기본 전립선 세포 분화에 대한 신속한 필터 삽입 기반의 3D 문화 시스템

요약

여기에서는 일차 전립선 상피 세포의 3차원 배양 및 후속 내강 분화를 지원하는 신속한 체외 시스템을 구축하는 방법을 제시합니다.

초록

조건부 재 프로그램 세포 (CRC가)는 차 세포 ​​배양 및 환자 유래 세포 라인의 광범위한 "살아있는 바이오 뱅크"를 개발 할 수있는 능력에 대한 지속 가능한 방법을 제공한다. 상피 세포의 많은 유형의 다양한 삼차원 (3D) 배양 방법은 개선 된 분화 상태를 지원하는 것을 설명 하였다. CRC가 그들이 절연되어있는 조직에 자신의 혈통의 의지를 유지하는 동안, 그들은 보통 두 개의 차원 (2D) 배양 조건 하에서 성장하는 경우 원산지의 조직과 관련된 분화 마커의 많은 표현하지 못한다. 전립선 암 연구 환자 유래의 CRC의 적용을 강화하기 위해, 3 차원 배양 포맷은 정상 및 종양 유래 전립선 상피 세포 모두에서 급속한 (2 주 전체) 내강 세포 분화를 가능하게한다는 정의되었다. 여기서, 필터 삽입 기반 포맷은 정상 및 악성 전립선 CRC가 양자의 배양과 분화를 위해 설명된다. 드면역 조직 화학 및 면역 형광 염색 세포 수집 및 처리에 필요한 절차 꼬리 설명이 제공됩니다. 총체적으로 기본 CRC 라인과 함께 설명 된 3D 배양 형식은 biospecimen 기반 전립선 연구 처리량 모델 시스템을 릅니 중요한 중간을 제공한다.

서론

개인에게 개인화 된 식별 및 암 치료의 사용은 암 연구의 주요 목표입니다. 최근, 새로운 접근법은 잠재적 모두 파악하고 맞춤형 치료를 테스트하는 방법을 제공하는 일차 세포 배양 확립 더 큰 용이성을 허용 개발되었다. 예를 들어, R-spondin 기반 전립선 organoid 접근법 ^{1 허용} 상용 외 매트릭스에서 정상 및 전이성 전립선 암 세포의 3 차원 배양 (예, 마트 리겔)에 대한 세포의 조건부 재 프로그래밍 (CRC) 법 반면 조지 타운 ^{2에서 개발, 3 개} 표준 2 차원 배양 조건을 사용한다. 구체적으로는, Rho 키나아제 억제제 (Y-27632) 및 조사 J2 뮤린 섬유 모세포 피더 세포의 결합은 각질 세포의 ^CRC가이 부정 배양 이어질. 상기 CRC 방법은매우 강력한 일차 전지 라인이 성공적으로 설립 전립선 및 기타 여러 정상 및 악성 상피 조직 ^(3)로부터 무기한 유지와 함께. 중요한 것은, 우리의 CRC 기술은 이전의 약물 치료의 숫자를 실패한 환자에서 재발 성 호흡기 유두종의 병인으로의 신속한 식별을 허용했다. 또한, 정상 및 ....

프로토콜

3 차원 셀의 1. 설립 문화 삽입 시스템

1. 아래로 6 웰 플레이트 (그림 1A)에서 역 방향 (최대 필터 측) 2 폴리 카보네이트 세포 배양 삽입을 놓습니다.
2. 인서트의 바닥면에 물을 0.1 % 젤라틴의 얇은 층을 적용하고 멸균을 유지하기 위해 생물학적 안전 캐비넷 (10-20 분) 건조 할 수있다.
3. 단계를 반복 1.2 삽입에 0.1 % 젤라틴의 3 응용 프로그램의 총 두 번 더.
   주 : 젤라틴 코팅 챔버 사이의 제한 확산 도움이 될 것입니다.
4. 문화 플라스크를 씻어 PBS의 5 mL를 넣고, 표준 배양 조건에서 차의 CRC를 수집합니다.
   1. 37 ° C에서 5 분 동안 0.25 % 트립신 EDTA (a T-75에 대한 T-25이 용액 1 ㎖)를 사용하여 세포를 Trypsinize. 부드럽게 세포를 빠지에 도움을 플라스크의 측면을 누릅니다. 이어서 트립신 반응을 정지하고 완전 DMEM 5 ㎖를 첨가하여 세포를 수집하기 위해 진행.
   2. 수집 15 ㎖의 튜브에 세포. 4 ° C와 188 XG에서 튜브를 원심 분리기 및 자동 셀 카운터 또는 혈구를 사용하여 계산합니다.
   3. 미디어 (CM)를 조절 250 μL에 60의 CRC를 다시 일....

결과

세포 배양 인서트 기반 시스템 내강 세포 분화를 지원 전립선 CRC가 3 차원 배양 물을 제조하기위한 상대적으로 간단하고 신속한 방법이다. 시스템의 개략적 필터 인서트의 바닥면에 젤라틴 코팅의 적용을 강조 (도 1A)를 나타낸다. 삽입물은 젤라틴의 적용 번복된다. 도 1b에 필터는 배양에 적절한 방향이다. 투명 셀 인서트를 사용하여 3 차원 전립선 건강 CRC 문화의 대표 이미지 (10X) (도 2)를 나타낸다. 시연 건강의 CRC의 밀도 레이어는 설립 후 전형적인 표준 광학 현미경을 사용하여 시각 될 수있다. 초기 설정 동안, 상기 방법은 특정 세포주와 호환되도록 형성 세포의 층과 적절한 부착 라 시각화 중요세포의 에링가 발생했습니다.

위에서 설명한 바와 같이 HEA는.......

토론

일차 세포주 암 연구의 중요하고 빠르게 개발 플랫폼이다. 배양 인서트 기반 3 차원 배양 시스템은 2 주 기간 내에 기본 전립선 CRC로의 분화를 지원한다. 상기 CRC 필터 방법은 전립선 연구를위한 새로운 중간 처리량 방법을 나타낸다. 기존 마우스 PDX 모델은 시간 소모적이며 매우 비싸고, 상기 PDX 샘플의 많은 연구자 시작한 실험과 그 유용성을 제한 배양에서 성장 될 수 없다. PDX 확립의 성공률을 크게 ¹³ 다르지만 또한, 상기 CRC 방법은 ^{세 세포주를} 확립하는데 성공의 높은 비율을 갖는다. 우리는 우리의 시스템은 R-spondin 기반 전립선 organoid 접근 방식을 보완 할 생각; 그러나, 차 전립선 암 organoids의 설정에 관해서 성공의 부족 ^{(14)에보고되었다.} 또한, 미디어, 설치 방법,과의 CRC의 유지 보수는 R-spondin 기반 전립선 organoid 접근 방식보.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
코닝 Costar Snapwell 배양 인서트	Corning	3801
밀리셀 세포 배양 인서트	Millipore	PIHP01250
Multiwell 6 웰	팔콘	353046
젤라틴 0.1 % 물	Stemcell Technologies	7903
멸균 안전 Scapel 10 블레이드	Integra Miltex	4-510
멸균 표준 메스 11 블레이드	Integra Miltex	4411
RIPA 용해 및 추출 버퍼	Thermofisher Scientific	89900
불화나트륨	Fishcer Scientific	S299-100
나트륨 바나데이트	Fishcer Scientific	13721-39-6
디티오트레이톨	시그마-알드리치	3483123
프로테아제 억제제 칵테일 (AEBSF, 아프로티닌, 베스타틴, E-64, 루펩틴 및 펩스타틴 A)	Sigma-Aldrich	P8340
0.25% 트립신-EDTA (1x)	Thermofisher Scientific	25200-056
DMEM	Thermofisher Scientific	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
글루타민	Thermofisher Scientific	25030081& 주의;
페니실린 스트렙토마이신	Thermofisher Scientific	15140-122
F-12 영양소 혼합 매체	Thermofisher Scientific	11765054
Y-27632 디하이드로클로라이드 암석 억제제	Enzo	ALX-270-333-M025
하이드로코르티손	시그마-알드리치	H0888
EGF	Thermofisher Scientific	PHG0315
Insulin	Thermofisher Scientific	12585-014
콜레라 독소	Sigma-Aldrich	C3012
겐타마이신	Thermofisher Scientific	15710-064
Fungizone	Fisher Scientific	BP264550
Trizol 시약	Invitrogen	15596026
Histogel 검체 처리 젤 ( 하이드록시에틸 아가로스(HEA))	Thermo Scientific	HG-4000-012
Non-Adherent Dressing	Telfa	KDL2132Z
Cell Culture	Dish Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II 조직 처리/임베딩 카세트	Crystalgen	CG-M492