기본 전립선 세포 분화에 대한 신속한 필터 삽입 기반의 3D 문화 시스템

개인에게 개인화 된 식별 및 암 치료의 사용은 암 연구의 주요 목표입니다. 최근, 새로운 접근법은 잠재적 모두 파악하고 맞춤형 치료를 테스트하는 방법을 제공하는 일차 세포 배양 확립 더 큰 용이성을 허용 개발되었다. 예를 들어, R-spondin 기반 전립선 organoid 접근법 ^{1 허용} 상용 외 매트릭스에서 정상 및 전이성 전립선 암 세포의 3 차원 배양 (예, 마트 리겔)에 대한 세포의 조건부 재 프로그래밍 (CRC) 법 반면 조지 타운 ^{2에서 개발, 3 개} 표준 2 차원 배양 조건을 사용한다. 구체적으로는, Rho 키나아제 억제제 (Y-27632) 및 조사 J2 뮤린 섬유 모세포 피더 세포의 결합은 각질 세포의 ^CRC가이 부정 배양 이어질. 상기 CRC 방법은매우 강력한 일차 전지 라인이 성공적으로 설립 전립선 및 기타 여러 정상 및 악성 상피 조직 ^(3)로부터 무기한 유지와 함께. 중요한 것은, 우리의 CRC 기술은 이전의 약물 치료의 숫자를 실패한 환자에서 재발 성 호흡기 유두종의 병인으로의 신속한 식별을 허용했다. 또한, 정상 및 종양 유래의 CRC를 사용하여, FDA의 성공적인 식별 초기 조직 생검의 2 주 이내에되었다, vorinostat을 약물을 승인했다. 환자들은 질환 ^(4)의 성공적인 치료 결과 vorinostat에 넣었다.

정상적인 전립선은 내강, 기초 및 희귀 신경 내분비 세포 ^(5)으로 구성되어 있습니다. 내강 세포 선의 원주 상피 층을 형성하고, 안드로겐 수용체 (AR),뿐만 아니라 8 및 18 cytokeratins 친 다른 내강 마커를 발현국가 특이 항원 (PSA) ^6. 역으로, 기저 세포 내강 층 아래에 지역화 및 사이토 케라틴 5 P63 있지만, AR ^(5)의 낮은 레벨을 표현한다. 우리는 ^{7, 8, 9, 10 등을} 성공적 임상 약물 역학적 감도 연구에서 전립선의 CRC를 사용했다. 2D 표준 조직 배양 조건 하에서 성장 된 경우에는, 이들 세포가 완전히 ^{열 신호} AR 맞물린 못한다. 면역 결핍 쥐의 신장 캡슐 아래에 위치 할 때 중요한 점은 CRC가이 허용 환경에 배치 할 때 전립선 CRC가 자신의 혈통의 의지를 유지할 것을 나타내는 정상 전립선 선의 구조와 기능을 회복했습니다. 여기에 설명 된 필터 인서트 계 세포 배양 시스템의 개발이 급속 (2 주)를위한 증명 B와 같은 전립선의 CRC의 체외 분화를 허용Y 증가 아칸소와 AR 대상 유전자의 발현도 감소 등의 P63 수준.

사용되는 필터 삽입은 포유 동물 세포의 배양을지지 할 수 카보네이트 멤브레인 (기공 크기 0.4 ㎛의)을 포함한다. 시스템이 개발로, 정상 및 악성 전립선 CRC로 6 웰 배양 접시 필터 인서트를 사용한다. J2 전지 ^(11)에 의해 조절 된 세포 배지는 상부 챔버 하부 측실 전립선 분화 배지에서 배치된다. 기술은 본원 맞춤 의학의 목적과 일치하는 2 주 기간 내에 전립선 내강 세포 분화를 지원 설명한다. 문화의 포괄적 인 분자 유전 학적 및 세포 프로파일을 허용 방법론을 개발하는 것이 필수적이었다. 필터 표면으로부터 방출 세포에서 DNA, RNA 및 단백질을 분리하는 방법을 개발하고 정확한 반복 시료 처리 간소화되었다. FINA에서야 베드로, 방법론은 H & E, 면역 조직 화학 및 면역 형광 염색, 삽입을 사용할 수 있도록 필터를 제거 절편과 필요한 완전히 설명되어 있습니다.

3 차원 셀의 1. 설립 문화 삽입 시스템

1. 아래로 6 웰 플레이트 (그림 1A)에서 역 방향 (최대 필터 측) 2 폴리 카보네이트 세포 배양 삽입을 놓습니다.
2. 인서트의 바닥면에 물을 0.1 % 젤라틴의 얇은 층을 적용하고 멸균을 유지하기 위해 생물학적 안전 캐비넷 (10-20 분) 건조 할 수있다.
3. 단계를 반복 1.2 삽입에 0.1 % 젤라틴의 3 응용 프로그램의 총 두 번 더.
   주 : 젤라틴 코팅 챔버 사이의 제한 확산 도움이 될 것입니다.
4. 문화 플라스크를 씻어 PBS의 5 mL를 넣고, 표준 배양 조건에서 차의 CRC를 수집합니다.
   1. 37 ° C에서 5 분 동안 0.25 % 트립신 EDTA (a T-75에 대한 T-25이 용액 1 ㎖)를 사용하여 세포를 Trypsinize. 부드럽게 세포를 빠지에 도움을 플라스크의 측면을 누릅니다. 이어서 트립신 반응을 정지하고 완전 DMEM 5 ㎖를 첨가하여 세포를 수집하기 위해 진행.
   2. 수집 15 ㎖의 튜브에 세포. 4 ° C와 188 XG에서 튜브를 원심 분리기 및 자동 셀 카운터 또는 혈구를 사용하여 계산합니다.
   3. 미디어 (CM)를 조절 250 μL에 60의 CRC를 다시 일시 중단하고 제대로 지향 (필터면을 아래로) 문화 삽입 (그림 1B)에 추가 할 수 있습니다. 이는 내부 챔버로 지칭된다.
      참고 : CM은 조사 J2 세포에 의해 조절 F-매체이며, 이전에 ^{7, 8, 9, 11} 설명 된대로 10 μm의 Y-27632이 포함되어 있습니다.
5. 6 웰 플레이트의 외부 챔버에 CM의 2 용액을 적용하고 (최소 18 시간) 밤새 37 ° C에서 품어.
6. 조심스럽게 한 ML 200 μL 피펫으로 내부 챔버에 CM을 제거하고 천천히 풀 때까지 1 ML의 피펫 내부 챔버에 차별화 미디어 (DM)를 추가합니다. 셀 계층을 방해하지 않도록주의해야합니다.

1. 매일 문화를 확인합니다. 그림 2와 같이 건강한 세포가 나타납니다.
2. 외부 챔버의 CM 매일 또는 세포의 신진 대사에 따라 매일 변경합니다.
3. (노란색) 내부 챔버 변경 색상의 매체는 조심스럽게 한 ML 200 μL 피펫으로 내부 필터 챔버에서 용지를 제거합니다.
4. 흡인 팁과 외부 6 웰 플레이트 챔버에서 미디어를 대기음.
5. 1 ML의 피펫을 사용하여 천천히 풀 때까지 내부 챔버에 신선한 DM을 적용합니다. 긁어하거나 셀 층을 제거하지 않도록주의하십시오.
6. 신선한 CM 2 mL로 외부 챔버에서 미디어를 교체합니다.
7. 2 주 문화를 유지 한 다음 원하는 생체 분자 분리에 대한 처리를 진행합니다.
   주 : 6 웰 플레이트의 각 행은, 여섯 삽입 (그림 1B)의 총, DN에 대한 충분한 세포를 얻기 위해 실험에 따라 처리해야분석을 위해 A, RNA 또는 단백질.
8. 외측 챔버 대기음 매체 및 2 ㎖의 인산 완충 식염수 (PBS)로 헹군다.
9. 조심스럽게 한 ML 200 μL 피펫과 내부 챔버에서 미디어를 제거하고 500 μL PBS를 추가합니다. 긁어하거나 막에 세포를 방해하지 마십시오.
10. 기음 외부 챔버에서 PBS 조심스럽게은 1 mL를 200 μL 피펫으로 내부 챔버에서 PBS를 제거합니다. PBS를 제거하고 나면 아래에 설명 된 해당 응용 프로그램에 직접 진행합니다. 멤브레인이 건조하는 것을 허용하지 않습니다. 응용 프로그램이 시작할 준비가 될 때까지 배양은 PBS로 잠시 유지할 수있다.

3. 펠렛 은행의 필터 처리

1. 각 내부 챔버 100 μL 0.25 % 트립신 - EDTA를 추가하고 37 ℃에서 5 분 동안 품어.
2. 아래로 피펫 팅하는 동안 간단히 조심스럽게이 / 교반 200 μL 피펫으로 막 표면에 세포를 긁어 (punc을 피하기) 막을 튜링. 37 ° C에서 1 분 동안 품어.
3. 필터를 씻어 아래로 부드럽게 제 1 내부 챔버에 CM의 250 μL를 추가하고 최대 피펫합니다.
4. 전송 매체 같은 조건을 포함하고, 상하 피펫 팅을 반복하여 인접하는 필터 챔버에 세포를 재현 탁.
5. 단일 조건의 삽입 각각에 대해이 절차를 반복합니다. 수집 및 1.5 mL의 원심 분리기 튜브에 세포를 전송합니다.
6. 남아있는 세포를 수집하는 CM의 추가로 100 ~ 200 μL 각 내부 챔버를 씻어. 단계 3.5에서 1.5 ML의 원심 분리기 튜브에 추가합니다.
7. 5 분 동안 4 ℃에서의 microcentrifuge 423 XG에 세포를 스핀.
8. 뜨는을 기음 1000 μL PBS로 한 번 세포 펠렛을 씻는다.
9. 5 분 동안 4 ° C에서의 microcentrifuge에서 423 XG에 다시 스핀.
10. 대기음 PBS하고 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 동결.

4. RNA 또는 DNA 분리에 대한 필터 처리

세포 배양 인서트 기반 시스템 내강 세포 분화를 지원 전립선 CRC가 3 차원 배양 물을 제조하기위한 상대적으로 간단하고 신속한 방법이다. 시스템의 개략적 필터 인서트의 바닥면에 젤라틴 코팅의 적용을 강조 (도 1A)를 나타낸다. 삽입물은 젤라틴의 적용 번복된다. 도 1b에 필터는 배양에 적절한 방향이다. 투명 셀 인서트를 사용하여 3 차원 전립선 건강 CRC 문화의 대표 이미지 (10X) (도 2)를 나타낸다. 시연 건강의 CRC의 밀도 레이어는 설립 후 전형적인 표준 광학 현미경을 사용하여 시각 될 수있다. 초기 설정 동안, 상기 방법은 특정 세포주와 호환되도록 형성 세포의 층과 적절한 부착 라 시각화 중요세포의 에링가 발생했습니다.

위에서 설명한 바와 같이 HEA는 삽입물 내부에 적용됩니다. 삽입 (도 3A, 3B)에서 제거 할 수있는 필터를 기록 할 때 HEA의 적용 후주의를 기울여야한다. 모든 단계 (도 3A-3D)에서, 치료는 세포 필터에 HEA 층의 불필요한 이동을 최소화하기 기울여야한다. 상기 CRC 층이 쉽게 파괴와 H & E 카세트 (그림 3D)에 전송하는 동안 손상 될 수 있습니다. 플라스틱 통 (도 3a 내지도 3c)에서 HEA 코팅 필터를 절단 한 후, 필터를 반감 할 수 있고, 절편 및 표준 매립 카세트 (도 3D)을 사용하여 염색 처리. 반으로 필터를 분할하면 H & E 및 IF 크로스 절편에 사용 가능한 표면을 극대화하는 것이 중요합니다.

면역 형광 염색법물론 밝은 필드 (BF)으로 여과 층에 배양 된 세포의 이미지 DSU (디스크 스캔 장치) 스피닝 디스크 촛점 기능 현미경을 이용하여 수집 하였다. 조직학 및 H & E 염색에 대한 대표적인 결과는 필터 인서트 및 셀 (20X) (그림 4)의 단면에 표시됩니다. 적절한 치료와 함께, 우리는 조직 조직학에 대한 표준 관행이기 때문에 필터 삽입에 CRC 층, 절단 및 스테인드 될 수 있다는 것을 보여줍니다. 절편 동안, (도 4)으로의 CRC 증명이 세포의 손상 층으로 필터로부터 분리 될 수 있도록 할 수있다. BF 이미지는 다공성 막 (그림 5A)의 상단에 다층 셀 지층을 보여줍니다. 세 형광 마커 (그림 5E)의 병합이기 때문에 핵에 대한 개별 형광 이미지 (DAPI,도 5b), P63 (그림 5C)와 AR (그림 5D)이 표시됩니다. 마지막으로, 붙지세포 및 필터에 형광 신호 상대의 현지화를 확립 전자 BF와 오버레이가 표시되면 (그림 5 층). P63와 DAPI 얼룩의 오버레이 염색 명확하게 증식 상태에서 여전히 셀을 설명합니다. AR의 지역화는 핵에 염색은 전립선 세포에서 AR의 기능 활성화를 표시됩니다.

우리의 필터 삽입 시스템의 IF 및 단면 전립선 조직 간의 비교는 전립선 상피의 우리 CRC 삽입 층의 개발 유사성을 증명하는 (도 6a,도 6b)를 도시한다. 전립선 덕트 전립선 기저 세포와 일치 P63의 발현을 나타낸다. P63 염색은 삽입의 CRC가에서 볼 수있다. 발현 세포를 높은 비율의 P63는 손상 조직 절편에 비해 우리 인서트 관찰되었다. 또한, 핵 및 세포질 AR 모두 전립선 TIS에 보이는 필터 삽입 쇼 적은 전체 AR 식 핵 AR 발현과 세포질 염색 모두에서 CRC가가, 그대로 전립선과 유사한 볼 동안 섹션을 고소합니다.

그림 1 : 3D 문화 시스템을 구성하는 6 웰 배양 접시와 삽입의 대표 이미지. 필터 (화살표)의 밑면에 젤라틴 코팅을인가 (A) 거꾸로 삽입한다. 삽입 및 필터의 큰 이미지 쇼 (삽입)입니다. (B) 제대로 배치 삽입. 시스템의 내부 및 외부 챔버 (화살표) 나타낸다. B의 박스형 행은 소정의 실험 조건을 획득하는 방법을 복수의 샘플을 나타낸다. 2 주간의 성장 기간이 끝날 때 이들 인서트는 분석을 위해 충분한 물질을 수득 풀링 될 수있다."대상 ="_ 빈은 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 투명 필터 멤브레인 상에 건강 CRC가 시드의 레이어의 대표 이미지가 표시됩니다. 둘 다 내부 및 외부 챔버 에어컨 미디어가 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : 필터의 대표 이미지 두 부분으로 절반 가까이 떨어졌다 및 포함을위한 파라핀 카세트에 배치. (A) 필터는 득점 후 제거하기 전에 HEA 코팅으로 삽입합니다. (B) 폴리 카보네이트 배럴에서 방출 된 필터 인서트. ( (D) 적절한 배치 및 매립 카세트 내부의 두 반쪽의 방향입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : 필터 삽입 및 세포의 대표 H & E 스테인드 단면 (20 배). 모두 막 (아래)과 세포 층 (상단) 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5 : 대표 밝은 필드 (BF) 및 면역 형광 (IF)의 A 시리즈의 이미지세포는 필터 (40X)에 절단. 필터 및 세포의 단면이 표시됩니다. 필터 표면 (5A)에있는 세포의 염색 BF 이미지는 두 개의 서로 다른 단백질 P63 (5C) 및 안드로겐 수용체 (AR, 5D)에 대한 DAPI 염색 핵 (5B) 및 면역 형광 염색법에 대한 이미지를 동반한다. 셀 섹션 (5E, F)의 합성 오버레이 셀 필터의 맥락에서 IF 신호들의 위치 파악을 정의한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6 : 조직에서 전립선 상피의 절 (20 배)에 비해 필터에 단면 세포의 대표적인 면역 형광 (IF) 이미지.우리의 필터 인서트의 단면 화상은 그대로 전립선 (도 6b)의 도관 상피 층에 비하여 (도 6A) 도시되어있다. P63의 염색은 AR과 핵은도 5에서와 같이 수행 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 아무것도 없어.