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방법 논문

에 의해 쥐 림프구 라벨링

8.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55270

⸱

2017년 4월 29일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University Tübingen, 2Department of Dermatology, Eberhard Karls University Tübingen

이 논문에서

요약

형질 전환 쥐 T 세포 수용체에 결합하는 64의 Cu 변성 모노클로 날 항체의 제조에 이어 T 세포 생존, 기능, 표시 안정성과 세포 사멸 분석, 생체 내에서 방사성 표지하고, 적응 적기도 지연 형 과민 쥐에 옮기고 양전자 방출 단층 촬영 / 컴퓨터 단층 촬영 (PET / CT)에 의해 비 침습성 영상화 대한 반응.

초록

이 프로토콜은 구리 (64)의 제조 및 뮤린 림프구 세포 배양 및 세포 타겟팅 CU-64 수용체 항체에 따르는 단일 클론 항체 (항체)의 킬레이트 결합 / 방사성 표지를 나타낸다. PET / CT에 의한기도 지연 형 과민 반응 (DTHR)의 동물 모델에서 생체 세포와 방사성 추적 비 침습적 설명되는 시험 관내 평가.

구체적으로는, 킬레이트 1,4,7,10-1,4,7,10 테트라 아자 - 테트라 아세트산 (DOTA)와 항체의 결합을 나타낸다. 방사선 (64)의 Cu의 DOTA 공역의 방사성 표지 된 단클론 항체의 생산을하는 것은 다음을 설명한다. 다음에, 닭 오브 알부민 (코바) 특이 적 CD4 + 인터페론의 확장 (IFN)의 생산 -γ-T 헬퍼 세포 (COVA-TH1)과 코바-TH1 세포의 후속의 방사선은 도시된다. 다양한 체외 기술은 EF을 평가하기 위해 제시이러한 트리 판 블루 배제에 의한 세포 생존의 판정, 유동 세포 계측법 넥신 V와 아폽토시스에 대한 염색 및 IFN-γ 효소 면역 분석법에 의해 기능의 평가와 셀 64의 Cu-방사성 표지의 fects (ELISA) . 또한, 세포 내로 흡수하고 방사성 표지 안정성의 판정을 상세히 설명한다. 이 프로토콜은 상기 따라서, BALB / c 마우스에서 코바 유발 급성기도 DHTR의 유도가 포함되어기도 DTHR에 대한 동물 모델에서 세포 추적 연구를 수행하는 방법을 설명한다. 마지막으로, 이미지 획득, 재구성, 및 분석을 포함하는 강력 PET / CT 흐름이 제공된다.

후속 수용체 내재화와 CU-64 수용체 항체 타겟팅 방법은 셀 공통 표지 용 PET-트레이서에 비해 높은 안정성 및 특이성 감소 세포 독성, 낮은 유출 속도를 제공 예 64의 Cu-pyruvaldehyde 비스 (N4-methylthiosemicarbazone) (64 CU-PTSM). 마지막으로, 우리의 방법은 48 시간을위한 최적의 신호 대 백그라운드 비율 PET / CT 생체 내 세포 추적 비 침습적 수있다. 이러한 실험 방법은 내재화되는 막 결합 수용체와 동물 모델과 다른 종류의 세포에 전달 될 수있다.

서론

비 침습적 셀 추적은 생체 내에서 세포 기능, 이동과 원점을 모니터링하는 다용도 공구이다. 최근 세포 추적 연구는 재생 의학, 암 3, 4에 대한 입양 세포 치료에 염증이나 T 림프구에서자가 말초 백혈구의 맥락에서 중간 엽 1, 2 또는 골수 유래 줄기 세포 3에 초점을 맞추고있다. 행동의 사이트 및 세포 기반 치료의 기본 생물학적 원리의 해명은 엄청난 중요하다. CD8 + 세포 독성 T 림프구는 유전자 널리 금 표준으로 간주 하였다 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 또는 종양 침윤 림프구 (TILS)를 설계. 그러나, 종양 관련 항원 특이 TH1 세포는 <효과적인 대안 치료 옵션 4, 입증했다/ SUP> 5, 6, 7.

키 염증 플레이어, 기관 고유의자가 면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염 또는 기관지 천식), 암 면역 요법에 높은 관심의 세포, TH1 세포의 시간적 분포와 유도 패턴을 특성화하는 것이 중요하다. PET에 의한 비 침습적 생체 이미징 생체 원위치에서 세포의 이동 패턴을 조사하는 계량 고도로 민감한 방법 (8)을 제공하고, 염증, 알레르기, 감염 또는 종양 거부 9, 10, 11 중 T 세포의 작용과 반응 사이트.

임상 적으로, 인 옥신 (111)는 2- 데 옥시 -2- (18 동안, 염증 및 감염 (12)의 판정에 대한 백혈구 신티에 사용F) 플루오로 -D- 글루코스 (FDG-18 F)는 일반적으로 PET (3), 셀 (13)에 의해 추적 연구에 사용된다. 이 PET 추적자 하나의 큰 단점은, 그러나, 109.7 분의 핵종 18 F 이후 시점에서 촬상이 대체 세포 이동을 저해 게시 낮은 세포 내 안정성의 짧은 반감기이다. 세포 불안정하지만, 64의 Cu-PTSM 빈번하게하는 데 사용되는 PET 생체 내 세포 추적 연구에서 장기에 대해 비특이적 전지 (14), T 세포 생존에 최소화 해로운 효과 (15)에 라벨 (16) 기능을한다.

이 프로토콜은 또한 T 세포 수용체 (TCR) 특이 방사성 표지 된 항체를 이용하여 세포 생존 및 기능에 대한 불리한 영향을 줄이는 방법을 설명한다. 우선, 방사성 동위 원소 64의 Cu, 제 KJ1-26와 단클론 항체의 결합의 제조E DOTA 킬레이트 및 후속 CU-64 방사성 표지를 나타낸다. 제 2 단계에서, 상기 절연 및 DO11.10 공여 마우스의 코바-TH1 세포의 확장 및 64의 Cu-DOTA로드 공역 단클론 KJ1-26 (64 CU-DOTA-KJ1-26)와 방사성 표지를 상세히 설명한다. 흡수 값 및 도즈 교정과 방사능 유출과 각각 감마 계수에 의해 평가뿐만 아니라, IFN-γ ELISA가 제시와 트립 판 블루 배제 및 기능에 의한 세포 생존율의 64 CU-방사성 표지의 효과의 평가 . 생체 세포의 추적 비 침습적 들어, 대체 세포 전사 후에 PET / CT 의해 COVA 유발 급성기도 DTHR 및 이미지 획득의 마우스 모델의 도출을 설명한다.

또한,이 라벨 접근 방식은 다른 질병 모델, 다른 TCR도 또는 막 결합 수용체 또는 식 마르와 관심의 일반 세포와 쥐의 T 세포로 전송할 수 있습니다KERS 연속 막 (17)을 왕복 밑에.

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프로토콜

안전주의 사항 : 방사능을 처리 할 때, 2 인치 두께의 납 벽돌 뒤에 (64) 구리를 저장하고 활동을 운반하는 모든 선박에 대한 각각의 차폐를 사용합니다. 간접적으로 직접 손 접촉을 방지하고 방사성 물질에 대한 노출을 최소화하기 위해 차폐 소스를 처리하기 위해 적절한 도구를 사용하십시오. 항상 방사선 선량 모니터링 배지 및 개인 보호 장비를 착용하고 자신을 확인하고 오염의 작업 영역을 즉시 해결하기 위해. 종래의 방사성 물질이 사용되는 지역을 떠나기 잠재적 오염 개인 보호 장비를 버린다. 방사성 64 Cu를 충분히 처리하기 전에 (약 10 반감기 = 127 H)을 소멸 할 때까지 리드 실드 뒤에 전체 방사성 폐기물을 저장한다.

1. 64 구리 생산

참고 : 64 Cu를 64 니켈 (p, N) 64 구리 핵 반응은 페트를 사용을 통해 생성되는 방사성 동위 원소맥카티 동부 등의 변형 된 프로토콜에 따라 레이스 사이클로트론. (18).

  1. (64) 구리 생산 12.4 MeV까지의 양성자 빔을 6 시간 동안 30 μA로 백금 / 이리듐 판 (90/10)에 니켈 전기 도금 (64)을 조사한다.
  2. 전용 폴리 에테르 에테르 케톤 (PEEK) 챔버 내에서 100 ° C로 백금 / 이리듐 타겟을 가열하여 64 구리 / 64 니켈을 용해시키기 위해 20 분 동안 진한 HCl 2 ㎖로 배양한다.
  3. 진한 HCl의 다른 1 mL를 넣고 10 분 동안 배양한다.
  4. 아르곤의 스트림을 사용하는 염산을 증발시키고, 실온으로 냉각 챔버.
  5. 4 % 0.2 M HCl 및 96 % 메탄올 (v / v)의 3 mL로 챔버를 씻어 내고 있었다 이온 교환 컬럼이 용액 전송할 적어도 15 분 동안 메탄올에 4 % 0.2 M HCl로 프리 컨디셔닝. 플로우 스루 64 니켈을 재활용 할 수있다.
  6. 64 Cu를 4 %, 0.2 M 염산으로 I 열에 유지 씻어N 메탄올.
  7. , 수집 바이알에 70 % 64 구리 1.3 M의 HCl / 30 % 이소 프로필 알코올 (v / v)로 용출 아르곤 기류하에 용액을 증발시키고, 실온으로 냉각 바이알하자.
  8. 0.1 M의 HCl 140-210 μL 64 세제곱 녹인다.

DOTA 2. 항체 활용 후속 CU-64 방사성 표지

주 : DOTA 킬레이트 화제는 N- 히드 록시 숙신이 미드 (NHS) 에스테르 화학 의해 단클론 항체의 기능적 아미노기 연결되며 공액 이후 구리 64 19 방사성 표지된다.

  1. (8 ㎎ / ㎖로 KJ1-26 단클론의 농도를 조정하고 diafiltrate 1 mL의 항체 1.2 g 분자량하여 킬레이트 이온 교환 수지 / L로 처리 0.1 M 나 2 HPO 4의 pH 7.5에 대해 용액을 잘라 30kDa의 MWCO) 원심 분리 필터 장치. 버퍼 (14)의 3 mL로 후속 세척 단계를 적용한다. 최종 세척 단계 후,1 mL의 용액을 다시 농축시켰다. OD를 280 ㎚에서 측정하여 항체 농도를 정량화.
  2. 10 ㎎ / ㎖의 직전의 사용 농도로 초순수 또는 PCR 등급 물에 DOTA-NHS 용액을 제조 하였다. 바이알은 응축 물을 방지하기 위해 개구 전에 실온으로 조정하고, 신중 플라스틱 주걱을 사용 DOTA-NHS를 제거하자. 상기 diafiltrated KJ1-26 단클론 용액 8 mg의이 DOTA-NHS 용액 216 μL를 추가 잘 혼합하고, 텀블러 믹서에서 39 ° C에서 24 시간 동안 배양한다.
  3. 차단 분자량 (MWCO 30 kDa의) 원심 분리 필터 장치를 이용하여, 킬레이트 이온 교환 수지 1.2 g / ℓ로 처리 0.25 M 암모늄 아세테이트, pH가 7.0에 대해 DOTA-KJ1-26 단클론를 Diafiltrate. 7 세척 단계를 적용합니다. 1 ㎖의 최종 부피로 농축시키고 단클론 항체를 다시 280 ㎚에서 OD를 측정하여 단백질 농도를 측정한다.
  4. 방사성 표지 전 둘레 EXC 통해 PBS로 DOTA-KJ1-26 단클론의 버퍼 교환겔 여과 컬럼을 사용하여 크로마토 lusion. 이것은 또한 잠재적 인 작은 분자의 불순물을 제거합니다.
  5. 10 mM의 염산 100 MBq 내지 64의 CuCl 2 용액을 준비하여 10 배 PBS에 6-7로 pH를 조정한다. DOTA-KJ1-26 - 단클론 항체의 200 μg의 추가. 37 ° C에서 60 분 동안 인큐베이션.
  6. 품질 관리, 이동상으로서 0.1 M 구연산 나트륨 (PH 5)을 박층 크로마토 그래피를 수행하고자가 방사선에 의해 분석한다. 적어도 90 %의 활성은 항체에 결합되어야하고, 따라서, 출발 지점에서 검출된다. 약속 활성 용매 전면 시트 레이트 계 이동상과 줄무늬에 의해 킬레이트 화된다. 참고로, 64의 CuCl (2)의 사용이 권장된다.

3. 닭 오발 부민 특정 TH1 (COVA-TH1) 세포의 분리 및 확장

주 : TH1 세포의 배양 물 (17) 이전에 발표 된 연구 (16)에 따라 설명한다.

  1. 비장과 DO11.10 마우스에서 extraperitoneal 림프절 (림프절)를 분리합니다.
    1. 연방 규정에 따라 마우스를 희생. 70 % 에탄올로 소독하고 동물 비장 및 림프절을 제거하기위한 점착 테이프를 이용하여 그것을 고정하세요. 중간 절개를하고 옆으로 각 사이트에 당겨 복막에서 피부를 분리합니다.
    2. 자궁 경부, 축, 상완 및 서혜부 림프절을 찾습니다. 무딘 집게로 제거하고 1 % 소 태아 혈청 (FCS) / PBS 버퍼에 배치합니다.
    3. 복막을 열고 비장을 찾습니다. 췌장 결합 조직에서 비장을 분리하고, 1 % FCS / PBS 버퍼에 배치. 자세한 지침은 참조 (20, 21)을 참조하십시오.
  2. 한 50㎖로 40 ㎛의 필터를 통해 말하다 비장 및 림프절 주사기의 플런저를 사용하여 캡 튜브 스크류. 10 ㎖의 1 % FCS / PBS 완충액으로 필터를 헹군다.
  3. 5 분 동안 400 XG에서 원심 상청을 제거한다. SubsequenTLY, 실온에서 5 분 동안 암모늄, 염화 칼륨 (ACK) 용해 완충액 (공여 동물 당 1.5 ml)에 가하여 적혈구 세포 용해를 수행한다. (공여 동물 당) 8.5 mL의 1 % FCS / PBS 완충액을 추가한다.
  4. 5 분 동안 400 XG에서 세포를 원심 분리하고 상층 액을 제거한다. 5 분 동안 400 XG에, 10 ㎖의 1 % FCS / PBS 완충액에서 원심 세포를 세척하고 상등액을 제거한다.
  5. 자기 세포 분리, 1 % FCS / PBS 완충액으로 세포를 재현 탁하고 CD4 + 마이크로 비드를 추가한다. 버퍼 볼륨과 사용하는 CD4 + 마이크로 비즈의 양 제조업체의 지침을 참조하십시오.
  6. 4 ℃에서 20 분 동안 인큐베이션. 그런 다음, 1 % FCS를 추가 / 50 ㎖까지 PBS 완충액은 5 분 동안 400 XG에서 세포를 원심 분리하고 상층 액을 제거한다.
  7. 상업 자기 분리 컬럼 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 각각의 자석 스탠드를 사용하여 CD4 + T 세포의 분리를 계속합니다. 공동으로 용출 된 CD4 + T 세포를 조절합니다10 % 열 불 활성화 FCS 2.5 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % HEPES 완충액, 1 % MEM 아미노산, 1 % 나트륨 피루 베이트 및 0.2 % 2- 머 캅토 에탄올 및 저장과 둘 베코 변형 이글 배지에서 ncentration 10 개 6 세포 / ㎖ 이들 4 ° C에서.
  8. 항원 제시 세포 (APC를)을 제조하기 위해 50 ㎖의 스크류 캡 튜브에 열 방출을 수집. 5 분 동안 400 XG에서 열 방출을 원심 분리하고 상등액을 제거한다.
  9. 10 ㎍ / mL의 안티 - CD8 (클론 : 5367.2) 및 10 ㎍ / mL의 마우스 안티 쥐 단클론 항체 (MAR18.5) 및 1.5 mL의 토끼 보완 : 10 ㎍ / mL의 안티 - CD4 (Gk1.5 복제)를 추가합니다. 37 ° C에서 45 분 동안 인큐베이션.
  10. 5 분 동안 400 XG에서 세포를 원심 분리하고 상층 액을 3 mL의 배지를 추가한다. 총 30 Gy를 가진 γ 선이나 X 선 소스에 조사 장갑차. 이후, 5 × 106 세포 / ml의 농도로 장갑차를 조정한다.
  11. 96 웰 괞 찮아에 100 μL CD4 + T 세포와 장갑차 100 μL를 추가TE 함께 10 ㎍ / ML 코바 323-339 펩타이드 10 ㎍ / ㎖의 항 IL-4 항체, 0.3 μM의 올리고 뉴클레오티드 CPG1668 5 U / ㎖의 IL-2.
  12. 50 U / ㎖의 IL-2 초마다 하루를 추가합니다. (3) 후 4 - 일 24 웰 플레이트를 96- 웰 플레이트에서 세포를 옮긴다. 24 웰 플레이트에 한 웰에서 96 웰 플레이트에서 웰 3-5 결합. 비가 1 : 1에서 100 U / ㎖의 IL-2를 함유하는 배지에 추가.
  13. 2 ~ 3 일 후, 175cm 2 세포 배양 플라스크 (플라스크 당 1 × 48- 웰 플레이트)를 48- 웰 플레이트에서 세포를 옮긴다. : 1 비율로 1 중간으로 채 웁니다. 50 U / ㎖의 IL-2 초마다 하루를 추가합니다.
  14. 세포 밀도에 따라 세포 분열, 50 U / ㎖의 IL-2 격일 추가. 이러한 방식으로, 문화, 또 다른 10 일 동안 세포.

4. 코바-TH1 세포의 방사선

참고 : 64 CU-DOTA-KJ1-26 - 단클론 항체가 세포 내 방사성 표지를 사용하도록 배양 코바-TH1 세포에 적용됩니다.

  1. 코바-TH1의 CE 용LL의 방사성 표지는 도즈 교정을 이용하여 데드 볼륨없이 주사기에 방사성 표지 (64)의 Cu-DOTA-KJ1-26 단클론 37 MBq의 그릴. 37 MBq의 / ㎖ 용액을 수신하고 1 ㎖의 생리 식염수를 추가한다.
  2. 2 × 106 세포 / ㎖에서 매체 COVA-TH1 세포를 일시 중단하고, 48 웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 0.5 mL를 첨가.
  3. 새롭게 제조 된 37 MBq의 20 μL를 추가 / ㎖ 64 48 웰 플레이트의 각 웰에 CU-DOTA-KJ1-26 단클론 용액. 라벨의 최종 비는 520 μL 부피의 106 개 세포 당 0.7 MBq의 것이다. 30 분 동안 CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션하고 7.5 %.
  4. 배양 후, 각 웰에 신중 세포를 재현 탁하고, 50 ㎖로 48 웰 플레이트에서 세포 현탁액을 전송 튜브 캡 스크류. 세포의 손실을 최소화하기 위해, 예열 배지 각 웰을 씻어.
  5. 5 분 동안 400 XG에 코바-TH1 세포 현탁액을 원심 분리하여 상층 액을 제거하고 PBS를 가하여 데워진 10 세포를 재현 탁. 는 A를 제거셀 카운트하는 세포 현탁액 liquot. 세정 공정을 반복한다.
  6. 트리 판 블루 염색법으로 적절한 희석 가능한 COVA-TH1 세포 카운트.
  7. 5 × 107 세포에 세포 농도를 조절 / ㎖ PBS 200 μL에 107 개 세포를 복강 내 (IP) 주사.
  8. 반복 예 활동량, 1.4 MBq의 10 개 또는 106 세포 당 2.1 MBq의 증가에 코바-TH1 세포를 방사성 표지 4.3-4.5하는 단계.
    1. 106 개 세포 당 1.4 MBq의하여 세포를 방사성 표지 ~ 10 개, 106 세포 당 2.1 MBq의 방사성 표지에 대한 37 MBq의 / ㎖ 64 CU-DOTA-KJ1-26 단클론 용액 60 μL의 40 μL를 사용한다. MBq 내지 0.7, 1.4, 2.1 MBq 내지 64의 Cu-PTSM MBq의하여 4.3-4.7 단계를 수행하지만, 비교 연구 (17)을 3 시간으로 표시 시간을 증가시킨다.
    2. 활성의 최적 량을 결정하는 단계 5로 진행.

코바-TH1 세포에 방사성 표지의 영향의 시험 관내 평가 5.

주 : TH1 세포에 방사성 표지의 영향의 특성을 생존을 위해 트립 판 블루 배제 검정을 통해 수행되고, 아폽토시스 (16), (17)의 유도 기능을 평가 및 PE-넥신 V 염색에 대한 ELISA를 IFN은-γ. 세포 내 흡수 및 방사능 유출의 결정은 다음과 같다. 비교 64의 Cu-PTSM 표지 COVA-TH1 세포도 사용될 수있다.

  1. 트리 판 블루 배제하여 생존에 미치는 영향
    1. 2 × 106 세포 / ㎖의 농도로 0.7 MBq의 / 106 세포, 1.4 MBq의 / 106 세포 및 2.1 MBq의 / 106 세포를 방사선 표지 적어도 18 × 106 COVA-TH1 세포를 조정하여 5.1 단계를 수행한다. 각 활동 복용량 2-5.1.7. 비 radioacti를 사용하여KJ1-26 단클론는 대조군으로 COVA-TH1 세포 및 비 표지 COVA-TH1 세포를 표지했습니다.
    2. 24- 웰 플레이트의 웰 (9)에 전지 액 1 mL를 정확하게 취하여.
    3. 별도의 15 mL의 캡 튜브 초기 방사성 표지 후 3 시간 스크류 (3)에 웰 (3)의 내용을 수집.
    4. 세포의 손실을 최소화하고, 각각 15 mL의 배지를 추가 단계 5.1.3에서 캡 튜브 스크류 예열 매체와 비어 웰을 씻어.
    5. 5 분 동안 400 XG에 15 mL의 원심 분리 튜브 및 예열 배지 1 ㎖로 얻어진 세포 펠렛을 재현 탁.
    6. 각 15 ML 튜브에 대해 개별적으로 트리 판 블루에 가능한 죽은 두 세포를 계산하고 가능한 세포의 비율을 계산합니다.
    7. 반복 5.1.3-5.1.6 24 및 48 시간 후 64 CU-DOTA-KJ1-26 - 방사성 표지 된 항체를 단계.
  2. 기능에 미치는 영향 IFN-γ ELISA에 의해 결정
    참고 : IFN-γ productio입니다에 64 CU-DOTA-KJ1 26 단클론 항체 방사성 표지의 효과를 평가하기 위해N 기능 마커로서, 상업적 공급 업체로부터의 IFN-γ ELISA를 수행하고, 상기 세부 사항은도 17을 참조하는 참조.
    1. 96- 웰 플레이트에서 3 시간 포스트 64 0.7 MBq 내지 1.4 MBq 내지 2.1 MBq의 코바와-TH1 세포 CU-DOTA-KJ1-26의 방사성 표지에 배지 100 μL의 105 개 생존 세포를 분산. 컨트롤로 레이블이없는 비 방사성 KJ1-26 - 단클론 항체 표지 또는 64 CU-PTSM 표지 코바-TH1 세포를 사용합니다.
    2. / ㎖ 5 U / ㎖의 IL-2 및 5 × 5 장갑차 100 COVA 펩타이드 10 μg의 100 μL 배지에서 10 5 64 CU-DOTA-KJ1-26 단클론 표지 COVA-TH1 세포에서 IFN-γ의 생산을 자극 37 ° C에서 24 시간 동안 배지 7.5 % CO 2 μL. 또한 제어 코바 펩티드를 첨가하지 않고 다른 조건이 될 수있다.
    3. 제조업체의 지침에 따라 ELISA에 의해 상층 액을 분석합니다.
    4. 단계를 반복 5.2.2. 5.2.3. 라벨 수술 후 24 및 48 시간 째.
  3. 유동 세포 계측법에 대한 PE-넥신 V 염색에 의해 결정 아폽토시스 유도
    참고 : 세포막에 포스파티딜 세린 박람회 넥신 V 염색하기 전에 제조업체의 지침에 따라, 64 CU-DOTA-KJ1-26 - 단클론 항체 방사성 표지에 의해 세포 사멸 유도를 평가 유동 세포 계측법에 대한 시판 키트를 사용하여 세포 샘플을 준비하려면 .
    1. 3, 24 및 48 시간 후 64 COVA-TH1 세포 CU-DOTA-KJ1-26 단클론의 방사성 표지, 적어도 10 6 64 CU-DOTA-KJ1-26 단클론 표지 COVA-TH1 세포 얼룩 삼중에서 제조업체의 지침에 따라 넥신 V 키트는 다음 시간 내에 분석 할 수 있습니다. 컨트롤로 비 방사성 KJ1-26 - 단클론 항체 표지, 64 CU-PTSM 표지와 레이블이없는 코바-TH1 세포를 사용합니다. 자세한 내용은 17을 참조 할 참조하십시오.
  4. 통풍 관 및 유출
    참고 : 64 CU-DOTA-의 흡수세포 내로 KJ1-26 단클론은 도즈 교정 측정하고 방사능 유출이 γ 카운트 분석 0, 5, 24으로 측정 한 후, 방사성 표지를 48 시간.
    1. 64 CU-DOTA-KJ1-26 단클론 표지 COVA-TH1 세포 상등액 및 각 세척 단계 열 γ 카운트 튜브를 각각 준비한다.
    2. 6 64 10 직접 전송 방사성 표지 후에 열 γ 카운트 각 튜브에 배지 1 ㎖에 COVA-TH1 세포 CU-DOTA-KJ1-26 단클론 표지. 시간 포인트 (5), (24) 및 방사성 표지 후 48 시간마다, 37 ℃ 인큐베이터에서 24 웰 세포 배양 플레이트에 배지에서 적어도 10 7 64 CU-DOTA-KJ1-26 단클론 표지 COVA-TH1 세포를 유지 ° C 7.5 % CO 2.
    3. 5 분 동안 400 XG에서 γ 카운트 튜브를 원심 분리기와 열 새로운 γ 카운트 튜브로 상청액을 이전.
    4. 64 CU-DOTA-KJ1-26 단클론기로의 결합되지 않은 부분을 제거하는 1 개 ㎖의 매체에 한 번 세포를 씻어새로운 열 γ 카운트 튜브의 상등액을 수집 거라고.
    5. 코바-TH1 세포에 1 ㎖의 새로운 배지를 첨가하고 도즈 교정의 초기 흡수 값을 결정한다. 튜브는 CO 2, 37 ℃의 인큐베이터에 저장 및 7.5 % 수있다.
    6. 반복하여 제조사의 프로토콜에 따른 γ 카운터 모든 튜브를 5, 24 및 48 시간 후, 5.4.5 및 5.4.2 측정하는 단계. 방사성 붕괴에 대한 정량적 분석을 위해 해결하려면, 방사능의 정의 된 복용량 표준을 사용합니다.

6. 급성기도 DTHR OVA 유도

주 : 이주 역학과 염증 부위에 적응 적 전송 및 방사성 표지 COVA-TH1 세포 유도 패턴을 시각화 COVA 유도기도 DTHR-16, 17에 대한 동물 모델에서 정량화 될 것이다.

  1. 8주 된 BALB / c 마우스에 주입 150 μL 알루미늄 혼합하는 IPuminum 겔 / 50 μL COVA - 용액 (50 μL PBS 10 μg의)는 마우스 면역화.
  2. 접종 2 주 후에, IP 주입 100 밀리그램 / kg 케타민 5 밀리그램 / kg 자일 라진으로 마취 된 마우스. 그들의 뒤에 실험 쥐를 놓고 천천히 동물의 콧 구멍에 50 μL PBS에 용해 100 μg의의 코바을 피펫. 동물 드롭에 의한 솔루션 드롭을 흡입합니다.
  3. 24 시간 후 반복합니다. 강한기도 DTHR 입회식를 들어, 48 시간 후에 다시 반복합니다.
  4. 전사 COVA-TH1 세포의 특정 마이그레이션을 분석하기 위해, 대조군으로 칠면조 또는 꿩-OVA로기도-DTHR을 유도한다. 따라서, 반복은 각각 OVA 단백질을 사용하여 6.1-6.3 단계.

PET / CT를 사용하는 생체 내 이미징 7.

주 : 코바 DTHR-64의 Cu-DOTA-KJ1-26 단클론 표지 COVA-TH1 세포의 생체 내 이미징 질환 마우스 제어 한배 새끼 특정 원점 및 MI를 보여코바-TH1 세포의 연계 가능성 역학. 따라서, 정적 인 PET 스캔을 획득하고 해부학 CT 순차적 3, 24, 48 시간 후 세포 대체 전송을 스캔한다.

  1. 직접 방사성 표지 한 후, 200 μL의 107 개 세포를 복강 내 주사를 위해, 5 × 107 세포 / ㎖로 64 CU-DOTA-KJ1-26 단클론 표지 COVA-TH1 세포를 조절한다.
  2. 1 ml 주사기 및 30 게이지 바늘을 사용하여, 64 CU-DOTA-KJ1-26 단클론 표지 COVA-TH1 세포 현탁액 200 μL를 그리고 세포가 4 사이 COVA-DTHR-병든 동물 IP로 주입 제 5 번째의 젖꼭지. 방사능의 합계 주입량을 결정하기 전과 사출 후의 도즈 교정에 주사기를 측정한다.
  3. 온도 제어 마취 상자 : 100 % 산소 1.5 % 이소 플루 란, 마우스, 종래 원하는 흡수 시간은 10 분 마취 (0.7 L / min의 유량).
  4. 한편, 공동 등록을 촉진하기 위하여이미지 분석시 CT와 PET 영상의 마우스 침대 밑에 64 CU-DOTA-KJ1-26 단클론 용액 또는 유리 (64)의 CuCl 2 용액을 함유하는 유리 모세관을 고정한다.
    1. 따라서, 0.37 MBq의 / ㎖의 용액을 제조하고이 용액을 10 μL의 부피 유리 모세관을 채운다. 세포 유래 방사능 신호는 본질적으로 약하기 때문에, 마커가 쥐 세포 - 유래 된 신호와 간섭되지 않도록하는 활동의 많은 양을 사용하지 않는다.
  5. 수술 허용 오차에 도달 한 후, 뒷다리의 페달 철수 반사의 손실에 의해 지시 된 바와 같이, 마취를 유지하기 위해 적절한 배관 시스템에 장착 된 PET 및 CT 호환 작은 동물 침대에 마우스를 전송합니다.
  6. 면봉 및 수술 테이프를 사용하여 작은 동물 침대에 마우스를 고정. 눈의 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
  7. 의 PET 스캐너 마우스 침대를 전송할 수 focu과 시야의 중심폐에 S 및 350-650의 keV의 에너지 창 20 분간 정적 PET 검사를 획득.
  8. 중부 표준시 스캐너 마우스 침대를 전송합니다. 스카우트보기를 통해 폐에 시야를 중심으로. 박람회에서 350 ms에서 4 시간과 인자 비닝 함께 "공정과 촬영」모드로 360 ° 회전시 돌기 (360)를 통해 평면 CT 화상을 취득.

8. 이미지 분석

  1. 75 ㎛의 화소 크기를 갖는 3 차원 화상으로 통계적 반복 순서 집합 기대 극대화 (OSEM) 2D 알고리즘 및 CT 스캔을 적용하여 PET 목록 모드 데이터를 재구성.
  2. 적당한 화상 해석 소프트웨어 이미지 공동 등록 (예 : 직장 또는 Inveon 연구 PMOD)의 경우, 상기 자동 동시 등록 툴을 사용한다. 이것이 실패하면, 축, 관상 및 시상에서 공간적으로 재구성 된 CT와 PET 영상의 공동 등록하는 지침으로 마우스 침대 밑 유리 모세관을 사용한다.
  3. 애완 동물 이미지를 수정방사성 붕괴 법률과 12.7 시간의 방사성 핵종 (64) 구리의 하프 타임을 이용하여 방사성 붕괴에 대한. 화상 정규화를 들어, 기준으로서 하나 명의 화상 (A)을 선택하고 각 이미지 분석 소프트웨어에서의 화상 표시 장치의 강도를 조절한다.
    1. ((주입 된 활성 (X) / 주입 작업 : 다른 이미지 단지 참조 화상 (A)에 대한 설정 값은 분사 활성 (A) 및 주사 활동 (X)는 다음 식을 이용하여 다른 이미지를 정규화 활용 A)) × 세기 값 (A).
  4. 폐와 perithymic 림프절의 정규화 된 PET 신호에 대한이자 (VOI)의 3D 볼륨을 그립니다.
  5. cm 3 (%의 ID / cm 3) 다음 식에 따라 백분율 주사 투여를 결정 (마우스에서 VOI / 전체 활성 활성을 의미한다)에 대한 참조 (23)를 22 참조 화상 해석에 관한 자세한 지침 × 100.

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결과

도 1은 64의 Cu-DOTA-KJ1-26 단클론 및 시험 관내 및이 프로토콜에 덮여 생체 내 연구에서의 실험 디자인 COVA-TH1 세포의 표지를 요약 한 것이다.

figure-results-1
그림 1 : 64 CU-DOTA-KJ1-26 - 단클론 항체 라벨링 공정 및 실험 설계. 64 CU-DOTA-KJ1-26 단클론 방사성 표지의 셀 (A) 도식 표현. 64 CU-DOTA-KJ1-26 단클론은 TH1 세포의 세포 표면에 COVA-TCR 수용체에 결합하고, 24 시간...

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토론

이 프로토콜은 안정적으로 PET에 의해 생체 내 추적 세포를 방사성 표지하는 신뢰할 수있는 쉬운 방법을 제시한다. 64 CU-DOTA-KJ1-26 - 단클론 항체 및 그 유도와 방사성 표지 수, 코바-TH1 세포, 절연 및 기증자 마우스의 체외에서 확장이 방법을 수 활용하는 A의 코바 프레젠테이션의 사이트로 폐와 perithymic 림프절을 추적했다 급성기도 DTHR을 COVA 유도.

킬레이트와 단클론 항체의 수정은 신속하고 효율적인 작업 및 아민의 흔적이없는 초순수 솔루션의 사용을 필요로한다. 용액은 항체의 잔기 아민 할 DOTA-NHS 활성 에스테르의 적절한 결합을 위해 킬레이트 이온 교환 수지로 처리 하였다. 세포 내 방사능 표지와 같은 킬레이트 공역 항체는 비특이적 세포 표지 제의 사용에 비해 여러 가지 장점을 갖는다. 첫째, 단클론 항체는 정의 된 세포 인구의 대상 표시를 허용 우수한 특이성을 제공합니다. 단클론 항...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

저자는 실험 및 데이터 분석시 지원을 위해 박사 줄리아 만하임, 월터 에를리치만, 라모나 스텀, Funda 케이, 다니엘 부칼라, 마렌 하란트뿐만 아니라 나탈리 Altmeyer 감사합니다. 이 작품은 베르너 지멘스-재단, SFB685 통해 DFG (프로젝트 B6)과 재산 (2309-0-0)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
HCl, SuprapurMerck, 다름슈타트, 독일1.0031864Cu 생산
메탄올, SuprapurMerck, 다름슈타트, 독일1.0600764Cu 생산
Isopropanol, SuprapurMerck, 다름슈타트, 독일1.010464Cu 생산
Pt/Ir (90/10) plateÖ gussa맞춤 제작64Cu 생산
PEEK 챔버WKL맞춤 제작64Cu 생산
64NiChemotrade64Cu 생산
Polygram SIL G/UV 254 플레이트Macherey-Nagel80502164Cu 생산
이온 교환 columnBioRadAG1-X864Cu 생산
PETtrace 용솔리드 스테이트 타겟 시스템WKL 코스텀 제작64Cu 생산
64Cu 워크업 모듈WKL코스텀 제작64Cu 생산
용량 교정기CapintecCRC-25R
PETtrace cyclotronGeneral Electric Medical Systems
DOTA-NHSMacrocyclicsB-280DOTA-conjugation
Anti-cOVA-TCR 항체 (KJ1-26)하이브리도마 세포 배양에서 분리DOTA 접합
Na2HPO4Sigma-Aldrich71633DOTA 접합
H+ Chelex 100Sigma-AldrichC7901DOTA-conjugation
Amicon Ultra-15 필터 유닛Merck MilliporeUFC910008DOTA 활용
Rotipuran 초순수Carl RothHN68.3DOTA
아세트산 암모늄Sigma-Aldrich32301DOTA 활용
PBSUniversity TuebingenDOTA-conjugation
Micro Bio-spin P-6 columnBio-Rad Laboratories7326221DOTA-conjugation
sodium citrateSigma-Aldrich71497DOTA-conjugation
Cyclone Plus PhosphorImager Perkin-ElmerL2250116DOTA 활용
DMEMMerck Millipore102568T 세포 매체용 성분 
FCSMerck MilliporeS0115/1004B성분 T 세포 배지용 
나트륨 피루브산Merck MilliporeL0473성분 T 세포 매체용 
MEM-아미노산Merck MilliporeK0293성분 T 세포 매체 
헤페스 Merck MilliporeL 1613T 세포 배지용 성분 
  페니실린/스트렙토마이신Merck MilliporeA2212성분 T 세포 매체용 
0.05 mM 2-β-메르캅토에탄올Sigma-AldrichM3148성분 T 세포 배지 
DO11.10 마우스사육TH1 세포 배양
DPBSGibco14190144TH1 세포 배
양 세포 스트레이너 40 &마이크로; 엠 Corning352340TH1 세포 배양
ACK 용해 버퍼Lonza10-548ETH1 세포 배양
CD4 MicroBeads, 마우스Miltenyi Biotech130-097-145TH1 세포 배양
QuadroMACS 분리기Miltenyi Biotech130-090-976TH1 세포 배양
LS 컬럼Miltenyi Biotech130-042-401TH1 세포 배양
항-CD4 항체 (Gk1.5)하이브리도마 세포 배양TH1 세포 배양
항-CD8 항체 (5367.2)하이브리도마 세포 배양TH1 세포 배양
항-쥐 항체 (MAR18.5)하이브리도마 세포 배양TH1 세포 배양
토끼 보체tebu-BioCL3221TH1 세포 배양
항-IL-4 항체 (11B11)하이브리도마 세포 배양TH1 세포 배양
cOVA 323-339-peptide에서 분리 EMC-micro-collections맞춤 주문TH1 세포 배양
CPG1668-올리고뉴클레오티드Eurofins MWG Operon맞춤 주문TH1 세포 배양
IL-2Novartis65483-116-07TH1 세포 배양
96-웰 플레이트Greiner 655180TH1 세포 배양
24웰 플레이트Greiner 662160TH1 세포 배양
세포 배양 플라스크Greiner 660175TH1 세포 배양
48웰 플레이트Greiner 677 180세포 라벨링
Gammacell 1000Best Theratronicsvia 문의 
Gulmay RT225Gulmayvia 문의 
Trypan blueMerck MilliporeL6323in vitro 평가
마우스 IFN-γ ELISABD Biosciences558258in vitro 평가
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit BD Biosciences559763in vitro 평가
튜브 5 mLSarstedt55.476in vitro 평가
라운드 바닥 튜브 BD Biosciences352008in vitro 평가
마법사 γ 카운터Perkin-Elmer2480-0010in vitro 평가
ELISA 리더 MultiscanEXThermo Fisher Scientific51118177in vitro 평가
현미경Leicavia 문의 in vitro 평가
BD LSRII BD Biosciencesvia 문의 체외평가
BALB/c 마우스Charles River028in vivo 세포 밀매
알루미늄 젤Serva 전기영12261.01in vivo 세포 밀매
XylazineBayer HealthCare주문 via 대학병원in vivo세포 밀매
케타민비율제약via 대학병원in vivo 세포 밀매
IsofluraneCP-Pharma주문 via 대학병원in vivo세포 밀매
30 G 바늘BD Biosciences304000in vivo 세포 밀매
주사기BD Biosciences11612491in vivo 세포 밀매
모세혈관 10 µ LVWR612-2439
Inveon PET 스캐너Siemens Healthineers더 이상 사용할 수 없습니다in vivo 세포 밀매, 대체 회사: Bruker, Mediso 
Inveon SPECT/CT 스캐너Siemens Healthineers더 이상 사용할 수 없음in vivo 세포 밀매
Inveon Research WorkplaceSiemens Healthineers이미지 분석, 대체 소프트웨어: Pmod
, 활용 에서 분리 MA 동 는

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