 요인. 증거 확보 해주기 모터가 mechanosensor 역할을 제안 - 그것은 기계적 고체 기판 ^-5,6-의 존재를 검출한다. 이 기능은 가능성이 표면 식민지 및 감염 ^{5,7 트리거링에} 도움이됩니다. 결과적으로, 모터의 표면과 동수 신호를 감지하여 그에 메커니즘의 중요성 ^8,9이다.

편모 모터는 쉽게 flagell를 테 더링으로 공부하실 수 있습니다UM 기판에 세포 회전을 관찰. 이러한 테 더링이 먼저 안티 - 후크 항체 ^(10)와 유리 기판에 polyhook의 대장균에서 돌연변이 성공적으로 연결된 후크와 협력 실버 사이먼에 의해 달성되었다. 속박 세포 분석은 화학 자극의 다양한 모터 스위치의 반응을 연구 연구 할 수 있었다. 예를 들어,....

프로토콜

1. 셀 준비

1. 10 mL의 신선한 TB 100 희석 : 1에 접종 한 다음 트립 톤 국물 (TB, 1 % 펩톤, 0.5 % 염화나트륨)에 대립 유전자 ^{15, 22} 끈적 끈적한 플릭를 들고 원하는 균주의 야간 문화를 성장. OD ₆₀₀ = 0.5까지 진탕 배양기에서 33 ° C에서 문화를 성장.
2. 1,500 XG에서 세포 펠렛 5-7 분, 재 분산 펠렛 적극적으로 필터 살균 운동 버퍼의 10 ㎖의 (MB를 10 mM의 인산 완충액 : 0.05-0.06 M 염화나트륨, ^10-4 M EDTA, 1 μm의 메티오닌, pH가 7.0).
3. 단계를 반복 1.2 두 번 더 1 ML의 MB의 마지막 펠릿을 재 분산.
4. (- 12cm 길이, 0.58 mm 내경 7) 폴리에틸렌 튜브로 연결된 21 ~ 23 게이지 어댑터와 함께 두 주사기 사이에 앞뒤로 ~ 75 번 전달하여 정지 전단. 45 초 - (30) 전단의 총 시간을 제한합니다.
5. 5-7 분 동안 1,500 XG에서 전단 된 세포를 원심 분리하여 다시 분산MB의 500 μL - 100 펠렛.

2. 슬라이드 준비

1. 커버....

결과

광전자 증 배관 설치는 그림 1A에 표시됩니다. 이는 관심의 PMT가 비드에 의해 산란의 파장 범위에서 높은 감도를 갖는 것이 중요하다. 여기에서 사용되는 PMT가 가시 근적외선 범위에서 동작하고, 할로겐 광원에 의해 조명 비즈 산란광을 검출 할 수 있었다. 최적의 조명 조건 및 공급 전압을 하나의 설정마다 다를 것이다. 이 작업에 사용되는 설정하는 PMT 이득 ~ 들어 ^4월 10일에서 5월 10일까지 ^충분히 입증했다. 각각의 광전자는 광전자 앞에 위치하는 3 × 1mm 슬릿 제외 덮었다. 슬릿 광은 광전자 증 배관을 입력 할 수있는 세포 샘플의 영역을 제한하고,이 슬릿은 서로 직교한다. 회전 비드 올바른 위치 (도 1b)에 위치하는 경우, 광전자 증 증가 들어오는 빛의 양이 비드 온다그것의 원형 경로로보기 및 감소에 떨어져보기에서 그것을합니다. 정현.......

토론

테더 비드 추적 모터 토크의 정확한 추정을 용이하게하기 위해, 다음과 같은 정보가 검토되어야한다. flagellated 세포 이러한 측정을 수행 할 때, 전단은 중요한 단계입니다. 전단시켜 상기 모터의 점성 부하가 비드에 주로 기인하고 10 %의 오차 ^(16)에서 추정 될 수 있도록, 단순한 스터브로 편모 필라멘트를 감소시킨다. 양털 깎기도 밀접하게 분산 기행 (<비드 직경 ^14)와 원형 궤적을 찾는 기회를 향상시킨다. 추적 및 점성 드래그를 계산할뿐만 아니라 열악한 신호 대 잡음비의 결과에 오류를 화합물 제멋대로 궤적 부적절한 전단 결과. 오실로스코프의 사용은 이러한 데이터를 신속하게 제거 할 수 있습니다. 편모 필라멘트의 생체 역학적 특성은 종에 따라 다양 할 것으로 예상되기 때문에, 전단 방법 가능성 t에 충분한 전단력을 보장하도록 구성 될 필요그는 관심의 박테리아. 셔링과 연관된 에러를 감소시키는 효과적인 방법은 필라멘트 단백질을 인코딩하는 유전자를 결여 세포에서 작동한다. .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
폴리-L-라이신 용액(0.1%)	시그마-알드리치	P8920
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US 폴리비드 마이크로스피어	Polysciences, Inc.	7307	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
1 mL 루어 슬립 팁 주사기	Exel Int.	26048	http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic Luer-Stub 어댑터 23-게이지	Becton, Dickinson and Company	427565	http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
폴리에틸렌 튜빙	Harvard Apparatus	59-8325	http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
광전자 증배관 튜브	Hamamatsu	R7400U-20	스펙트럼 응답 범위는 300에서 920 nm, 피크 파장은 630 nm,  0.78 ns 응답 시간  http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3 x 1 mm 정밀 슬릿	Edmund Optics	NT39-908	광전자 증배관에 서로 직각으로 장착된 2개의 슬릿
오실로스코프	Tektronix	TBS 1032B	대체 브랜드를 사용할 수 있습니다. 디지털 오실로스코프, TBS 1000B 시리즈, 2 아날로그, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts  http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
8극 LP/HP 필터	Krohn-Hite	3384	대체 브랜드를 사용할 수 있습니다. 0.1Hz에서 200kHz 사이의 주파수 범위를 사용하는 것이 좋습니다.     http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Optiphot 현미경	Nikon	NA	모든 직립 또는 반전 위상 현미경을 사용할 수 있습니다. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) Cube Beamsplitter	ThorLabs	BS013