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방법 논문

편모 모터 기능의 생물 물리학 적 특성

7.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55240

⸱

2017년 1월 18일

 ,  , 
1Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University

이 논문에서

요약

최근의 연구 결과에 따르면 박테리아 편모 모터는 다양한 환경 신호를 감지하고 이에 반응하여 리모델링을 합니다. 여기에서 논의된 비드 분석은 환경 스트레스 요인에 대한 세포 적응에서 리모델링의 역할을 설명하는 데 도움이 될 것으로 예상됩니다.

초록

박테리아 운동성과 화학주성에서 편모 모터의 역할은 잘 알려져 있습니다. 최근의 발견에 따르면 편모 모터는 다양한 환경 자극에 반응하여 리모델링할 수 있으며 표면 집락 및 감염의 유발 요인 중 하나입니다. 모터가 세포 적응을 리모델링하고 촉진하는 정확한 메커니즘은 주요 모터 속성에 따라 달라질 수 있습니다. 여기에 제시된 광전자 증배관 기반 비드 추적 기술을 사용하면 모터 속도 및 스위치 역학의 적응을 포함하여 모터 기능의 정확한 생물물리학적 특성을 분석할 수 있습니다. 이 접근 방식은 실시간 추적의 이점과 장기간에 걸쳐 모터 동작을 프로브할 수 있는 기능을 제공합니다. 논의된 프로토콜은 다양한 박테리아 종의 편모 모터를 연구하기 위해 쉽게 확장될 수 있습니다.

서론

편모 모터는 나선형 외 필라멘트를 회전하여 수영을 셀 수 있습니다. 모터가 편모 (즉, 점성 부하)의 소정 기간 동안 생성 할 수있는 토크의 양이 수영 속도를 결정한다. 한편, 회전 방향을 전환 할 수있는 능력은 화학 약품, 화학 주성으로 공지 된 과정에 응답하여 세포 이동을 제어한다. 화성과 운동성되는 독성은 1-3, 편모 모터는 년 4로 잘 특성화 된 요인. 증거 확보 해주기 모터가 mechanosensor 역할을 제안 - 그것은 기계적 고체 기판 -5,6-의 존재를 검출한다. 이 기능은 가능성이 표면 식민지 및 감염 5,7 트리거링에 도움이됩니다. 결과적으로, 모터의 표면과 동수 신호를 감지하여 그에 메커니즘의 중요성 8,9이다.

편모 모터는 쉽게 flagell를 테 더링으로 공부하실 수 있습니다UM 기판에 세포 회전을 관찰. 이러한 테 더링이 먼저 안티 - 후크 항체 (10)와 유리 기판에 polyhook의 대장균에서 돌연변이 성공적으로 연결된 후크와 협력 실버 사이먼에 의해 달성되었다. 속박 세포 분석은 화학 자극의 다양한 모터 스위치의 반응을 연구 연구 할 수 있었다. 예를 들어, Segall와 동료들은 화학적으로 이온 영동 피펫의 도움으로 닿는 세포를 자극. CW 바이어스에 해당 변경 화성 네트워크 (11, 12)에서 적응의 반응 속도를 측정하기 위해 그들을 사용 (시간 모터의 비율은 CW, 시계 방향으로 회전). 닿는 세포 분석은 스위치 응답을 공부에 효과적이지만, 단지 점성로드 (13)의 제한된 범위에서 모터 역학에 대한 통찰력을 제공 할 수 있었다. 이 문제를 극복하기 위해 류와 동료들은 표면에 붙어있는 세포 스텁 필라멘트 구면 라텍스 비즈 닿는. 비드이었다다음 약한 광 트랩 (14) 백 초점 간섭을 사용하여 추적. 서로 다른 크기의 구슬과 협력함으로써, 연구진은 부하의 훨씬 넓은 범위에 걸쳐 모터를 연구 할 수있다. 이 분석법 후에 레이저 암시 야 조명과 결합 된 광전자 계 비드 추적 기술을 개발 위안 베르그 향상했다. 외부 점성 저항이 회전 (15, 16)에 내부 점성 저항에 비해 낮았다 너무 작았 닿는 골드 나노 비드 (~ 60 ㎚)의 그들의 방법을 사용 추적. 이 대장균에서 달성 가능한 최대 속도 (~ 300 Hz에서)의 측정을했다. V.의 alginolyticus에서 유사한 비드 분석은 중간 점성 부하 (~ 700 Hz에서) (17)의 회전 속도를 측정 할 수 있었다. (제로로드에서 가까운 매점에) 점성 부하의 전체 가능한 범위에서 모터 반응의 측정을 가능하게함으로써, 비드 분석은 t을 이해하는 중요한 생물 리 학적 도구를 제공orque 생성 프로세스 (18, 19).

최근에, 우리는 각각의 모터 6 정밀 기계적인 자극을 적용 할 수있게 광 핀셋을 포함하도록 위안 - 버그 분석을 수정했습니다. 그들은 점성 부하의 변화에 ​​응답하여 개조 -이 기술을 이용하여, 모터 회전 힘 발전기 동적 mechanosensors이다 것으로 나타났다. 이 메커니즘 불분명 남아 있지만 이러한 하중 감지가 진을 치고 박테리아로 세포 분화를 유발하는 것이 가능하다. 직접적인 증거는 부족하지만 다른 종의 편모 모터는,도 20 mechanosensitive 것으로도 보인다. 여기, 우리는 편모 필라멘트 (15)에 닿는 라텍스 구슬의 회전을 추적하기위한 광전자 기반 (PMT) 접근 방식에 대해 설명합니다. 이 실시간으로 긴 경질 위에 단일 비드를 추적 비교적 간단하기 때문에 초고속 카메라 추적 비교에서, 광전자 - 설치 유리한TIONS. 때문에 환경 자극 (21)에 편모 모터 단지에 리모델링 긴 시간을 공부 할 때 특히 유용합니다. 구체적으로는 E. coli에 대한 우리 상세히 프로토콜이지만, 그들은 용이하게 다른 종 편모 모터 공부하도록 할 수있다.

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프로토콜

1. 셀 준비

  1. 10 mL의 신선한 TB 100 희석 : 1에 접종 한 다음 트립 톤 국물 (TB, 1 % 펩톤, 0.5 % 염화나트륨)에 대립 유전자 15, 22 끈적 끈적한 플릭를 들고 원하는 균주의 야간 문화를 성장. OD 600 = 0.5까지 진탕 배양기에서 33 ° C에서 문화를 성장.
  2. 1,500 XG에서 세포 펠렛 5-7 분, 재 분산 펠렛 적극적으로 필터 살균 운동 버퍼의 10 ㎖의 (MB를 10 mM의 인산 완충액 : 0.05-0.06 M 염화나트륨, 10-4 M EDTA, 1 μm의 메티오닌, pH가 7.0).
  3. 단계를 반복 1.2 두 번 더 1 ML의 MB의 마지막 펠릿을 재 분산.
  4. (- 12cm 길이, 0.58 mm 내경 7) 폴리에틸렌 튜브로 연결된 21 ~ 23 게이지 어댑터와 함께 두 주사기 사이에 앞뒤로 ~ 75 번 전달하여 정지 전단. 45 초 - (30) 전단의 총 시간을 제한합니다.
  5. 5-7 분 동안 1,500 XG에서 전단 된 세포를 원심 분리하여 다시 분산MB의 500 μL - 100 펠렛.

2. 슬라이드 준비

  1. 커버 슬립 현미경 슬라이드 사이에 두 개의 양면 접착 테이프를 개재하여 촬상 챔버를 준비한다. 화성 분석을 위해, MB, 화학적 자극의 교환을 가능하게하는 미세 유체 챔버를 사용합니다.
  2. 챔버에서 0.01 % 폴리 -L- 라이신 솔루션을 추가하고 5 분 후 부드럽게 MB와 표면 세척 (80-100 μL)를.
  3. 챔버 내로 세포 현탁액 40 μL의 추가, 유리 표면에 부착을위한 충분한 시간이 허용 (7-8 분). 다른 측면에서 여과지로 용액을 심지하면서 상기 챔버의 일측에 100 μL를 첨가하여 MB 떨어진 세포를 흐른다.
  4. 챔버로 라텍스 구슬 15 μL와 비즈를 정착 세포에 부착 할 충분한 시간 수 - 10 추가 (7-8 분). 구슬 떨어진 제거하는 단계 2.3에 설명 된대로 조심스럽게, MB의 100 μL 씻어. 비드 실리콘의 범위를 사용하여좋은 대비를 사용할 정도로 오랫동안 실험 ZES.

3. 비드 추적

  1. 현미경 스테이지에 샘플을 놓고 모터에 연결된 구슬 위해 표면을 검사합니다. 위상 현미경이 필요하지 않지만 관측을 만들기 위해 40X 위상 목적을 사용합니다. 또한, 너무 오래 충분한 대비가 명확하게 어두운 배경에 밝은 구슬을 구분하기 위해 유지되는 밝은 - 필드 이미징을 사용한다.
  2. 비드가 선택되면,도 1b에 도시 된 바와 같이 소정의 모서리에 비드를 위치 시키도록 측 방향으로 상기 스테이지를 이동. 같은 코너에 위치 구슬은 구슬의 회전 방향이 제대로 알려져 있는지 확인합니다. 이상적인 비드 궤도는 대략 원형이지만, 타원형 궤도가 허용됩니다.
  3. 에일리어싱과 연관된 에러를 방지하기 위해 모터의 회전 주파수의 두 배 이상의 샘플링 주파수를 높게 유지. 본 연구에서는으로 회전 된 모터를 사용10 시간 이상 (500 Hz에서)했다 주파수 50 Hz의 시료는 평활 한 신호를 획득한다.

4. 데이터 분석

  1. 23 필요한 경우 센터는 아핀 변환과 궤적의 PMT 출력 전압과 정확한 타원의 크기를 조절합니다. 회전 속도 (17)를 결정하기 위해 전력 스펙트럼 분석을 사용한다.
  2. 극 각도 θ (t) = ATAN (Y (t) / X (t))를 결정합니다. 모터 속도의 변화를 확인하고 ω를 계산하여 시간이 지남에 따라 전환 figure-protocol-1 14.
  3. 모터 속도 데이터를 부드럽게 중앙값 필터를 사용한다. 이 전체 회전을 통해 필터 창 (23, 24)를 권장합니다.

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결과

광전자 증 배관 설치는 그림 1A에 표시됩니다. 이는 관심의 PMT가 비드에 의해 산란의 파장 범위에서 높은 감도를 갖는 것이 중요하다. 여기에서 사용되는 PMT가 가시 근적외선 범위에서 동작하고, 할로겐 광원에 의해 조명 비즈 산란광을 검출 할 수 있었다. 최적의 조명 조건 및 공급 전압을 하나의 설정마다 다를 것이다. 이 작업에 사용되는 설정하는 PMT 이득 ~ 들어 4월 10일에서 5월 10일까지 충분히 입증했다. 각각의 광전자는 광전자 앞에 위치하는 3 × 1mm 슬릿 제외 덮었다. 슬릿 광은 광전자 증 배관을 입력 할 수있는 세포 샘플의 영역을 제한하고,이 슬릿은 서로 직교한다. 회전 비드 올바른 위치 (도 1b)에 위치하는 경우, 광전자 증 증가 들어오는 빛의 양이 비드 온다그것의 원형 경로로보기 및 감소에 떨어져보기에서 그것을합니다. 정현...

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토론

테더 비드 추적 모터 토크의 정확한 추정을 용이하게하기 위해, 다음과 같은 정보가 검토되어야한다. flagellated 세포 이러한 측정을 수행 할 때, 전단은 중요한 단계입니다. 전단시켜 상기 모터의 점성 부하가 비드에 주로 기인하고 10 %의 오차 (16)에서 추정 될 수 있도록, 단순한 스터브로 편모 필라멘트를 감소시킨다. 양털 깎기도 밀접하게 분산 기행 (<비드 직경 14)와 원형 궤적을 찾는 기회를 향상시킨다. 추적 및 점성 드래그를 계산할뿐만 아니라 열악한 신호 대 잡음비의 결과에 오류를 화합물 제멋대로 궤적 부적절한 전단 결과. 오실로스코프의 사용은 이러한 데이터를 신속하게 제거 할 수 있습니다. 편모 필라멘트의 생체 역학적 특성은 종에 따라 다양 할 것으로 예상되기 때문에, 전단 방법 가능성 t에 충분한 전단력을 보장하도록 구성 될 필요그는 관심의 박테리아. 셔링과 연관된 에러를 감소시키는 효과적인 방법은 필라멘트 단백질을 인코딩하는 유전자를 결여 세포에서 작동한다. ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 Howard Berg에게 구슬 추적 현미경/광전자 증배관을 기증한 것에 대해 감사를, 기금에 대해 Texas A&M Engineering Experiment Station에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
폴리-L-라이신 용액(0.1%)시그마-알드리치P8920
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US 폴리비드 마이크로스피어Polysciences, Inc.7307http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
1 mL 루어 슬립 팁 주사기Exel Int.26048http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic Luer-Stub 어댑터 23-게이지Becton, Dickinson and Company427565http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
폴리에틸렌 튜빙Harvard Apparatus59-8325http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
광전자 증배관 튜브HamamatsuR7400U-20스펙트럼 응답 범위는 300에서 920 nm, 피크 파장은 630 nm,  0.78 ns 응답 시간 
http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3 x 1 mm 정밀 슬릿Edmund OpticsNT39-908광전자 증배관에 서로 직각으로 장착된 2개의 슬릿
오실로스코프TektronixTBS 1032B대체 브랜드를 사용할 수 있습니다. 디지털 오실로스코프, TBS 1000B 시리즈, 2 아날로그, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts 
http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
8극 LP/HP 필터Krohn-Hite3384대체 브랜드를 사용할 수 있습니다. 0.1Hz에서 200kHz 사이의 주파수 범위를 사용하는 것이 좋습니다.    
http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Optiphot 현미경NikonNA모든 직립 또는 반전 위상 현미경을 사용할 수 있습니다.
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) Cube BeamsplitterThorLabsBS013

참고문헌

  1. Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
  2. Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
  3. Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
  4. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
  5. McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
  6. Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
  7. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
  8. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
  9. Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
  10. Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
  11. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  12. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).
  13. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  14. Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
  15. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  16. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
  17. Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
  18. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  19. Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
  20. Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
  21. Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. Response thresholds in bacterial chemotaxis. Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).
  22. Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
  23. Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
  24. Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
  25. Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
  26. Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).

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