방법 논문

식민지 수준에 개인에서 꿀 꿀벌 개발에 대한 환경 화학 물질의 효과를 평가

DOI:

10.3791/55296

⸱

2017년 4월 1일

 ,  , 
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서 우리는 제시 방법은 개별 꿀벌과 벌집 콜로니 모두 농약 오염 된 식품을 공급한다. 절차는 기본 유생 다이어트 생체 공급함으로써, 또한 벌집 콜로니의 자연 상태에서 개별 꿀벌의 살충제 효과를 평가한다.

초록

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양봉 환경에 살충제가 존재하는 것은 꿀벌의 삶에 영향을 미치는 가장 심각한 문제 중 하나입니다. 살충제는 꿀벌이 살충제가 뿌려진 꽃을 먹은 후에 벌집으로 다시 가져올 수 있습니다. 살충제에 오염된 식품은 작업자들 간에 교환되어 유충에게 먹이가 될 수 있으므로 잠재적으로 꿀벌의 발달에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 환경에 남아 있는 살충제는 꿀벌 개체군에 만성적인 피해 요인이 될 수 있으며 점차 군집 붕괴로 이어질 수 있습니다. 제시된 프로토콜에서는 꿀벌 먹이 방법을 설명하고 개별 꿀벌 또는 군체에 적용합니다. 여기서, 해충을 방제하기 위해 널리 사용되고 꿀벌 유충 및 번데기의 발병에 유해한 곤충 성장 조절제(IGR) 피리프록시펜(PPN)이 살충제로 사용됩니다. 제시 절차는 추가 연구를 위해 잠재적으로 유해한 다른 화학 물질 또는 꿀벌 병원체에 적용할 수 있습니다.

서론

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환경에서 농약의 존재는 가장 심각한 문제 중 하나 인 영향을 미치는 꿀 꿀벌 1, 2, 3의 생명. 몇몇 연구는 꿀벌 식민지 꿀벌 제품에서 살충제 잔류의 일반적인 존재를 증명하고있다. 대만, 농약의 평균 응용 프로그램 11-12kg / (2005 년부터 2013 년) 매년 하였다. 대만에서 사용되는 농약의 양이 5 EU 국가보다 높은, 그리고 라틴 아메리카 국가 4. 즉, apicultural 환경은 특히 대만과 가능성이 다른 국가에서 심각한 농약 스트레스를 겪고있다.

꿀벌 API를 mellifera이 농업 시스템 (6)의 주요 매개자 중 하나이며 또한 꿀 가치있는 제품을 생산하고 있습니다. 그러나 꿀벌은 박람회는다양한 농약이 농약에 대한 ED 꿀과 꽃가루 7, 8을 수집 할 때 농약을 살포 한 꽃에서 먹이 찾아 돌아다 후 벌통에 다시 가져올 수 있습니다. 또한 자체가 두드러기 9, 10, 11 내 해충 문제를 제어하기 위해 목표로 양봉에 의해 농약에 노출 될 수 있습니다. 꿀벌 유충이 자신의 개발, 유충, 무인 항공기에 대한 간호사 꿀벌에 의해 공급되고 있기 때문에, 심지어 여왕은이 농약으로 오염 된 감로 및 꽃가루 (12)에 노출 될 수 있습니다. 꿀벌에 대한 다양한 농약의 독성 (13)를 해결해야합니다.

많은 노력은 환경 잔류 농약의 문제를 평가하기 위해 이루어졌다. 양 외. 에서 꿀벌 유충의 개발에 신경 독성 살충제 이미다클로 프리드의 영향을 테스트이 벌집과 이미다클로 프리드의 서브 치사량은 성인 꿀벌 후각 (14)의 결합 동작의 결과를보고했다. 또한 Urlacher 등. 실험실 조건 (15)에서 꿀 꿀벌 노동자의 학습 성능에 유기 인계 살충제, 클로르 피리 포스의 하위 치명적인 영향을 조사했다. 이전 연구에서 우리는 애벌레 꿀벌 16 (PPN) pyriproxyfen 곤충 생장 조절제의 영향 (IGR)을 평가.

본 논문에서는 꿀벌의 발전에 화학적 영향을 평가하기위한 방법을 제시한다. 꿀벌 공급 방법을 설명하고 하나의 개별 꿀벌 또는 콜로니에 적용 하였다. 첫째, 우리는 생체 내에서 개별 꿀벌에 대한 농약의 영향을 평가하기 위해 식민지에서 유충에 농약에 오염 된 기본 애벌레 다이어트 (BLD)의 서로 다른 농도를 시험했다. 우리는 자연 CONDIT을 시뮬레이션 진행벌통 내에 농약 오염 시럽을 사용하여 이온 살충제. 이 방법에서, 널리 해충 (17)에 대해 사용되며, 꿀벌 유충 및 번데기 (16), (18, 19)의 발전에 유해하다 PPN은 현장에서 농약의 부정적인 효과를 나타내는 지표가 될 것이다.

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프로토콜

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1. 준비

  1. 50 %의 설탕 시럽 1 L합니다. 1 L의 DDH 2 O.에 1kg 자당 녹이고
  2. BLD에서 pyriproxyfen (PPN) 솔루션을 준비합니다. 10,000 ppm의 PPN 원액 1.1 L을 4 ° C에서 2 DDH O. 스토어 멸균 1 L에 PPN 100 ㎖ 용액을 희석.
  3. 다음 실험을위한 BLD 0.1, 1, 10 및 100 ㎎ / ㎏ (PPM)의 최종 농도로 PPN 원액을 희석.
  4. (식민지 레벨) PPN-시럽을합니다. 다음 실험에 대한 50 %의 설탕 시럽 10 및 100 ppm으로 최종 농도로 PPN 주식을 희석.
  5. 꿀 꿀벌 사육.
    참고 : 여기, 실험 위치는 국립 일란 대학 (NIU) 양봉장, 이순신 - 란시, 대만은; (GPS 좌표 : N24.747278, E121.746200).
    1. 꿀벌 (아피스 mellifera이 L.)는 식품 수량 매주 식민지 확인하고 (꿀 저장 영역이 비어) 필요한 경우 1리터 50 %의 설탕 시럽을 공급. 건강한 정의일반적 산란 퀸 각 콜로니의 꿀벌 빗 9 프레임으로서 콜로니.
  6. 기본 애벌레 다이어트 (BLD)의 100 mL로 준비합니다. (DDH 2 O) 멸균 증류수, 탈 이온수에 6 % D- 글루코오스, 프 룩토 오스 6 %, 1 % 효모 추출물을 용해시키고, 50 % 로얄 젤리 보충. 4 ° C에서 보관하지만 3 일 이상합니다.
    실험 전에 35 ° C로 사전 따뜻하고 3 일 이내에 사용합니다.

생체 수유 방법 2.

노트 : 생체 내에서 공급 법은 헨리 등의 알로부터 변형되었다. (20)

  1. 꿀 꿀벌 유충 선택 및 라벨링.
    1. 4 프레임 부에 퀸을 제한하면서 4 프레임 5 개 프레임으로 건강한 콜로니 9 프레임 분할 퀸 excluder입니까. 산란을 위해 4 프레임 섹션에서 적어도 하나 개의 빈 프레임을 남겨주세요.
    2. 여왕이 1 일 산란 후계란의 외관을 검사 프레임 1 일령 유충이 부화까지 72 시간 (4 일째)에 벌통 내부의 알을 유지한다. 손으로 테스트 하이브 밖으로 (24 시간 내에 부화) 1 일 된 노동자 유충을 포함하는 프레임 중 하나를 가지고 꿀벌 브러시 프레임에서 꿀벌 노동자를 제거합니다.
    3. 투명 슬라이드 (크기 = 길이 X 너비 X 두께 29.7 mm X 21mm X 0.1 mm)를 가진 프레임을 덮고 압정 (도 1a)와 프레임의 가장자리에 상기 투명 슬라이드 손톱.
    4. 각각의 치료를위한, 임의로 하나 50 일령 유충 (4 일째)을 선택하고, 상기 투명 슬라이드 영구 마커 펜을 사용하여 각 브루 셀 마크 (도 1a 및도 1b).
      참고 : 다른 치료 사이의 혼동을 피하기 위해 영구 마커 펜을 사용하여뿐만 아니라 프레임과 투명 슬라이드의 각 치료의 정보를 작성합니다. 표시된 슬라이드를 제거하고 생체에 대한 유지 </ EM> 급전 관찰.
  2. 생체 먹이.
    1. 의 흡기 양에 따라 각각 10 μL, 10 μL, 20 μL로 일 1, 2, 3에 피펫으로 각 표지 브루 셀 PPN-BLD (0.1, 1, 10, 100 PPM)의 상이한 농도를 추가 유충의 나이. 대조군에 BLD (NO PPN)의 동일한 금액을 추가합니다. 이에 따라, 각 분류 브루 셀 PPN-BLD의 총 투여 량은 4, 40, 400, 4000 페이지에 축적한다.
      참고 : 표시된 투명 슬라이드하여 표시 무리 세포를 인식하고 공급 한 후 표시된 투명 슬라이드를 제거합니다. 일벌에 의해 무리 세포의 청소를 방지하기 위해 공급하는 신선한 BLD를 사용합니다.
    2. 더 관찰의 원래 식민지로 PPN 처리 된 프레임을 돌려줍니다.
      참고 : 각각의 치료는 네 개의 식민지에서 네 생물 반복 있습니다.
  3. 7 일에서 처리 유충의 관측.
    1. 일을 관찰하려면전자 표지 무리 세포의 사망률과 상한 율을 기록하기 위해 프레임에 표시된 투명 슬라이드를 반환 유충을 PPN은 처리.
  4. 하루에 13에서 처리 번데기와 우화 요금의 관측.
    1. 덮인 무리 세포의 꿀벌 왁스를 제거합니다.
    2. 브루 셀에 소프트 팁 핀셋을 넣고 클램프 번데기를 아주 약간 부드럽게 번데기를 꺼내.
    3. 각 웰 아래 기관 조직의 이중층으로 24 웰 조직 배양 플레이트에 번데기로 이동. 번데기 전송 중에 손상과 사망률을 기록합니다.
    4. (약 팔일) 출현 될 때까지 34 ° C, 70 % 상대 습도 인큐베이터에서 24 웰 조직 배양 플레이트 유지.
    5. 관찰과 번데기와 등장 꿀벌을 기록합니다.
  5. 통계
    1. ± SD 평균값으로 기록 된 데이터와 현재 계산
    2. SA에 의해 변동 (ANOVA)을 이용하여 분석 데이터를 분석S 및 다른 처리의 두 방법의 차이를 분석하기 위해 최하위 차 (LSD)를 사용하여 시험. P - 값 <0.05로 통계적으로 유의 한 정의합니다. 테이블의 동일한 열에서 서로 다른 글자는 통계적 분석에 의해 현저한 효과를 나타냈다.

벌집에서 식민지 수준에서 PPN 3. 독성

  1. 꿀벌 그룹을 설정합니다.
    1. 프레임 4 (파트 A) 및도 5의 프레임 (파트 B) 4 프레임 부에 여왕으로 제한하면서 건강한 콜로니 9 개 프레임을 분할하는 수직 퀸 excluder입니까. 산란을위한 4 프레임 부분에 적어도 하나 개의 빈 프레임을 남겨주세요.
      참고 : 다른 여왕 부품 사이에 이동 여왕을 방지하기 위해 여왕 부분의 상단에있는을 excluder 넣습니다.
    2. 여왕이 1 일 산란 한 후, 달걀 모양의 프레임을 선택합니다. 손으로 A 부분에서 계란을 포함하는 적절한 프레임을 가지고 꿀벌 근로자를 제거꿀벌 브러시로 프레임입니다.
    3. 투명 슬라이드 프레임을 덮고 압정와 프레임의 가장자리에 상기 투명 슬라이드 손톱.
    4. 임의로 함유 달걀 100 개 브루 셀을 선택하여 상기 투명 슬라이드 영구 마커를 사용하여 각 브루 셀을 표시한다. 그룹 1. 다른 치료 사이의 혼동을 피하기 위해 영구 마커를 사용하여 프레임과 투명 슬라이드의 각 치료의 정보를 기록 이러한 100 개 무리 세포를 할당합니다.
    5. 3 일 A 부분에 표시된 프레임을 반환 한 후 알을 낳기 위해 파트 B에 여왕을 전송합니다.
    6. 일일 후, 파트 B의 프레임을 검사 한 적절한 프레임을 선택하고, 단계 3.1.4에 기술 된 바와 같이 계란 함유 100 브루 셀 라벨. 그룹이 이러한 100 개 무리 세포를 할당합니다.
    7. 3 일 파트 B로 표시된 프레임을 반환 한 후 알을 낳기에이 부분에 여왕을 전송합니다.
    8. 6 번 파트 A와 파트 B의 여왕 교환을 반복하고 수치 그룹을 할당,각각 (도 2). 9 개 그룹의 총이 있어야합니다.
  2. 일 13 PPN 설탕 시럽 T reat 꿀벌 콜로니 (도 2).
    1. 1 L 플라스틱 꿀벌 급전 박스 (10) 또는 100 PPM (W X L x 높이 = 20 cm X 30cm X 3.5 cm)를 함유하는 50 % PPN 설탕 시럽을 추가 실험 콜로니의 프레임의 상부에 박스를 넣어.
      참고 : 무리 세포가 봉인 된 것처럼 그룹 1 13 일째에 PPN을받지 않습니다.
    2. 단계 2.2에 기재된 바와 같이 1 L 50 % 설탕 시럽 (NO PPN)와 대조군 사료.
  3. 5 일 (그림 2)에서 각 그룹에 대해 100 개 라벨 무리 세포의 계란 부화 속도로 일일 된 유충 기록을 계산합니다. 꿀 꿀벌 계란은 일반적으로 0일 유충으로 부화 3 일이 걸릴; 따라서 확인하고 100 계란 함유 하루 1에 무리 세포를 라벨 및 부화 속도의 비율을 얻기 위해 하루 5에서 각 그룹에 대해 1 일 된 유충의 수를 계산합니다.
  4. 기음날 (11) (도 2)에서 각 그룹 (100 개) 표지 브루 셀의 애벌레 캐핑 레이트 캡핑 브루 셀 기록 ount. 6 ~ 7 일 된 애벌레 무리 세포는 애벌레 pupating 꿀 꿀벌 노동자 꿀벌 왁스로 제한됩니다.
  5. 번데기 성숙을 관찰하고 17 일 (도 2)에서 각 그룹 (100 개) 표지 브루 셀의 우화 율을 기록한다.
    1. 덮인 무리 세포의 꿀벌 왁스를 제거하고 부드럽게 부드러운 밀고 족집게와 번데기를 꺼내. 각 웰 아래 기관 조직의 이중층으로 24 웰 조직 배양 플레이트에 번데기로 이동.
    2. 출현 될 때까지 34 ° C, 70 % RH에서 항온 24 웰 조직 배양 판을 유지한다.
    3. 관찰과 번데기를 기록하고 그룹 9까지 각 그룹 (49 실험 일)를 위해 꿀벌을 등장.
      참고 : 각 치료는 네 생물 반복 있습니다.
  6. 통계
    1. 기록 데이터를 계산하고, 평균으로서 본± SD.
    2. 치료의 쌍 사이의 유의 한 차이를 분석하여 (예를 들어 0 PPM / 10 PPM 10 PPM / 100 ppm을 0 PPM / 100 PPM) 학생의 양측의 t -test를 사용하여 각 그룹이다. P - 값 <0.05처럼 통계적으로 유의 한 정의합니다.

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결과

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꿀벌 필드 시험, 여왕이 산란을위한 4 프레임 부에 한정되었다. 이 단계는 한 프레임에 무리 밀도를 증가시키고 이후의 관찰을 용이하게 할 수있다. 각각의 치료는 표시되었고, 꿀벌 '개발은 분명 투명 슬라이드를 통해 관찰되었다. 벌집 꿀벌 유충에 PPN-BLD의 생체 먹이 정확하게 콜로니에 꿀벌의 개발 PPN의 영향을 평가하기 위해 수행 하였다. 생체 공급 법을 사용하여 벌집에 화학적 처리의 영향의 관찰을 용이.

PPN-BLD의 각 복용량 오십 개 브루 셀의 총 표시하고 처리 하였다. PPN-BLD를 첨가 한 후, 처리 된 프레임들이 자연 상태에서 관찰 일본어 콜로니로 복귀 하였다. 애벌레 단계 꿀벌에 PPN-BLD의 부정적인 영향은 쉽게 obse했다rved. 투여 량에 의존하는 효과가 관찰되었다. 표 1은

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토론

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여왕 제한 알을 낳는 방법과 퀸 교환 방법은이 프로토콜 내에서 필드 테스트를 위해 꿀벌 그룹을 설정하기위한 중요한 단계이다. 여왕 제한 알을 낳는 방법은 꿀벌의 수명주기의 동기화를 가능하게한다. 그 결과, 연구진은 살충제의 서로 다른 용량으로 치료를 위해 같은 나이 1 일 된 유충을 선택할 수 있습니다. 퀸 교환 방법, 여왕이 부 A (4 개 프레임) 및 살충제 살충제 잔류 물의 영향을 평가하기위한 필드 테스트 꿀벌 상이한 발달 단계를 얻기 위해 B (5 개 프레임) 사이에서 교환 하였다. 또한, 선택된 브루 셀의 다수의 투명 표시를 위해 슬라이드를 사용하여 필드 테스트에 기록 하였다. 그러나 오버 누워 계란 가끔 산란 여왕에 대한 불충분 한 무리의 세포에서 발생합니다. 따라서, 빈 프레임의 제조는 퀸 교환법 요구된다. 또한, 여왕 제한 알을 낳는 방법은 또한에 사용될 수있다벌집에서 테스트를 위해 다른 꿀벌 그룹을 준비합니다. 파트 A의 2 프레임 부 (7 개) B의 프레임으로 프레임 분리 부 A (2 개 프레임)의 퀸의 위치...

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공개 사항

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 부여 105AS-13.2.3-BQ-B1 교육부에서 동물의 국과 식물 건강 검사 및 검역, 농업위원회, 집행 위안 그랜트 103-2313-B-197-002-MY3에서에 의해 지원되었다 과학 기술 (MOST)의.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
꿀벌 상자SAN-YI Honey FactoryW1266꿀벌 사육
여왕 제외 장치 (프레임 사이)SAN-YI Honey FactoryI1575여왕 한정 
퀸 excluder (상단)SAN-YI Honey FactoryI1566상단에 퀸 제한 
꿀벌 브러시SAN-YI Honey Factory, TaiwanW1414프레임의 꿀벌을 부드럽게 청소
꿀벌 피더SAN-YI Honey Factory, 대만P0219식민지에 설탕 시럽 공급
투명 슬라이드Wan-Shih-Chei, Taiwan (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40)1139프레임의 유충 영역 표시(재질: 폴리에틸렌 테레프탈레이트, PET) (크기 = 길이*너비*두께 = 29.7mm * 21mm * 0.1mm)
24 잘 tissu 문화 판광저우 제트기 생물 여과 Co., 주식 회사TCP011024적출에서 번데기를 기르
오토클레이브Tomin 의학 equipmenco., 주식 회사.TM-321멸균 증류수 탈이온수 제조(ddH2O)
P20 피펫맨GilsonF123600꿀벌 유충 식품 풀
인큐베이터에 PPN 추가 공급자:Yihder Co., Ltd.LE-550RD추출 후 번데기 사육
KimwipesCOW LUNG INSTRUMENT CO., LTD추출 후 번데기 사육
로얄 젤리국립 일란 대학교 (NIU)NIU기본 유충 다이어트 (BLD) 만들기
D-(+) - 포도시그마G8270기본 유충 다이어트 (BLD) 만들기D
-(-) - 과당시그마F0127기본 유충 다이어트 ( BLD)
효모 추출물CONDA, 프로나디사1702제조법 기초 유충 다이어트(BLD)
설탕대만 설탕 코포레이션E01071010꿀벌 사료용 설탕 시럽 제조
Pyriproxyfen (11%)LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD.등록 제 1937 호실험에 사용된 곤충 성장 조절제(IGR)
기 KCS34155 당 법

참고문헌

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