방법 논문

세포 내 염색 및 유동 세포 계측법은 고혈압의 모델에 쥐 대동맥, 신장 및 림프절에서 림프구 하위 집합을 식별하는

DOI:

10.3791/55266

⸱

2017년 1월 28일

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Faculty of Pharmacy, Mansoura University

이 논문에서

요약

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이 문서에서는 식별하고 세포 내 염색에 의해 쥐의 신장, 대동맥 림프절 내에 존재하는 기능 T 림프구의 하위 집합을 정량화 및 유동 세포 계측법하는 자세한 방법을 제공합니다. 안지오텐신 II 유발 된 고혈압의 모델은 설명 단계별, 절차 및 유동 세포 계측법의 기본 원리 및 세포 내 염색하기 위해 선택되었다.

초록

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T 림프구가 여러 심혈관 질환의 발병에 중요한 역할을 한다는 것은 이제 잘 알려져 있습니다1,2,3,4,5. 예를 들어, 우리 그룹의 연구에 따르면 고혈압은 실험적 고혈압이 발생하는 동안 혈관과 신장에 T 세포가 과도하게 축적되는 것과 관련이 있습니다6. 일단 이러한 조직에 들어가면 T 세포는 혈관 및 신장 기능에 영향을 미치는 여러 사이토카인을 생성하여 혈관 수축과 나트륨 및 수분 저류를 유발합니다1,2. T 세포가 어떻게 심혈관 및 신장 질환을 유발하는지 완전히 이해하려면 이러한 조직에 존재하는 특정 T 세포 하위 집합을 식별하고 정량화할 수 있는 것이 중요합니다. T cell subset은 표면 마커, 이들이 분비하는 사이토카인, 이들이 발현하는 전사 인자의 조합으로 정의됩니다. T 세포 집단의 복잡성으로 인해 유세포 분석 및 세포 내 염색은 조직에 존재하는 림프구의 표현형을 해부하는 데 매우 유용한 기술입니다. 여기에서는 안지오텐신 II 유도 고혈압 모델에서 쥐 신장, 대동맥 및 대동맥 배출 림프절에서 분리된 T 세포의 표면 및 세포 내 마커(사이토카인 및 전사 인자)를 식별하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 다음 단계가 자세히 설명되어 있습니다: 조직의 분리, 단세포 현탁액의 생성, 생체 외 자극, 고정, 투과화 및 염색. 또한 적절한 제어 및 적절한 게이팅 전략을 선택하는 것을 포함한 유세포 분석의 몇 가지 기본 원칙에 대해 논의합니다.

서론

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최근의 증거는 적응성 면역계, 특히 T 림프구가 여러 1,2,3,4,5 심혈관 질환의 발달에서 중요한 역할을한다는 것을 보여준다. 예를 들어, 안지오텐신 II 고혈압의 모델에서는, 용기 및 마우스의 신장에서 T 세포의 축적이 6을 설명 하였다. 혈관 축적은 외막과 혈관 주위 지방에 주로있다. 신장에서, T 세포는 골수 및 신장 피질 모두에서 축적된다. 관련되는 서브 세트에 따라 이러한 T 세포는 혈관 및 신장 기능에 영향을 병리 현상을 초래할 수있는 다른 사이토킨을 야기 (맥 매스터 등. (6)에 의해 검토).

CD4 + T 헬퍼 림프구 여러 서브 세트들로 분할 될 수있다 : 그 기능 및 서명 사이토에 기초하여 T 헬퍼 1 (받은 Th1), TH2, TH9, Th17, Th22, T 조절 (TREG) 세포 및 T 모낭 헬퍼 (TFH) 세포kines 7. 마찬가지로, CD8 + 세포 독성 T 세포는 T에서, TC2, TC9 Tc17 또는 8로 분류 될 수있다. 합니다 (CD4 또는 CD8 T 세포 마커를 발현하지 않는, 즉 세포) 더블 부정적인 T 세포도 있습니다. 이들 세포의 서브 세트는 다른 감마 델타 T 세포 수용체 (대신 고전 알파 및 베타 수용체)를 갖고, 따라서 감마 델타 T 세포라고 칭한다. 표면 마커, 사이토 카인 및 전사 인자의 유동 세포 계측법에 의한 다 변수 분석은 이들 세포를 식별하기 위해 가장 좋은 방법을 구성한다. 이 방법은 광범위 면역학 분야에서 사용되지만, 그것은 덜 단단한 장기 및 심혈 관계 질환의 설정에 대하여 설명한다.

역사적으로, 조직에 임파구의 식별은 면역 또는 RT-PCR에 방법에 한정되었다. 면역 조직 화학 및 면역 형광은 INT의 항원의 조직 분포를 결정하는 강력한 방법이 있지만erest, 그들은 표현형과 관련된 부분 집합을 식별하는 데 불충분하다. RT-PCR 분석은 항원, 사이토 카인 또는 전사 인자의 mRNA의 발현을 검출하는 데 유용하면서 또한, 그것은 동시에 각각의 세포의 레벨에 여러 단백질의 검출을 허용하지 않는다.

사이토 카인 및 전사 인자를 검출하는 세포 염색 결합 특히 유동 세포의 출현은, 고형 장기 면역 세포 서브 세트의 단일 세포 수준에서의 식별 및 정량화 할 수있는 강력한 방법으로 연구자를 제공한다. 우리는 안지오텐신 II 유발 고혈압 모델 쥐의 신장, 대동맥 및 대동맥 림프절 내에 존재하는 주요 T 세포 하위 집합 유동 세포 계측법에 의해 식별하는 세포 내 염색 분석을 최적화했다. 높은 다시 A의 조직 소화, 생체 활성화, permeabilization, 표면 및 세포 내 염색 결과 : 각 단계의 최적화심혈관 및 신장 질환 모델에 적용 할 수있는 제조 가능한 분석.

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프로토콜

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밴더빌트 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회는 여기에 설명 된 절차를 승인했다. 마우스는 보관 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 마음에 든다고된다 (국립 아카데미를 누릅니다. 개정 2010).

쥐의 대동맥 배수 림프절, 신장 및 대동맥 1. 분리

  1. CO 2 흡입하여 쥐를 안락사. 70 % 에탄올로 가슴 스프레이 조심스럽게 피부와 마음을 노출 가위로 가슴 벽을 엽니 다.
  2. 혈관을 관류하기 우심방에 작은 절개를 수행하고 꾸준히 21 23 G 바늘을 사용하여 좌심실의 정점에 차가운 PBS (약 1 ㎖ / 초)의 적어도 10 ㎖를 주입. 모든 기관이 희게 될 때까지 관류. 핵심은 첫째 blanches. 간의 창백하면 관류 잘 수행되었음을 나타냅니다.
  3. 작은 집게와 미세 가위를 사용하여, 부드럽게, 절단 및 창자를 꺼내위장, 비장, 췌장과 간 더 나은 대동맥을 시각화합니다.
    참고 :이 단계는 오염을 유도 할 수 위장관 손상으로 매우 정확하게 수행해야합니다.
  4. 잘라 가위 각각의 폐를 제거합니다. 무 바늘 주사기를 사용하여 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)와 흉강을 씻어. 멸균 거즈를 사용하여 여분의 혈액과 액체를 제거합니다.
  5. 미세 해부 집게를 사용하여 복부 대동맥 림프절을 제거합니다. 캡슐을 파열하지 않도록합니다. 해부 포셉 각 림프절의 표면에 남아있는 지방을 제거합니다. 미세 가위로 두 개의 신장을 잘라.
  6. 잘, 곡선 가위로 전체 대동맥 (흉부 및 복부 대동맥)을 해부하다. 마음의 수준에서 시작하고 조심스럽게 식도 및 대동맥에 부착 된 주변 혈관 주위 지방을 유지해야하고 장골 분기의 수준에 이르기까지 척추의 해부.
    참고 : 대동맥의 추가 절개는 레모하기주변 구조 현미경 하에서 수행 될 수했습니다. 특히, 동맥 분기 (경동맥, 쇄골 하 동맥, 복강, 장간막, 신장 동맥)과 림프절을 제거합니다. 이 많은 염증 세포가 고혈압의 설정에있는 사이트이기 때문에 각 대동맥 주위 혈관 주위 지방의 일관된 층을 유지 마십시오. 차가운 PBS를 포함하는 별도의 튜브에서 각 조직을 놓습니다.

각 조직에서 단일 세포 현탁액의 2 세대

  1. 신장
    주 : 신장 기계적 해리 플러스 소화 효소를 결합하여 단일 세포 현탁액 내로 해리 될 수있다.
    1. (5 % 소 태아 혈청 (FBS) 보충) 1640 배지 (2 ㎎ / ㎖) 콜라게나 D를 첨가의 DNase I (100 μg의 / ㎖) RPMI에 의해 신장 분해 용액을 제조 하였다. 신장 샘플 당 10 ml의를 준비합니다.
    2. 신장 다이제스트 10㎖를 함유하는 분리 튜브에 두 신장 전송 집게를 사용하여이온 용액.
    3. 제조자의 지시에 따른 반자동 dissociator 장치를 이용하여 기계적 분리를 수행한다.
    4. 기계적 해리 후에 장치로부터 튜브를 분리하여 효소 소화를 수행한다. 연속 회전에서 37 ºC에서 20 분 동안 샘플을 품어. 즉시 5 % FBS로 보충 차가운 RPMI 1640 배지를 첨가하여 효소 소화를 멈춘다.
    5. 40 μm의 여과기를 통해 여과 한 후 50 ML 원뿔 튜브에 피펫으로 솔루션을 전송합니다. 1 ML의 주사기의 플런저로 눌러 떨어져 나머지 조직을 애타게. 세포 (500 XG, 8 분, 4 ºC)를 펠렛.
    6. 36 %의 밀도 구배 원심 분리 배지 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 15 ML 원뿔 관에 정지를 전송합니다. 조심스럽게 중단없이 3 ml의 36 % 세포 현탁액을 72 % 아래 밀도 구배 원심 분리 배지 3 ㎖을 추가한다. 원심 분리기 (브레이크없이 1,000 XG, 20 분, 4 ° C).
    7. 면역 세포는 인터페이스에 위치한다. 세포 파편을 포함하는 최상위 황색 층을 제거하고 차가운 PBS를 사용하여 15 ml의 볼륨을 불러옵니다. 고장 잘 구배를 흔들어. 셀 (300 XG, 8 분, 39 ° C)를 스핀 5 % FBS와 RPMI 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 트립 판 블루 배타를 이용하여 혈구의 생균 수를 계산.
  2. 대동맥
    1. 콜라게나 제 A (1 ㎎ / ㎖), 콜라게나 제 B (1 mg / ㎖)을 첨가하여 대동맥 소화 용액을 조제하고,의 DNase I (100 μg의 / ㎖) RPMI로 (5 % FBS로 보충) 1640.
    2. 미세 핀셋을 이용하여 대동맥 소화 용액 1 ㎖를 함유하는 2 ml의 튜브로 대동맥을 전송. 1 ml의 소화 용액 미세 가위로 아주 작은 조각으로 전체 대동맥을 말하다. 얼음에 보관하십시오. 연속 회전에서 37 ° C에서 30 분 동안 샘플을 품어.
    3. 조직 배양 접시에 용액을 옮기고 enzyma 정지5 % FBS와 차가운 RPMI의 5 배 부피를 첨가하여 TIC 소화.
    4. 40 μm의 여과기를 통해 여과 한 후 50 ML 원뿔 튜브에 피펫으로 솔루션을 전송합니다. 1 mL의 주사기 플런저로 눌러 단일 세포 현탁액으로 이격 나머지 조직 애타게. 여과기를 세척하고 세포 (300 XG, 8 분, 4 ºC)를 펠렛.
    5. 5 % FBS RPMI에 10 ㎖를 첨가하여 침전물을 세척 하였다. 셀 (300 XG, 8 분, 39 ° C)를 스핀 5 % FBS와 RPMI 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 트립 판 블루 배타를 이용하여 혈구의 생균 수를 계산.
  3. 대동맥 림프절
    1. 조직 배양 접시 (60mm X 15mm)에 40 μm의 여과기를 놓습니다. 스트레이너의 림프절을 놓고 1 ML의 주사기의 플런저로 눌러 단일 세포 현탁액에 떨어져 그들을 애타게. 5 % FBS와 RPMI 2 ㎖와 스트레이너를 플래시합니다. 접시에 세포를 수집합니다.
    2. 이전15 ㎖의 팔콘 튜브에 세포 펠렛 세포 (300 XG, 8 분, 4 ° C). 5 % FBS와 RPMI 500 μL에 펠렛을 재현 탁. 트립 판 블루 배타를 이용하여 혈구의 생균 수를 계산.

유동 세포 계측법에 의한 사이토 카인 탐지 3. 예 생체 자극

  1. 5 % FBS, 비 필수 아미노산는 0.1mm, 50 μM의 β 머 캅토 에탄올 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 RPMI : 세포 배양액을 준비한다.
  2. 원심 분리기 신장, 대동맥 림프절에서 얻은 각각의 세포 현탁액 (300 XG, 8 분, 4 ° C). 용액에 1 × 106 세포의 농도로 세포 배양 배지와 각 펠렛을 재현 탁.
  3. 세포 배양의 각 1 ml를 위해 (포르 볼 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA), 칼슘 이온 운반체에 이오 노마 이신을 함유하고, 골지체 억제제 Brefeldin A) 세포 활성화 칵테일 2 μl를 첨가하여 세포를 자극한다.
    참고 : 최종 농도PMA의 81 nm의, PMA와 Brefeldin A. 치료 이오 노마 이신의 1.33 μM, 5 ㎍ / ㎖의 이오 노마 이신은 사이토 카인을 생산하는 세포를 활성화 : 각 구성 요소들입니다. 사이토킨 검출 할 수있는 세포에 포획해야 단백질이 분비된다. Brefeldin A는 소포체와 골지체 장치에서 정상적으로 분비되는 단백질의 축적을 야기한다. 따라서, 여기에 설명 된 기술은 유동 세포 계측법에 의한 사이토 카인의 생산 림프구의 검출 가능성을 향상시킨다.
  4. 12 잘 2 백만 세포 (대동맥 또는 신장) 또는 24 웰 (림프절) 낮은 부착 판에 판 1. 3 시간 동안 37 ° C 가습 CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다.
    주 : 도금 된 세포의 수는 대조군 마우스로부터의 림프절에서 낮아질 수있다. 또한, 자극 시간은 경험적 연구 각 세포 집단 및 사이토킨에 대해 결정되어야한다. 대동맥, 신장, 림프절로부터 분리 된 T 세포의 경우는 3 내지 4 시간 동안 자극하는 것을 권장합니다. 더 긴 자극 w병 사이토 카인 분비를 증가시키고, CD3, CD4 및 CD8과 같은 여러 가지 T 세포 표면 마커의 추가의 하향 조절을 유도하지 않습니다. (심지어 3 ~ 4 시간 자극이 마커의 일부 하향 조절을 유도 않습니다.)

4. 표면 얼룩

  1. 폴리스티렌 FACS 튜브와 원심 분리기 (300 XG에, 8 분, 4 ° C)에 세포를 전송합니다. (FACS 완충액으로 두번 (칼슘 및 마그네슘 +없는 PBS 4 % FBS 및 2mM의 EDTA를 함유) 세포를 세척하고, 원하는 항체 패널의 개수 및 필요한 제어 튜브의 수에 따라 서로 다른 FACS 튜브에 동등 세포 현탁액을 나누어 아래 참조).
  2. 각 패널에 대한 보상을 수행하려면 각 조직 유형 및 항체 패널 흠 제어 튜브와 하나의 스테인드 튜브를 준비합니다. 또한, 모든 그러나 하나의 항체를 첨가하여 각각의 항체 패널 용 형광 마이너스 온 (FMO) 제어 튜브를 준비한다.
  3. FACS 2 ml의 각 튜브의 볼륨을 조절완충기. 원심 분리기는 세포 현탁액 (300 XG, 8 분, 4 ° C), 얼음에 10 분 동안 만 셀 당 항 CD16 / CD32 항체 0.5 μg의와 세포를 배양하여 상층 액과 블록 된 Fc 수용체를 제거합니다.
    참고 : CD16는 선호도가 낮은 IgG의 Fc 수용체 III FCR (III)이며, CD32는 FcRγ 쇄 II입니다. CD16 / CD32는 과립구, 비만 세포, 단핵구 / 대 식세포, 자연 살해 세포, B 세포, 수지상 세포 및 일부 활성화 성숙한 T 세포 상에 발현된다.
  4. 생존 염색을 수행 1X PBS의 1,000 μL에 1X PBS, 원심 분리기 (300 XG에, 8 분, 4 ° C) 및에 resuspend로 세포를 씻으십시오. 셀 - impermeant 아민 반응성 염료 (생존 얼룩) 1 μl를 추가합니다. 빛으로부터 보호 4 ° C에서 15 분 동안 품어.
  5. 배양하는 동안, FACS 버퍼의 적절한 볼륨 (표면 염색) 항체의 칵테일을 준비합니다. FACS 버퍼의 1-2 ㎖로 두 번 세포를 씻으, 원심 분리기 (300 XG에, 8 분, 4 ° C) 100 ㎕를 각 펠렛을 재현 탁항체 혼합물. 빛으로부터 보호 4 ° C에서 30 분 동안 품어.
    주 : 각 항체 유동 세포 계측법,이 도즈 적정 곡선을 수행함으로써 필요한 항체의 최적 량을 결정하는데 유용하다.
  6. 세포 (300 XG, 8 분, 4 ° C)를 FACS 버퍼 2 ㎖로 두 번 세포를 씻어 펠렛.

5. 고정, Permeabilization 및 세포 내 염색

  1. 제조업체의 지침에 따라 적절한 버퍼를 포함하는 고정 및 permeabilization 키트와 함께 세포 염색을 수행합니다. 수정 및 적절한 버퍼에이를 재현 탁하여 세포 Permeabilize 하시려면. 빛으로부터 보호 4 ° C에서 40 분 동안 샘플을 품어.
  2. 1 배의 permeabilization 1 ㎖를 추가하고 고정 투과성이 세포에 직접 버퍼 씻는다. 원심 분리기 (500 XG, 8 분, 4 ° C)과 뜨는을 제거합니다. 1X 세척 버퍼의 2 ㎖로 펠렛을 재현 탁.
  3. antib의 혼합물을 준비1X 세척 버퍼 (튜브 당 보통 100 μL)의 적절한 볼륨 (세포 내 염색만을위한) odies.
    주의 : 전술 한 바와 같이, 최적의 항체 농도는 패널의 각 항체에 대해 결정해야한다. 예를 들어, IL-17A 또는 IL-17F에 대한 항체, 우리 1:30의 희석 배수를 사용하지만, IFNγ와 T-내기에 대한 항체, 우리는 하나의 희석 배수 사용 : 100.
  4. 원심 분리기 세포 (500 XG, 8 분, 4 ° C) 및 항체 혼합물 100 ㎕ 각 펠렛을 재현 탁. 빛으로부터 보호 4 ° C에서 40 분 동안 품어.
  5. 세포 (500 XG, 8 분, 4 ° C)를 1 배 세척 버퍼 2 ㎖로 두 번 세포를 씻어 펠렛. 1X 세척 완충액 300 μL에 펠렛을 재현 탁하고 적절한 필터를 유세포 분석.
  6. 조직 샘플 당 세포의 총 수 정량을 위해 카운트 비드를 사용한다. 인수 이전에, 각각의 튜브에 구슬을 계산의 권장 볼륨 / 번호를 추가 할 수 있습니다.

6. 보상, 게이팅, 정규화, 및 팁

  1. 보상 및 게이팅
    1. 보상을위한 실행 흠 단일 스테인드 제어 튜브 스펙트럼 중복에 대한 조정합니다.
      주 : 보상 비드보다는 세포 보상 제어의 사용은 샘플에 대한 관심 또는 세포 집단의 항원 그 보상 어렵다 세포를 사용하여 낮은 수준으로 존재하는 경우에 필요하다. 탠덤 염료를 사용하는 경우 또한 노트의, 탠덤 염료가 많이-많은-과 매일 함께 다양하기 때문에 각 실험에 대한 보상을 준비하는 것이 좋습니다.
    2. 새로운 여러 가지 빛깔의 실험을 시작할 때 형광을 뺀 패널의 모든 형광 하나의 컨트롤 (FMOs)를 실행합니다.
      참고 : FMO 컨트롤 하나를 제외한 패널의 모든 항체를 포함하는 샘플입니다. 이러한 컨트롤에 제대로 adjus 생략 된 항체에 대한 부정적인 신호 대 양의 정확한 차별을 허용게이트에서 t. 이러한 제어는 발현이 표적 집단의 분리가 불량 할 때 또는 (예를 들면, 대상이 사이토 카인 또는 전사 인자이다) 낮을 때 특히 중요하다. 그들은 항원 특이성이없는 항체 이소 타입 및 형광 복합체에 대한 적절한 보상을 제공하기 때문에 FMO 컨트롤 항상 필요하지 않지만, 어떤 경우에는, 아이소 타입 컨트롤 곳에서 바람직 할 수있다.
    3. 기본 게이트를 설정 : 백혈구 인구를 검출하기 위해 앞으로 분산 형 지역 (FSC-A) 및 사이드 분산 형 지역 (SSC-A) 전압을 조정합니다.
    4. 죽은 세포를 제외합니다.
      참고 : 생존의 얼룩은 표면과 세포의 내부 모두에 존재하는 무료 아민과 반응. 세포를 살아 달리 (손상된 멤브레인) 사균 단백질 표지의 양을 증가 염료 세포질에 입력 할 수있다. 따라서, 죽은 세포는 쉽게 차별을 허용하는 살아있는 세포보다 밝은 것입니다. 라이브에 게이트세포.
      주 : 대동맥 및 신장에서 세포 현탁액의 생존 인해 추가 소화 단계 림프절로부터 세포 현탁액의 생존율보다 낮을 수있다.
    5. 플롯 앞으로 분산 형 지역 (FSC-A) [y 축] 및 전달 살포 높이 (FSC-H) x 축]. 단봉이 점 플롯에 대각선으로 나타납니다. 이 대각선에 게이트 이중선을 제외합니다. 이어서 SSC-A [Y 축] 및 CD45 [X 축] 플롯.
    6. 백혈구 CD45 + 집단은 쉽게 식별 될 수있다. 이 인구에 문입니다. 후속 집단은이 집단으로부터 식별 될 수있다.
  2. 세포 수의 정규화
    1. 계산 구슬 낮은 FSC 높은 SSC 발생 특성을 가지고있다. 50,000 비드 단일 세포 현탁액 300 ㎕를 첨가하는 경우에 다음과 같이 튜브는 당, 예를 들어, 어느 하나의 절대 수의 계산을위한 방정식은 세포 유형을 제공 :
      세포의 수 페이지어 관 = (흐름 cytometer에 의해 계산 구슬 50,000 / 수) 계산 세포의 X 번호.
      이 계산을 이용하여, 튜브 당 특정 세포 유형의 절대 값이 결정될 수있다. 각 장기로부터 발생 얼마나 많은 튜브 기준 장기 당 세포의 수를 산출 할 수있다.
      참고 : 프로토콜 동안 4 ° C에서 모든 세포 및 시약 보관하십시오. 이 세포를 손상시킬 수 있기 때문에 활발한 텍싱을 피하십시오. 세포 펠렛 최소한의 힘을 사용합니다. 이 세포 사멸을 침전 수 있으므로 FACS 튜브에 거품을 피한다. 펠릿 언제든지 건조하게하지 마십시오.

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결과

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이 프로토콜은 허용에게 안지오텐신 II 유발 고혈압 모델 쥐의 신장, 대동맥 및 대동맥 림프절에서 분리 된 T 세포 표면과 세포 마커의 식별을 설명했다. 대표 결과는 다음과 같다.

도 1은 고혈압을 유도하는 안지오텐신 II로 넘치는 WT 마우스의 대동맥으로부터 제조 한 세포 현탁액 중의 T 세포 집단을 식별하는 데 사용되는 게이팅 전략을 보여준다. 유사한 전략은 신장, 림프절에 사용됩니다. 순방향 분산 영역 (FSC-A) 및 측면 스 캐터 지역 (SSC-A)의 전압은 백혈구 집단 (G1)를 검출하고, 이물질을 제외하도록 조정 하였다. 라이브 세포 (G2)는 태평양 파란색과 결합 된 생존 마커 음. 라이브 세포를 만에 게이트에 전달 살포 높이 (FSC-H) 및 전달 살포 지역 (FSC-A)에 문이 있었다단일 인구 (G3). 백혈구는...

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토론

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본원에 기술된 프로토콜은 쥐 신장, 대동맥 및 림프절 내에 존재하는 T 세포 서브세트를 적절하게 식별하도록 최적화되었습니다. 이 프로토콜은 B 림프구 및 선천성 면역 세포와 같은 다른 면역 세포 하위 집합을 검사하도록 쉽게 적응할 수 있으며 다른 조직 유형을 포함하도록 수정될 수 있습니다. 소화 단계는 중요하며 각 조직에 대해 수정 및 최적화되어야 합니다9. 장기간의 소화 단계나 부적절한 효소의 사용은 항원 발현의 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 마찬가지로, 불완전한 소화는 결과에 영향을 미쳐 양성 세포의 수를 줄일 수 있습니다. 또한, 세포 독성을 최소화하면서 최적의 자극을 허용하기 위해 각 세포 유형/사이토카인에 대해 생 체 외 자극 시간을 신중하게 조정해야 합니다.

유세포 분석과 결합된 세포내 염색은 혈액 및 조직의 세포 수준에서 면역 과정을 분석하는 가장 강력한 방법 중 하나이지만 이 기술에는 한계가 있습니다. 이러한 한계에는 심혈...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSM은 길르앗 심장 혈관 과학에서 보조금에 의해 지원됩니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 FL에 미국 심장 협회 (American Heart Association) 원정대 상 (16POST29950007), 건강 (NIH T32 HL069765) BLD, MA 살레에 미국 심장 협회 (American Heart Association) 원정대 상 (14POST20420025) 중 국립 연구소에서 훈련 보조금 및 NIH에 의해 지원되었다 K08 상 MSM에 (HL121671). MSM은 길르앗 과학, Inc.의 연구 보조금에 의해 지원됩니다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
콜라겐 분해 효소 DROCHE11088882001
콜라겐 분해 효소 AROCHE10103586001
콜라겐 분해 효소 BROCHE11088815001
DnaseROCHE10104159001
1x 적혈구 용해 완충액eBioscience00-4333-57
RPMI 매체 1614 1xGibco11835-030
칼슘과 마그네슘이 없는 DPBSGibco14190-144
PercollGE Healthcare17-5445-02밀도 구배 원심분리용
GentleMACS™ C 튜브Miltenyi Biotec130-096-334
GentleMACS 해리기 장치Miltenyi Biotec130-093-235프로그램 사용
SPLEEN_04 세포 활성화 칵테일 (Brefeldin A와 함께)Biolegend423303
anti-CD16 / 32eBioscience14-0161-81희석 1 : 100
LIVE / DEAD fixable 바이올렛 사체 염색 키트Life TechnologiesL34955
전사 인자 버퍼 세트BD Pharmingen562725
OneComp eBeads eBioscience01-1111-42
123 counteBeads eBioscience01-1234-42
CD45 AmCyan (클론 30-F11)BioLegend103138
CD3 PerCP-Cy5.5 (클론 17A2)BioLegend100218
IL-17A FITC (클론 TC11-18H10.1)BioLegend506910
IL-17F APC (클론 9D3.1C8)BioLegend
CD4 APC-Cy7 (클론 GK1.5)BD Biosciences560181
CD8 APC (클론 53-67)eBioscience17-0081-82
T-bet PE-Cy7 (클론 4B10)BioLegend644823
IFNγ FITC (클론 XMG1.2)BD 생명과학557724
517004

참고문헌

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