대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

요약

Saccharomyces cerevisiae의 내인성 위치에서 히스톤 유전자의 돌연변이를 생성하는 전략이 제시됩니다.

초록

우리는 발아 효모 세포의 히스톤 유전자에서 표적 돌연변이를 생성하기 위한 PCR 및 상동 재조합 기반 시스템을 설명합니다. 그 결과로 생성된 돌연변이 대립유전자는 내인성 유전체 부위에 존재하며 절차 후 게놈에 외인성 DNA 염기서열이 남지 않습니다. 반수체 효모 세포에서 4개의 핵심 히스톤 단백질 각각은 고도의 상동 개방 판독 프레임(ORF)을 가진 2개의 비대립형질 유전자에 의해 암호화되기 때문에 특정 히스톤 단백질을 암호화하는 두 유전자 중 하나를 특이적으로 표적으로 하는 돌연변이 유발은 문제가 될 수 있습니다. 여기에서 설명하는 전략은 상동 재조합 단계를 위해 표적 유전자의 ORF 내부가 아닌 외부에서 염기서열을 활용함으로써 이 문제를 우회합니다. 이 시스템의 또 다른 특징은 상동 재조합 단계를 주도하는 DNA의 영역이 매우 광범위해질 수 있으므로 성공적인 통합 이벤트의 가능성을 높일 수 있다는 것입니다. 이러한 특징으로 인해 이 전략은 히스톤 유전자 돌연변이 유발에 특히 적합하지만 효모 게놈에 있는 다른 유전자의 돌연변이 유발에도 적용할 수 있습니다.

서론

네 개의 핵심 히스톤 단백질 H2A, H2B, H3 및 H4는 진핵 세포 염색체의 압축, 조직 및 기능에 중심 역할을한다. 이러한 히스톤 각각 두 세트의 궁극적 뉴 클레오 ^(1)의 형성의 결과로, 히스톤 옥타 자체 주변 DNA의 ~ 147 염기쌍의 감쌈 지시 분자의 스풀을 형성한다. 뉴 클레오 솜은 염색체 전체 유전자 전사의 조절과 euchromatin의 형성 및 이질 같은 염색체 기반 프로세스의 다양한 활성 참가자이며, 같은 과거 수십 년에 걸쳐 집중적 연구의 초점이되어왔다. 이러한 메커니즘은 히스톤 잔류의 번역 후 변형, ATP 의존적 인 뉴 클레오 리모델링 및 ATP 독립적 인 뉴 클레오 재구성을 포함 - 메커니즘의 수는있는 뉴 클레오는 특정 프로세스의 실행을 용이하게 할 수있는 방법으로 조작 할 수있는 기술되어있다조립 / 해체 ^{(2, 3).}

신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지는 진핵 생물에서 히스톤 함수의 이해에 특히 강력한 모델 생물이다. 이것은 주로 도메인 eukarya 걸쳐 히스톤 단백질의 진화 적 보전의 높은 유전 생화학 실험 다양 효모의 가공성에 기인 할 수....

프로토콜

참고 : 현장 히스톤 유전자 돌연변이에 대상에 대한 실험 전략 (그림 1에 요약) 여러 단계를 포함한다. 이러한 단계는 다음을 포함한다 : URA3 유전자 표적 히스톤 유전자 (1)의 교환, (2) 생성 및 원하는 돌연변이 (들)을 보유하는 프라이머를 사용하여 대상 히스톤 유전자의 두 부분 오버랩하는 조각에 해당하는 PCR 산물의 정제 (3 ) 두 부분 오버랩 조각의 융합 PCR은 플라스미드에 마커 (4) 전체 크기의 PCR 제품 및 백본 플라스미드 공동 변환 및 선택 (5) 화면 5-FOA 방지를위한, 통합을위한 전체 크기의 PCR 제품을 얻었다 형질 전환, (6) 5-FOA 내성 콜로니 정제 골격 플라스미드의 손실, 및 (7) 분자는 돌연변이 대립 유전자의 적절한 통합 분석으로 분석한다.

그림 1 : 신진 효모에서 히스톤 유전자의 현장 돌연변이 유발에 대상에 대한 전....

결과

우리는 시츄 돌연변이 전략 표적의 대표 예로서 글루탐산 (돌연변이 H3-R53E)에 아르기닌에서 위치 53에서의 치환을 보유하는 히스톤 H3 돌연변이 단백질을 표현한 hht2 대립 형질의 발생을 설명한다.

우리 HHT2 전체 ORF가 URA3 유전자 (프로토콜의 단계 1 참고)로 대체 된 균주를 생성. 이 균주 yAAD156 또한 세포가 히스티딘 영양 요 구성 될시키는 his3Δ200 대립 유전자를 항구. 프로토콜의 단계 2에 나타난 절차에 따라, 우리는 다음 HHT2 두 부분 오버랩하는 단편을 생성. 다음의 프라이머가 제 단편을 사용 하였다 : 정방향 프라이머 (OAD20) : 5 'GCGTTCATTATCGCCCAATGTG .......

토론

반수체 S. cerevisiae의 세포에서 4 개의 핵심 히스톤 단백질의 각각에 대한 코드가 구체적으로 돌연변이 유발을위한 두 개의 유전자 중 하나를 타겟팅하려는 연구자에 대한 도전을 나타낼 수있는 두 개의 비 대립 유전자 사이의 서열 상 동성의 높은 수준. 이전에 종종 의존 상기 Delitto PERFETTO, 부위 - 특이 적 유전자 (SSG) 돌연변이 유발, 클로닝없이 PCR 기반 대립 유전자 교환 방법 ^{5, 6, 7,뿐만} 아니라 최근 효모 CRISPR 기반 기술 ^(15)을 포함하여, 효모 돌연변이 유발 방법을 설명 원하는 유전자 재조합 사이트 또는 수리 기계 모집 표적 유전자의 ORF 내의 서열에 적어도 부분적으로 결국 최종 돌연변이 대립 유전자를 생성한다. 한편, 우리는 여기서 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 kb DNA 사다리 (DNA 표준)	New England BioLabs	N3232L
Agarose	Sigma	A5093-100G
붕산	Sigma	B0394-500G
dNTP 믹스(각 10mM)	ThermoFisher Scientific	R0192
EDTA 용액(0.5M, pH 8.0)	AmericanBio	AB00502-01000
에탄올(200프루프)	Fisher Scientific	16-100-824
에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨염 이수화물(EDTA)	Sigma	E4884-500G
리튬 아세테이트 이수화물	Sigma	L6883-250G
MyCycler Thermal Cycler	BioRad	170-9703
폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)	Sigma	P3640-1KG
PrimeSTAR HS DNA 중합효소(고충실도 DNA 중합효소)  및 5x 버퍼	Fisher Scientific	50-443-960
연어 정액 DNA 용액	ThermoFisher Scientific	15632-011
Sigma 7-9 (Tris base, 분말 형태)	Sigma	T1378-1KG
아세트산 나트륨 삼수화물	Sigma	236500-500G
Supra Sieve GPG Agarose (저온 아가로스)	AmericanBio	AB00985-00100
Taq 중합효소 및 10x 버퍼	New England BioLabs	M0273X
이쑤시개	Fisher Scientific	S67859
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	AmericanBio	AB14043-01000
A-D(+)-효	모 매체용	Fisher Scientific	AC170080025
한천	Fisher Scientific	DF0140-01-0	효모 매체
펩톤	Fisher Scientific	DF0118-07-2	YPD 매체
효모 추출물	Fisher Scientific	DF0127-17-9	YPD 매체
4-아미노벤조산	Sigma	A9878-100G	완전한 최소 드롭아웃 매체를 위해
완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한	Adenine	Sigma	A8626-100G
완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한	글리신 하이드로클로라이드	Sigma	G2879-100G
L-Alanine	Sigma	A7627-100G	는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다
L-아르기닌 모노하이드로클로라이드	시그마	A5131-100G	는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다
L-Asparagine monohydrate	Sigma	A8381-100G	는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다
L-아스파르트산 나트륨 소금 일수화물	Sigma	A6683-100G	는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma	C7880-100G	는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다
L-글루타민산 하이드로클로라이드	Sigma	G2128-100G	는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다
L-Glutamine	Sigma	G3126-100G	는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다
L-Histidine monohydrochloride monohydrate	Sigma	H8125-100G	는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다
L-이소류신	시그마	I2752-100G	는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다
L-Leucine	Sigma	L8000-100G	는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다
L-Lysine monohydrochloride	Sigma	L5626-100G	는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다.
L-메티오닌	시그마	M9625-100G	는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다
L-Phenylalanine	Sigma	P2126-100G	는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한
L-Proline	Sigma	P0380-100G	는 완전한 최소 드롭아웃 매체를 위한 것입니다
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5-플루오로로틱산 (5-FOA)	AmericanBio	AB04067-00005	for  5-FOA 매체

포도당 는  ;;