이 동영상과 원고는 단순 교반 용기를 사용하여 큰 배치로 생산할 수있는 0.5 % ~ 10 % 알긴산 염 비즈로 포유류 세포를 캡슐화하는 유제 기반 방법을 설명합니다. 캡슐화 된 세포는 시험 관내에서 배양 되거나 세포 치료 응용을 위해 이식 될 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
알기 네이트 비드에서의 세포 캡슐화는 시험 관내 뿐만 아니라 생체 내 면역 분리 를 위해 고정화 된 세포 배양 에 사용되어왔다. 췌도 소포 캡슐화는 동종 또는 이종 이식에서 랑게르한 생존을 증가시키는 수단으로서 광범위하게 연구되어왔다. 알지네이트 캡슐화는 일반적으로 노즐 압출 및 외부 겔화에 의해 달성됩니다. 이 방법을 사용하여, 노즐의 끝에 형성된 세포 함유 알지네이트 물방울은 물방울로 확산 될 때 이온 성 알지네이트 겔화를 유발하는 2가 양이온을 함유하는 용액에 빠지게된다. 노즐 팁에서의 액적 생성에 대한 요구는 용적 처리량 및 달성 될 수있는 알긴산 염 농도를 제한한다. 이 비디오는 포유류 세포를 70 % ~ 90 %의 세포 생존율을 갖는 0.5 %에서 10 %의 알지네이트로 캡슐화하는 확장 가능한 유화 방법을 설명합니다. 이 대체 방법에 의해, 세포 및 탄산 칼슘을 함유하는 알긴산 방울을 미네랄 오일,내부 칼슘 방출 및 이온 성 알기 네이트 겔화를 유도하는 pH의 감소로 낮아진다. 현재 방법은 유화 20 분 이내에 알지네이트 구슬의 생산을 허용합니다. 캡슐화 단계에 필요한 장비는 대부분의 실험실에서 사용할 수있는 단순 교반 용기로 구성됩니다.
서론
포유류 세포 캡슐화는 면역 거부 반응으로부터 이식 된 세포를 보호하거나 고정화 된 세포 배양을위한 3 차원 지지체를 제공하는 수단으로 광범위하게 연구되어왔다 2 , 3 , 4 . 알지네이트 구슬의 췌장 섬모 캡슐화는 동종 제 5 , 6 또는 이종 동물 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 개의 설치류에서 당뇨병을 역전시키는 데 사용되었습니다. 제 1 형 당뇨병을 치료하기위한 캡슐화 된 췌도 이식의 전임상 시험과 임상 시험이 진행 중이다 ( 13 , 14
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프로토콜
1. 알긴산 염 용액, CaCO3 서스펜션 및 산성화 오일 준비
- 프로세스 버퍼와 매체를 준비하십시오.
- 10 mM HEPES, 170 mM NaCl을 사용하여 고농도 알긴산염 구슬을 생성하는 데 사용되는 일반적인 공정 완충액을 준비하십시오. pH를 7.4로 맞추십시오.
- 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 6 MM 글루타민, 100 U / ML 페니실린, 100 MG / ML streptomycin을 포함하는 Dulbecco의 수정 독수리 매체 (DMEM)를 사용하여 전형적인 문화 매체를 준비합니다.
- 구슬의 최종 원하는 농도의 1.17 배에서 알지네이트 원액을 준비합니다.
- 먼저 알긴산 염 분말의 적절한 양을 칭량하십시오. 예를 들어, 50:50 LVM 및 MVG 알긴산 염을 함유 한 5 % 알긴산 염의 최종 농도를 얻으려면 0.583g LVM 알긴산 염 분말과 0.583g MVG 알긴산 염 분말을 합하여 총 1.17g 알긴산 나트륨을 계량하십시오.
- autoc에 20 mL 공정 완충액 넣기자석 교반 접시에 유리 용기를 넣고 ~ 200 rpm으로 교반하십시오. 이 용액에 sodium alginate powder를 점....
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결과
유화 및 내부 겔화 공정이 끝나면 초기 알긴산염 및 세포 혼합물 부피와 유사한 비드 부피가 회복되어야합니다. 구슬은 결함이 거의없는 구형이어야합니다 ( 그림 3 ). 구슬은 대구경 피펫을 통해 피펫 팅을 견딜 수있을만큼 충분히 강해야합니다. 높은 알긴산 염 농도에서 캡슐화 된 오일 또는 공기 방울이 구슬에서 관찰 될 수 있습니다. 이는 유화 단계 (유성 / 물 / 유성 이중 유제) 동안 알긴산 염료에 오일이 포획되어 발생하기 쉽습니다. 우리의 손에서,이 구슬은 구슬 부피의 작은 부분 (5 % 미만)을 나타 냈고, 구슬 회수 단계에서 오일을 흡입하는 동안이 구슬의 대부분이 제거되었습니다.
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토론
내부 겔화 반응 동안 다양한 단계 ( 그림 2 )가 전체 반응 속도를 제한 할 수 있습니다. ~ 2.5 μm보다 큰 탄산 칼슘 입자의 경우, 탄산염 용해 속도는 속도 제한 26 , 44 로 나타났습니다. 내부 칼슘 방출을 유도하는 산성화 단계는 또한 세포 생존에 영향을 미치는 중요한 공정 변수로도 나타났습니다 32 . 따라서 내부 겔화를 유발하는 조건은 세포 생존뿐만 아니라 비드 품질에도 중요합니다. 비드에 대한 최종 적용에 따라, 상이한 최적 공정 조건이 선택 될 수있다. 예를 들어, 높은 pH 강하 ( 예 : 알지네이트 용액을 완충시키는 10 mM HEPES 사용)는 구슬의 장기간 안정성이 중요한 이식 용도에 바람직합니다. 다른 한편, 더 낮은 pH 강하 ( 예 : 60 mM MOPS를 사용하여 buffe알지네이.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
유화 공정에 대한 그녀의 토양 개발에 대한 질 오스본 (Jill Osborne)과 기술 지원에 대한 로렌 윌킨슨 (Lauren Wilkinson)에게 감사드립니다. Igor Laçik, Timothy J. Kieffer 박사 및 James D. Johnson 선생님의 의견과 협조에 감사드립니다. Diabète Québec, JDRF, ThéCell, 센터 연구 센터 (CQMF), 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC), 인간 섬 이식 및 베타 세포 재생 센터, 캐나다 줄기 세포 네트워크, 마이클 스미스 보건 연구 재단, 자금 지원에 대한 비용 및 비용 865
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Reagents and consumables | |||
| LVM alginate (transplantation-grade)Novamatrix | Non-applicable | 결과에서 "alginate #1"이라고 불렀다. | |
| MVG 알긴산염(이식 등급) | Novamatrix | 해당 없음 | 결과에서 "알긴산 #2"라고 합니다. |
| 알긴산염(세포 배양 등급) | Sigma | A0682(저점도) 또는 A2033(중간 점도) | A2033은 결과에서 "알긴산 #3"으로 참조됩니다. |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| 소 태아 혈청, 특성화, 캐나다 유래 | Thermo Fisher Scientific | SH3039603 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| 페니실린 및 스트렙토마이신 | Sigma | P4333-100ML | |
| HEPES, 세포 배양 테스트 | Sigma | H4034-100G | |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | S271-1 | |
| Fine-grain CaCO3 | Avantor Materials | 1301-01 | CaCO3 현탁액을 준비한 후 초음파 처리하여 1개월 이내에 사용하십시오. |
| 경량 미네랄 오일 | Thermo Fisher Scientific | O121-4 | 멸균 필터는 0.22 μ 사용하기 전에 M 기공 크기의 멤브레인을 사용하십시오. |
| 빙초산 | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | 취급 주의: MSDS를 참조하십시오. |
| 멸균 주걱 | Sigma | CLS3004-100EA | |
| 멸균 나일론 셀 여과기, 40 µ m | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 혈청학 피펫 (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Sarstedt | 86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 및 86.1685.001 | |
| 파스퇴르 피펫 | VWR | 14673-043 | |
| Toluidine Blue-O | Sigma | T3260 | |
| Equipment | |||
| 100 mL 마이크로캐리어 스피너 플라스크 | Bellco | 1965-00100 | 최신 모델의 임펠러 구성은 적절한 유화에 적합하지 않을 수 있습니다. 플라스크 바닥에서 0.5cm 떨어진 곳까지 오일을 쓸어낼 수 있는 블레이드는 테프론 시트로 맞춤 제작할 수 있습니다. |
| 속도 조절이 가능한 마그네틱 교반 플레이트 | Bellco | 7760-06005 | 회전 속도는 사용하기 전에 보정해야 합니다(예: 회전 속도계 사용). |
| 셀 카운터 | Innovatis | Cedex AS20 | 이 시스템은 현재 Roche에서 판매하고 있습니다. 이 자동화된 세포 계수기는 혈구계를 사용한 Trypan blue 염색 후 수동 세포 계수기로 대체할 수도 있습니다. |
| LED 라이트 박스 | Artograph | LightPad® PRO | 이 항목은 다른 유형의 조명기로 교체할 수 있습니다. |
| 핸드헬드 카메라 | Canon | PowerShot A590 IS | 다양한 핸드헬드 카메라를 사용하여 톨루이딘 블루-o 스테인드 비드 이미지를 캡처할 수 있습니다. 이미지를 획득하기 전에 구슬이 들어 있는 페트리 접시 옆에 자를 놓아야 합니다. |
| 위상차 및 적절한 형광 필터가 있는 형광 현미경 | Olympus | IX81 | 비드를 이미지화하기 위해 여러 현미경 시스템이 사용되었습니다. 여기에 표시된 결과는 GFP 및 TRITC 형광 필터가 장착된 IX81 현미경으로 얻은 것입니다. 전체 비드를 캡처하기 위해 교반 속도에 따라 4X에서 20X 대물렌즈가 사용되었습니다. 살아있는/죽은 염색 이미지는 일반적으로 20X에서 40X 대물렌즈로 캡처되었습니다. |
| 이미지 획득 소프트웨어 | Molecular Devices | Metamorph | 다양한 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 위상차 및 형광 이미지를 획득할 수 있습니다. |
| 이미지 분석 프리웨어 | CellProfiler | 해당 없음 | 다양한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 비드를 물체로 식별하고 비드 크기(예: ImageJ)를 분석할 수 있습니다. |
참고문헌
- Scharp, D. W., Marchetti, P. Encapsulated islets for diabetes therapy: history, current progress, and critical issues requiring solution. Adv Drug Deliv Rev. 67-68, 35-73 (2014).
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K.
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재인쇄 및 허가
