여기서, 마취된 돼지에서 대퇴사두근 표본을 채취하고 미토콘드리아를 차등 원심분리로 분리합니다. 그런 다음 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 I, II 및 IV의 호흡수를 고해상도 호흡 측정을 사용하여 결정합니다.
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이 논문에서
요약
초록
미토콘드리아는 세포 에너지 대사에 관여하며 산소를 사용하여 아데노신 삼인산(ATP) 형태의 에너지를 생성합니다. 저속 및 고속의 차등 원심분리는 일반적으로 조직과 배양된 세포에서 미토콘드리아를 분리하는 데 사용됩니다. 차등 원심분리로 얻은 미토콘드리아 조잡한 분획은 호흡 측정 측정에 사용됩니다. 차등 원심분리 기법은 소기관의 크기와 침전 속도에 따른 소기관의 분리를 기반으로 합니다. 미토콘드리아의 분리는 조직 채취 직후에 수행됩니다. 조직은 얼음처럼 차가운 균질화 매체에 담그고, 가위를 사용하여 다지고, 헐렁한 유봉이 있는 유리 균질화기에서 균질화됩니다. 차등 원심분리 기법은 효율적이고 빠르며 저렴하며 차등 원심분리로 얻은 미토콘드리아는 호흡 측정 분석에 충분히 순수합니다. 차등 원심분리를 기반으로 하는 분리된 미토콘드리아의 한계와 단점 중 일부는 균질화 및 분리 과정에서 미토콘드리아가 손상될 수 있다는 점과 미토콘드리아 분리를 위해 많은 양의 조직 생검 또는 배양된 세포가 필요하다는 것입니다.
서론
미토콘드리아 생물 에너지 학 및 호흡기 용량은 투과성이 세포 또는 섬유에서뿐만 아니라 고립 된 미토콘드리아에뿐만 아니라 공부하실 수 있습니다. 본 연구에서는 고해상도 호흡율 측정을위한 차등 원심 분리를 이용하여 그대로 골격근 미토콘드리아를 분리하는 프로토콜을 기술한다.
호흡율 위해 미토콘드리아 손상을 분리하기 위해, 조직을 균일화하고 미토콘드리아는 종래의 차등 원심 분리 방법에 의해 분리된다. 차동 원심 분리 방법은 순차적 회 원심에 처음 Pallade에 의해 도입 된 조직 균질 및 동료 거의 70 년 전 1의 (증가 속도의 직렬)을 기반으로합니다. 조직은 처음 가위를 사용하여 다진과 헐렁한 유봉과 유리 균질에서 기계적으로 균질화한다. 그 후 균질 저속 깨지지 조직을 포함하는 생성 된 펠릿 세포 원심 분리파편과 핵은 폐기된다. 그 후, 상등액을 고속으로 여러 번 원심 분리하여 농축 된 미토콘드리아 분획을 수집한다. 차등 원심 분리 방법의 장점은 미토콘드리아가있는 분리하기 : ⅰ) 상기 방법은 빠르며 미토콘드리아 (호흡 실험 최대한 빠른 같이 수행되어야한다) 1-1.5 시간 내에 분리 할 수있다; ⅱ)이 저렴하다; 및 ⅲ) 그것은 매우 효율적입니다 및 차등 원심 분리하여 얻은 미토콘드리아는 호흡율 ....
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프로토콜
사두근 근육 조직 검사는 미토콘드리아가 차등 원심 분리에 의해 분리되는에서 마취 돼지에서 가져온 것입니다. 돼지는 또 다른 실험 이후에 사용됩니다. 이 연구는 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 지침의 국립 연구소에 따라와 광저우 베른, 스위스의 동물 관리위원회의 승인을 수행한다.
1. 골격근의 균질화와 미토콘드리아 격리
- 소비세 마취 돼지 5-10g의 대퇴사 두근 근육 표본. 본 분석에서는 돼지의 골격 근육을 사용합니다. 이 프로토콜은 다른 종으로부터 미토콘드리아 분리하는데 사용될 수있다 (예를 들면, 래트, 마우스, 사람 등.).
참고 :이 단계는 수술에 대한 전문 지식과 의료 전문가에 의해 수행된다.- 근육 내 케타민 (20 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (2 밀리그램 / kg)으로 진정 돼지 마취 인트라로 유도되기 이전정맥 미다 졸람 (0.5 ㎎ / ㎏, 플러스 아트로핀 0.02 ㎎ / ㎏). 수술 중 연속 정맥 주사 프로포폴의 주입 (시간 당 4 ~ 8 ㎎ / ㎏)과 펜타닐 (시간 당 30 μg의 / kg)으로 마취를 유지한다.
- 즉시 빙냉 미토콘드리아 분리 완충액 20 ㎖ (표 ....
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결과
복잡한 I-따라 호흡
격리 미토콘드리아 복합체 I 의존적 호흡 레이트 (주 2, 3, 4)는 고해상도 호흡율 (도 1, 대표도)를 사용하여 결정된다. 미토콘드리아 복합체 I 기판 글루타메이트 말산은 ADP를 첨가하여 추가된다. 상태 2는 단독으로, 기판의 존재 하에서 산소 소비를 지칭한다. 상태 (3)은 기판 및 ADP의 존재하에 산소 소비를 지칭한다. 주 4 ADP 고갈 후 산소 소비를 의미한다. RCR은 ATP 생산에 대한 산소 소비량의 결합의 지표이며,도 1에 도시 된 바와 같이, ADP, 미토콘드리아 호흡 속도가 증가 즉시 (주 3 호흡)의 첨가시, 상태 3 및 상태 4의 비율로서 계산되며, 다음 수준의 매우 s의 (주 4 호흡)을 감소상태 (2)의 것과 imil.......
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토론
본 연구에서 우리는 고품질의 손상 및 고해상도 호흡율 기능성 연구에 사용할 수있는 차등 원심 분리에 의해 단단히 결합 골격근 미토콘드리아를 분리하는 프로토콜을 기술한다.
손상과 밀접하게 결합 미토콘드리아를 분리하기 위해, 본 프로토콜 내에서 고려되어야 할 몇 가지 한계점이있다. 골격 조직을 채취 후, 즉시 빙냉 미토콘드리아 차단 완충액에 침지한다. 모든 원심 분리 단계는 4 ° C에서 수행해야하며, 미토콘드리아 현탁액을 분리하는 동안 얼음에 항상 보관해야합니다. 분리 절차는 가능한 한 빨리 수행해야합니다. 균질는 청소 세제없이 원심 분리기 튜브에 원심 분리되어야한다. 프로 시저의 끝에서, 미토콘드리아 현탁액 농축 유지되어야하고 호흡율 직전에 희석 될 수있다. 호흡율 데이터는 초 당 pmol의 PE로 표현되기 때문에미토콘드리아 단백질 밀리그램의 R은 정확하게 분리 후의 미토콘드리아 단백질 농도를 측정하는 좋은 방법을 사용하는 것이 중요하다.
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 스위스 국립과학재단(Swiss National Science Foundation, Grant 32003B_127619)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma | A 4386 | 화학 |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | 화학, 에탄올 |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | 화학 물질 |
| ATP | Sigma | A 7699 | 화학 |
| BSA | Sigma | A 6003 | 화학 |
| EGTA | fluka | 3779 | 화학 물질 |
| 글루타메이트 | 시그마, | G 1626 | 화학 |
| Hepes | Sigma | H 7523 | 화학 |
| KCl | Merck | 1.04936 | 화학 |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | 화학 |
| K-락토바이오네이 | 시그마 | L 2398 | 화학 |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | 화학 |
| 모르폴리노프로판 설폰산 (MOPS) | Merck | 1.06129 | 화학 |
| O2k-코어: 옥시그래프-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | 고해상도 호흡 측정 기구 |
| 단백질 분해 효소, 박테리아 | Sigma | P 8038 | 화학 물질 |
| 아지드 나트륨 | 시그마 | S2002 | 화학 |
| 로테논 | 시그마 | R 8875 | 화학, 에탄올에 용해 |
| 숙시네이 | Sigma S | 2378 | 화학 |
| Schuett homogen-plus 반자동 균질화기 | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | 조직 균질화 장치 |
| Taurine | Sigma | T 8691 | 화학 |
| TMPD | Sigma | T 3134 | 화학 물질 |
참고문헌
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
- Sims, N. R.
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