조직 공학 및 질병 조사에있는 사용을위한 소아 인간의 식도 상피 세포의 조건부 재 프로그래밍

요약

조건부 재 프로그래밍을 이용하여 인간의 소아 식도 상피 세포의 확장 결함이나 부상을 치료 및 치료 심사 분석을위한 저수지 역할을하는자가 이식을 위해 식도 구조 엔지니어링에 이용 될 수있는 셀의 환자 별 인구와 수사관을 제공합니다.

초록

조직 공학 및 질병 조사에 사용하기 위해 배양에서 환자 특이적 세포를 식별하고 확장하는 것은 매우 어려울 수 있습니다. 관심 세포 유형을 도출하기 위해 다양한 유형의 줄기 세포를 활용하는 것은 종종 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 매우 비효율적입니다. 또한 이 세포 소스를 사용하기 전에 원치 않는 세포 유형을 제거해야 하며, 이를 위해서는 프로세스의 또 다른 단계가 필요합니다. 식도 구조의 내강을 설계하거나 식도 질환 치료를 위한 치료 방법을 스크리닝하기에 충분한 식도 상피 세포를 얻기 위해서는 유전자 발현이나 표현형을 변경하지 않고 천연 식도 상피 세포를 확장해야 합니다. 식도 상피 조직의 조건부 재프로그래밍은 환자 특이적 식도 상피 세포를 확장하기 위한 유망한 접근 방식을 제공합니다. 또한, 이러한 세포는 분류하거나 정제할 필요가 없으며 조건부 재프로그래밍 배양에서 제거한 후 성숙한 상피 상태로 돌아갑니다. 이 기술은 많은 암 스크리닝 연구에서 설명되었으며 여러 계대에 걸쳐 이러한 세포를 무기한 확장할 수 있습니다. 식도 선별 검사를 수행할 수 있는 능력은 환자의 증상을 유발하는 유발 메커니즘을 식별하여 호산구성 식도염과 같은 소아 식도 질환의 치료에 혁명을 일으키는 데 도움이 될 것입니다. 선천적 결함, 질병 또는 식도 부상으로 고통받는 환자의 경우, 이 세포 공급원은 영향을 받은 부위를 복구하거나 대체하기 위해 이식용 합성 구조물을 파종하는 수단으로 사용될 수 있습니다.

서론

식도 조직 공학 및 호산 구성 식도염 (삼킴)는 지난 10 년간 많은 실험실에서 연구의 초점이되고있다. 이러한 식도 폐쇄증과 같은 선천성 결함, ¹ 먹을 수 없다는 선도 식도의 불완전 개발 결과 약 1 4,000에서 출산에 볼 수 있습니다. 호산구 식도염의 발생률과 유병률은 1993 년 질병 엔티티의 식별이 호산구 식도염의 빈도는 10 인 - 연간 / 100,000 0.7에서 변화와 유병률은 43 / 10 만 ² 0.2에서 원거리 이후로 증가하고있다. 롱갭 식도 폐쇄증의 치료에 대한 새로운 매력적인 접근법 수술은 환자 자신의 세포를 이용하여 이식을위한 조직 구조를 생성하는 것으로 이루어진다. 합성 비계와 함께이 세포들은 면역 억제를 필요로하지 않는자가 구조를 생성합니다. 일부 그룹은 이미 우리를 조사하기 시작했다^{7 -} 식도 조직 공학 ^(3)뿐만 아니라 고유의 식도 상피 세포의 사용과 같은 줄기 세포의 예는 점막 ^4를 다시 채울. 소아 환자의 식도에 존재하는 질병은 종종 진단이나 간섭없이 공부하기 어렵다. 또한, 사용 동물 모델 또는 시험 관내에서 정확한 질병의 발병 또는 환자 별 차이 ^(8)을 포함하지 않는 호산구 식도염 등 소아 질환 세포주 모델을 불멸. 따라서, 위해 체외에서 환자의 질병 과정을 연구 할 수있는 기능은 특정 질병 유발 항원을 식별하는 기본 메커니즘을 평가하고 새로운 일 및 환자 치료에 도움이되는 정보와 임상의를 제공 할 것이다 약물 치료를 조사합니다.

tissu에서 사용하기 위해 제안 된 많은 환자는자가 또는 특정 세포 유형이 있었다전자 공학 및 인간 질병의 발병 기전을 연구. 그러나, 이들 세포 유형의 일부 큰 지지체 시드 또는 시험 관내 연구에서 높은 처리량을 수행 할 특정 표현형의 충분한 세포를 생성하는 그들의 능력에 제한된다. 다 능성 또는 다 능성 줄기 세포의 사용은 많은 연구의 논의의 주제왔다 그러나, 이들 세포를 사용 제한 및 단점도 ^9를 설명 하였다. 인간 배아 줄기 세포의 사용은 매우 많은 논쟁 윤리적 문제를 제시한다. 가장 중요한 것은, 이러한 세포는 그들의 능성 상태 사전 거실 호스트 ^(10)로 전달을 구별하지 않는 경우, 종양과 유사한 기형 종을 형성한다. 또, 배아 줄기 세포의 사용은 환자의 특정되지 않을 것 및 동종 면역 반응 억제 ^(10)의 필요성을 유도 할 수있다. 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 그 수있는 만능 세포이다환자 자신의 세포로부터 유도 될 수있다. 피부 세포 등의 체세포, 통합 및 비 통합하는 다양한 기술을 사용하여 다 능성 상태로 유도 할 수있다. 이 세포는 조직 공학 또는 질병 연구를위한 환자 맞춤형 세포 소스 역할을합니다. 이들 세포에 원하지 않는 유전 물질의 통합은 여러 설명하고 서열하더라도 완전히 제거 iPSCs들이 ¹¹ 유도되었던 세포 유형 향해 후생 유전 학적 "메모리"보존 나타날 우려이다. 이식 ^{11 일} 전에 분화되지 않는 경우 상기 세포는 생체 내에서 기형 종을 형성한다. 많은 분화 프로토콜 그러나, 분화의 끝에서 생성 된 세포 유형이 균일 및 O 아니라는 것을주의하는 것이 중요 상피 계통 ^{(12, 13), (14)에} 집중 조사되었다할수 있답니다 관심의 세포 유형의 일부를 소유한다. 이것은 낮은 수율 및 목적하는 세포 유형을 정제 할 필요성을 초래한다. iPSCs 잠재적 환자 별 셀 소스이지만, 처리는 조직 공학 또는 질병 조사 중 하나에 대한 관심의 세포 유형은 매우 비효율적이다 얻었다.

폐 ¹⁵ 유 ^{16 17} 소장, 결장 ^(18), 방광 ⁽¹⁹⁾ 및 식도 ⁽²⁰⁾ : 인간 상피 세포가 성공적 포함한 인체에 질병 및 비 병변 조직 모두 다양한 분리되었다. 이는 일차 인간 세포 표현형 ^{(21), (22)이} 유지되는 통로 유한 수있는 것이 중요하다. 불행하게도,이 즉, 질병 조사 또는 설계 발판을 시드에 필요한 세포의 수주입 달성되지 않을 수 있습니다. 따라서, 새로운 기술은 여전히 ​​상피 표현형을 유지하면서 환자의 세포를 확대 할 필요가있다. 피더 세포와 ROCK 저해제를 이용하여 정상 및 암 상피 세포의 조건부 재 프로그래밍은 리우 등에 의해 2012 년에 설명했다. ^{2 3.} 이 기술은 조사 된 피더 세포, 암 억제제 및 조건부 프로그래밍 매체를 이용하여 전립선 및 유방암의 생검에서 얻은 암성 상피 세포를 확장하는 데에 이용 하였다. 목표는 약물 검사 등의 체외 분석을위한 충분한 세포를 생성하는 것이 었습니다. 이 기술은 높은 증식하는 줄기 또는 선조 같은 상태를 "리 프로그래밍"이 무기한 세포 상피 세포를 확대 할 수있다. 이들 세포가 아닌 종양이며 기형 종 ^{(23), (24)을} 형성하는 능력을 갖고 있지 않는 것이 입증되었다. 또한, 아니염색체 이상 또는 유전자 조작이 기술 ^{23, 24을} 사용 문화에 이러한 세포를 계대 후 참석했다. 가장 중요한 것은, 이들 세포는 주목 원시 세포 유형으로 분화 할 수있다. 따라서,이 기술은 불멸화 없이도 질환 조사 또는 조직 공학을위한 환자 별 상피 세포의 큰 저장 용기를 제공한다.

질병 과정을 연구하기 위해 특정 기관의 상피 조직을 얻기 때문에, 환자의 위험을 가능 종종 한정되지 항상. 식도 질환 또는 결함을 앓고있는 환자의 경우, 내시경 생검 검색이 해리 조건이 환자의 식도 점막 고유 부정 셀 소스를 제공하기 위해 재 프로그램 될 수있는 상피 조직을 얻기위한 최소 침습적 방법이다. 이것은 다음 체외 연구 허용상피 세포의 잠재적 치료제에 대한 질병 프로세스와 화면을 평가합니다. 크게 이러한 접근법으로부터 이익을 얻을 수 한 질병 과정 식도 ^(8)의 알레르기 질환과 같은 설명했지만 호산구 식도염이다. 알레르기 시험뿐만 아니라 치료 방법은 환자 자신의 상피 세포를 사용하여 시험 관내에서 평가 될 수 있고,이 데이터는 개별 치료 계획을 수립하기 위해 치료 의사에 전달 될 수있다. 소아 환자에서 내시경 생검을 얻기과 함께 조건부 프로그래밍의 기술은 모든 환자에서 무기한 정상 식도 상피 세포를 확장 할 수있는 기능을 제공합니다. 이 셀 소스 따라서 결함, 질병이나 외상에 대한 환자 맞춤형 수술 옵션을 제공하는 천연 또는 합성 비계와 함께 협력 할 수있다. 무기한 세포 수를 갖는 것은 완전히 시드 가지고 식도 구조 엔지니어링 도움이 될 것이다위해 식도 상피 세포와 루멘하면 나머지 세포 유형의 재생을 촉진하는 데 도움.

프로토콜

동의가 소아 환자의 부모 / 보호자로부터 및 기관 검토위원회 (IRB # 13-094)에 따라 얻은 후 식도 생검을 얻었다.

1. 살균 악기 및 젤라틴 솔루션

1. 오토 클레이브 겸자 면도날 및 오염을 방지하기 위해 조직을 처리하기 전에 위.
2. 0.1 % 젤라틴 용액을 200 mL로, 젤라틴 0.2 g에 증류수 200 ㎖를 조합. 압력솥 멋진 사용하기 전에.

2. 코팅 조직 배양 플레이트

1. 종래 셀 분리하는데 약 2 시간이, 조직 배양 접시 (100mm)를 커버하고, 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다 충분한 0.1 % 젤라틴을 추가한다.
   참고 :이 접시도 미리 만들어 사용하기 전에 배양기에서 유지 될 수있다.

3. 해리에 대한 효소 솔루션을 만들기

1. 약 세포 분리에 앞서 30 분, 밖으로 무게유리 병에 밀리그램 농도 당 단위를 기준으로 균형에 디스 파제의 10 대. 37 ° C의 물을 욕조에 10 ㎖ 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) 및 장소 15 ML 원뿔 튜브에 분말을 배치합니다.

4. 만들기 세포 배양 매체

1. F12의 35 ㎖ (햄의 중간), DMEM의 11.5 ㎖, L 글루타민 0.5 mL를 100 배 페니실린 / 스트렙토 마이신 0.5 ㎖, 2.5 ㎖의 : 멸균 원뿔 튜브에 다음 성분을 혼합, 조건부 재 프로그래밍 매체의 50 mL로한다 소 태아 혈청 (FBS), 인간 인슐린 250 μg의 인간 표피 성장 인자 (EGF)의 (500)의 NG.
2. , 3T3 매체의 500 mL로 FBS의 50 ㎖, 100 배 페니실린 / 스트렙토 마이신의 5 mL의 DMEM 500 mL를 L 글루타민 5 mL를 혼합합니다.
3. 각질 세포의 무 혈청 배지 500 mL로, EGF와 (미디어 제공) 소 뇌하수체 추출물 (BPE) 보조 식품을 해동. 기본 매체의 500 ㎖ 병에 보충제를 추가하고 10의 5 mL를 넣고0X 페니실린 / 스트렙토 마이신

피더 소스로 5. 배양 및 조사 3T3 세포

1. DMEM, 10 % FBS, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 2 mM L- 글루타민을 포함하고, 3T3 매체를 준비한다.
2. 문화 적어도 삼일 환자 샘플의 도착 전 조직 처리 T-75 플라스크에서 3T3 세포.
   1. 5 ㎖ 플라스크 당 0.25 % 트립신 - EDTA의 및 사용 3T3 세포가 5 분 동안 또는 가장 셀 때까지 37 ° C에서 부화 환자 샘플의 도착를 Trypsinize 직전이 떠있다
3. 반응을 정지 3T3 매체의 5 ML을 추가합니다. 세포 현탁액을 기음과 15 ML 원뿔 튜브에 전송할 수 있습니다. 300 X g에서 5 분 스핀.
4. 매체를 기음과 세포 계수를위한 트리 판 블루의 정의 된 볼륨 세포를 재현 탁. 죽은 세포를 제외 트리 판 블루 10 μL와 세포의 10 μL를 결합합니다. 세포 계수를위한 혈구에이 솔루션의 부하 10 μL.
   참고 :이 프로토하십시오COL, 조사 3T3 세포 접종 밀도는 100mm 플레이트 당 600,000 세포와 동일한 cm ² 당 10,900 세포이다.
5. 한 50㎖ 원추형 튜브에 3T3 배지 25 mL에 환자 샘플 재현 탁 당 100mm 플레이트 접시 3000 래드로 조사하는데 필요한 세포의 수를 나누어지는.
6. 다음 조사, 아래로 100mm 플레이트 당 5 ㎖에서 조건부 재 프로그래밍 배지에서 5 300 XG에 분,에 resuspend에 대한 스핀 세포.
7. 환자 세포의 도금 프로토콜의 뒷부분에서 발생 때까지 옆으로 튜브를 설정 (단계 7.6 참조).

6. 소아 식도 생검을 보존하고 운반, 취득

1. 15 ML 원뿔 튜브에 100 μg의 / ML의 primocin 완료 각질 세포의 무 혈청 배지 5 mL를 추가하고 얼음에 의료 시설로 가져온다.
   주 : 매체의이 튜브는 최대 2 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. TI의에서 약 8 식도 조직 검사를 구합니다나에게 다음과 같이 내시경의 분리 :
   1. 젖은 얼음에 100 μg의 / ML의 primocin 및 장소 완전한 각질 세포의 무 혈청 배지를 포함하는 15 ML 원뿔 여섯 조직 검사를 놓습니다.
   2. 젖은 얼음에 완충 포르말린과 장소의 5 mL에 하나의 조직 검사를 놓습니다.
   3. 최적의 절단 온도 화합물 cryomold 작은 생검 한 조직 검사를 놓습니다.
      1. 즉시 액체 질소에 배치 이소 펜탄의 비커에 넣고,이 금형을 놓습니다. 일단 냉동, 견본 가방에 cryomold을 배치하고, 스티로폼 용기에 드라이 아이스에 저장합니다.
3. 밀봉 가방 안에 다음 젖은 얼음을 포함하는 배송 상자에 중간 또는 포르말린에서 조직 검사를 포함하는 튜브를 놓습니다. 인감 및 생물 학적 레이블 상자에 레이블과 실험실로 운반 할 것.
   참고 : 드라이 아이스가 들어 컨테이너 및 냉동 조직 검사는 밀봉 생물 학적 레이블과 레이블이 붙어 있습니다.

7. 처리다운 스트림 문화 분석을위한 환자 조직

1. 실험실에 도착하면, 하류 단면 또는 RNA 추출을 위해 C의 냉동고 ° -80에 드라이 아이스에 냉동 생검을 전송합니다. 포르말린의 샘플을 놓습니다. 4 ° C 냉장고에 보관 하룻밤 해결 할 수 있습니다.
2. 300 XG에 남아있는 조직 검사를 스핀 다운, 그리고 매체를 대기음. 원추형 튜브 시일 디스 파제 용액 10 mL를 첨가하고 15 분 동안 수욕에서 37 ℃에서 배양 할 수 있습니다.
3. 배양 후, 300 × g으로의 조직 검사를 스핀 다운. 0.05 % 트립신 EDTA 5ml에 재현 탁하고 배지를 흡인 생검.
4. 100mm의 멸균 판에 조직 검사를 포함하는 트립신 EDTA의 5 mL를 전송하고 2 멸균 면도날 가능한 벌금을 사용하여 조직 검사를 말하다.
5. 새로운 15 ML 원뿔에 다진 조직 검사를 포함하는 트립신 EDTA의 5 mL를 전송합니다. 0.05 % 트립신 - EDTA의 추가 5 mL로 두 번 접시를 씻어 원추형에 추가튜브. 37 ° C의 물을 욕조에 10 분 동안 튜브를 품어.
6. 배양 후, 5 분 300 XG (1.4 RPM)에서 조직 검사를 스핀 다운 및 매체를 대기음. 원추형 튜브뿐만 아니라 조사 피더 세포를 포함하는 조건부 프로그래밍 매체의 5 ㎖ 조건부 프로그래밍 배지 5 ㎖를 추가한다 (단계 5.7 참조).
7. 조직 배양 접시에서 젤라틴을 흡입 한 후 세포 현탁액과 판의 10 ㎖에 ROCK 저해제 (1 μL / mL로)를 추가합니다. 37 ° C에서 품어.

8. 배양 및 확장 셀

1. 문화의 약 5 일 후, 다진-생검 조각을 포함하는 초기 매체를 대기음 5 mL의 멸균 PBS와 함께 접시에 2-3 번 헹군다. 10 μM에서 ROCK 저해제를 포함하는 판에 새로운 매체를 추가합니다.
2. 70 % 포화 상태에 도달하면, 세포를 확장. 접시에 0.05 % 트립신 - EDTA의 5 ㎖를 추가하고 37 ° C 배양기에서 일을 제거 이하 2.5 분을 품어전자 피더 세포. 그 배양 한 후, 트립신 EDTA를 기음과 PBS 5 mL로 접시를 씻어.
3. PBS를 대기음하고 판에 0.25 % 트립신 - EDTA 5 mL를 추가하고 5 ~ 10 분 동안이나 세포가 접시에서 느슨한 때까지 배양한다. 반응을 중지하고 50 ML 원뿔 관에 유체를 모두 전송하고 5 분 동안 300 XG에 스핀 다운 판에 매체의 동일한 금액을 추가합니다.
4. 조건부 프로그래밍 매체의 정의 부피 재현 탁 세포는 트리 판 블루 10 μL로 현탁액 10 μL를 혼합한다. 총 세포 수를 결정하는 혈구의 개수.
5. 세포를 확장 120 만 15 mL의 총 부피에 3T3 세포를 조사와 함께 150mm 판에 1 백만 인간의 식도 세포를 추가합니다. 10μM에서 신선한 ROCK 억제제를 추가하고 젤라틴 코팅 150mm 접시에 세포 현탁액을 추가합니다.

9. 동결 및 저장 인간의 식도 상피 세포

1. 매체를 동결하려면 10 % 추가조건부 프로그래밍 매체 DMSO. trypsinizing 및 계산 한 후, 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 고정하고 5 분 동안 300 XG에 스핀 다운 세포 나누어지는.
2. 매체를 기음과 cryovial 당 2 mL의 부피에 매체를 동결 추가합니다. 세포 현탁액을 균질되면, 미리 라벨링 cyrovials 10 ⁶ 세포 분취. 장기 액체 질소 저장에 튜브를 이동하기 전에 최소 24 시간 동안 -80 ° C에서 냉동 컨테이너의 장소.

결과

환자로부터 생검 식도 상피 세포를 단리의 주요 단계의 요약은도 1에 요약 하였다. 상피 세포의 콜로니는 약 4-5일에 형성되고 섬유 아세포의 피더 세포 (그림 2A)에 의해 포위됩니다. 이러한 식민지가 확장됨에 따라 그들은 더 큰 식민지 (그림 2B)를 형성하기 위해 다른 식민지로 병합합니다. 문화가 70 % 합류하게되면, 그들은 (그림 2C)를 확장 할 필요가있다. 섬유 아세포 전에 상피 세포를 제거하기 판에서 제거되는 것을 보장하기 위해, 0.05 % 트립신 EDTA는 피더를 제거하기 위해 최대 2.5 분 동안 사용됩니다. 피더의 부재는 2D 그림과 유사하게 나타납니다. 자기편 상피 세포를 0.25 % 트립신 - EDTA와 트립신 새로운 조사 피더 세포 (그림 2E)에

토론

환자로부터 생검 식도 상피 세포를 분리하고 확장하기 위해 가장 중요한 단계가있다 : 1) 적절히 최소 세포사와 생검 조직 해리; 2) 보장 ROCK 억제제마다 변화 매체에서 세포 배양 배지에 첨가되고; 3) 권장보다 더 피더 세포를 사용하지 마십시오 4) 깨끗한 무균 문화를 유지; 5) 합류에 도달하기 직전 통로 세포.

조건부 인해 프로그래밍 얻어 생검 표본에서 환자 - 관련 차이로는 성장 동역학, 표현형 여러 통로로 확장하는 능력의 차이를 예상하는 것이 합리적이다. 일반적으로, 4 식도 생검 세포 격리 각 환자로부터 얻을 수있다. 일단 해리, 우리는이 평균 통로 (3)에 의해 만 10 세포로 확장 일 0에서 약 300,000-600,000 세포를 그물. 상피 세포 라인에 대한 설명 조약돌 형태를 유사하게 나타납니다 형성 식민지의 형태 ^{25 (그림 2). 문화에 세포의 샘플은 유동 ...}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane	Sigma Aldrich	277258-1L
돼지 껍질의 젤라틴	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific
15 mL 원뿔형 튜브	Denville Scientific	C1017-p
완전한 각질 세포 무혈청 매체	Thermofisher Scientific	10724011
페니실린 스트렙토마이신	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
인슐린 솔루션	Sigma Aldrich	I9278-5ml
인간 표피 성장 인자 (EGF)	Peprotech	AF-100-15
ROCK 억제제 (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 중간	Thermofisher Scientific	11765054
소 태아 혈청	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0.05% 트립신-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25% 트립신-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100mm 접시	덴빌 Scientific	T1110-20
150mm 접시	Denville Scientific	T1115
50mL 원뿔	Denville Scientific	C1062-9
인산염 완충 식염수 정제	Fisher Scientific	BP2944-100
5 mL 피펫	Fisher Scientific	1367811D
10 mL 피펫	Fisher Scientific	1367811E
25 mL 피펫	Fisher Scientific	1367811
9" 파스퇴르 피펫	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 세포	ATCC	CRL1658