이 문서에서는 식별하고 세포 내 염색에 의해 쥐의 신장, 대동맥 림프절 내에 존재하는 기능 T 림프구의 하위 집합을 정량화 및 유동 세포 계측법하는 자세한 방법을 제공합니다. 안지오텐신 II 유발 된 고혈압의 모델은 설명 단계별, 절차 및 유동 세포 계측법의 기본 원리 및 세포 내 염색하기 위해 선택되었다.
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방법 논문
세포 내 염색 및 유동 세포 계측법은 고혈압의 모델에 쥐 대동맥, 신장 및 림프절에서 림프구 하위 집합을 식별하는
이 논문에서
요약
초록
T 림프구가 여러 심혈관 질환의 발병에 중요한 역할을 한다는 것은 이제 잘 알려져 있습니다1,2,3,4,5. 예를 들어, 우리 그룹의 연구에 따르면 고혈압은 실험적 고혈압이 발생하는 동안 혈관과 신장에 T 세포가 과도하게 축적되는 것과 관련이 있습니다6. 일단 이러한 조직에 들어가면 T 세포는 혈관 및 신장 기능에 영향을 미치는 여러 사이토카인을 생성하여 혈관 수축과 나트륨 및 수분 저류를 유발합니다1,2. T 세포가 어떻게 심혈관 및 신장 질환을 유발하는지 완전히 이해하려면 이러한 조직에 존재하는 특정 T 세포 하위 집합을 식별하고 정량화할 수 있는 것이 중요합니다. T cell subset은 표면 마커, 이들이 분비하는 사이토카인, 이들이 발현하는 전사 인자의 조합으로 정의됩니다. T 세포 집단의 복잡성으로 인해 유세포 분석 및 세포 내 염색은 조직에 존재하는 림프구의 표현형을 해부하는 데 매우 유용한 기술입니다. 여기에서는 안지오텐신 II 유도 고혈압 모델에서 쥐 신장, 대동맥 및 대동맥 배출 림프절에서 분리된 T 세포의 표면 및 세포 내 마커(사이토카인 및 전사 인자)를 식별하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 다음 단계가 자세히 설명되어 있습니다: 조직의 분리, 단세포 현탁액의 생성, 생체 외 자극, 고정, 투과화 및 염색. 또한 적절한 제어 및 적절한 게이팅 전략을 선택하는 것을 포함한 유세포 분석의 몇 가지 기본 원칙에 대해 논의합니다.
서론
최근의 증거는 적응성 면역계, 특히 T 림프구가 여러 1,2,3,4,5 심혈관 질환의 발달에서 중요한 역할을한다는 것을 보여준다. 예를 들어, 안지오텐신 II 고혈압의 모델에서는, 용기 및 마우스의 신장에서 T 세포의 축적이 6을 설명 하였다. 혈관 축적은 외막과 혈관 주위 지방에 주로있다. 신장에서, T 세포는 골수 및 신장 피질 모두에서 축적된다. 관련되는 서브 세트에 따라 이러한 T 세포는 혈관 및 신장 기능에 영향을 병리 현상을 초래할 수있는 다른 사이토킨을 야기 (맥 매스터 등. (6)에 의해 검토).
CD4 + T 헬퍼 림프구 여러 서브 세트들로 분할 될 수있다 : 그 기능 및 서명 사이토에 기초하여 T 헬퍼 1 (받은 Th1), TH2, TH9, Th17, Th22, T 조절 (TREG) 세포 및 T 모낭 헬퍼 (TFH) 세포kines 7. 마찬가지로, CD8 + 세포 독성 T 세포는 T에서, TC2, TC9 Tc17 또는 8로 분류 될 수있다. 합니다 (CD4 또는 CD8 T 세포 마커를 발현하지 않는, 즉 세포) 더블 부정적인 T 세포도 있습니다. 이들 세....
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프로토콜
밴더빌트 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회는 여기에 설명 된 절차를 승인했다. 마우스는 보관 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 마음에 든다고된다 (국립 아카데미를 누릅니다. 개정 2010).
쥐의 대동맥 배수 림프절, 신장 및 대동맥 1. 분리
- CO 2 흡입하여 쥐를 안락사. 70 % 에탄올로 가슴 스프레이 조심스럽게 피부와 마음을 노출 가위로 가슴 벽을 엽니 다.
- 혈관을 관류하기 우심방에 작은 절개를 수행하고 꾸준히 21 23 G 바늘을 사용하여 좌심실의 정점에 차가운 PBS (약 1 ㎖ / 초)의 적어도 10 ㎖를 주입. 모든 기관이 희게 될 때까지 관류. 핵심은 첫째 blanches. 간의 창백하면 관류 잘 수행되었음을 나타냅니다.
- 작은 집게와 미세 가위를 사용하여, 부드럽게, 절단 및 창자를 꺼내위장, 비장, 췌장과 간 더 나은 대동맥을 시각화합니다.
참고 :이 단계는 오염을 유도 할 수 위장관 손상으로 매우 정확하게 수행해야합니다. - 잘라 가위 각각의 폐를 제거합니다. 무 바늘 주사기를 사용하여 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)와 흉강을 씻어. 멸균 거즈를 사용하여 여분의 혈액과 액체를 제거합니다.
- 미세 해부 집게를 사용하여....
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결과
이 프로토콜은 허용에게 안지오텐신 II 유발 고혈압 모델 쥐의 신장, 대동맥 및 대동맥 림프절에서 분리 된 T 세포 표면과 세포 마커의 식별을 설명했다. 대표 결과는 다음과 같다.
도 1은 고혈압을 유도하는 안지오텐신 II로 넘치는 WT 마우스의 대동맥으로부터 제조 한 세포 현탁액 중의 T 세포 집단을 식별하는 데 사용되는 게이팅 전략을 보여준다. 유사한 전략은 신장, 림프절에 사용됩니다. 순방향 분산 영역 (FSC-A) 및 측면 스 캐터 지역 (SSC-A)의 전압은 백혈구 집단 (G1)를 검출하고, 이물질을 제외하도록 조정 하였다. 라이브 세포 (G2)는 태평양 파란색과 결합 된 생존 마커 음. 라이브 세포를 만에 게이트에 전달 살포 높이 (FSC-H) 및 전달 살포 지역 (FSC-A)에 문이 있었다단일 인구 (G3). 백혈구는.......
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토론
본원에 기술된 프로토콜은 쥐 신장, 대동맥 및 림프절 내에 존재하는 T 세포 서브세트를 적절하게 식별하도록 최적화되었습니다. 이 프로토콜은 B 림프구 및 선천성 면역 세포와 같은 다른 면역 세포 하위 집합을 검사하도록 쉽게 적응할 수 있으며 다른 조직 유형을 포함하도록 수정될 수 있습니다. 소화 단계는 중요하며 각 조직에 대해 수정 및 최적화되어야 합니다9. 장기간의 소화 단계나 부적절한 효소의 사용은 항원 발현의 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 마찬가지로, 불완전한 소화는 결과에 영향을 미쳐 양성 세포의 수를 줄일 수 있습니다. 또한, 세포 독성을 최소화하면서 최적의 자극을 허용하기 위해 각 세포 유형/사이토카인에 대해 생 체 외 자극 시간을 신중하게 조정해야 합니다.
유세포 분석과 결합된 세포내 염색은 혈액 및 조직의 세포 수준에서 면역 과정을 분석하는 가장 강력한 방법 중 하나이지만 이 기술에는 한계가 있습니다. 이러한 한계에는 심혈.......
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공개 사항
MSM은 길르앗 심장 혈관 과학에서 보조금에 의해 지원됩니다.
감사의 글
이 작품은 FL에 미국 심장 협회 (American Heart Association) 원정대 상 (16POST29950007), 건강 (NIH T32 HL069765) BLD, MA 살레에 미국 심장 협회 (American Heart Association) 원정대 상 (14POST20420025) 중 국립 연구소에서 훈련 보조금 및 NIH에 의해 지원되었다 K08 상 MSM에 (HL121671). MSM은 길르앗 과학, Inc.의 연구 보조금에 의해 지원됩니다
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
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| 1x 적혈구 용해 완충액 | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI 매체 1614 1x | Gibco | 11835-030 | |
| 칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | 밀도 구배 원심분리용 |
| GentleMACS™ C 튜브 | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS 해리기 장치 | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | 프로그램 사용 |
| SPLEEN_04 세포 활성화 칵테일 (Brefeldin A와 함께) | Biolegend | 423303 | |
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| IFNγ FITC (클론 XMG1.2) | BD 생명과학 | 557724 |
참고문헌
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al.
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재인쇄 및 허가
