방법 논문

식물은 아이스 친화 정제를 사용하여 얼음의 재결정 억제 및 절연의 평가를 통해 단백질을 아이스 결합의 식별

DOI:

10.3791/55302

⸱

2017년 5월 5일

 ,  , 
1Department of Biology, Queen's University, 2Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 3School of Environmental Sciences, Queen's University

이 논문에서

요약

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이 논문은 얼음 재결정 억제 활성과 얼음 화성 정제를 사용하여 원시 IBPS의 후속 분리의 평가를 통해 동결 내성 식물 얼음 - 결합 단백질의 동정을 설명합니다.

초록

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얼음 - 결합 단백질 (IBPS)이 영하의 온도에 노출 특정 미생물에 의해 합성되어 스트레스 - 유도 단백질의 패밀리에 속한다. 세포 외 얼음 결정이 성장하면 식물에서 동결 손상은 세포막 가능한 세포 죽음의 파열의 결과로 발생합니다. 얼음 결정으로 IBPS의 흡착되어 세포 손상을 감소 얼음 재결정 억제 (IRI)으로 알려진 공정에 의해 상기 성장을 제한한다. IBPS은 평형 융점 이하 용액, 열 이력 (TH) 활성 알려진 속성의 빙점을 누를 수있는 능력을 입증한다. 이러한 보호 특성으로 인해, 산업, 의료 및 농업 분야에서 자신의 잠재적 인 사용에 새로운 IBPS의 식별에 대한 관심을 제기했다. 이 논문은 1 내지 IBPS 공장의 식별) 유도 추출 IBPS의 식물 조직에서, 2) IRI 활성에 대한 스크리닝 추출물, 3)을 정제 및 분리를 설명IBPS의 가스화. 낮은 온도에 노출하여 IBPS 유도 후, 추출물을 표준 광학 현미경을 이용하여 얼음 결정 성장을 관찰 할 수있는 '플랫 분석'을 이용 IRI 활성에 대해 시험된다. 이 분석은 낮은 단백질 농도가 필요하며 빠르게 수득 쉽게 얼음 결합 활성의 초기 화면을 제공하고, 해석 결과를 생성한다. IBPS이어서 '얼음 화성 정제'이라는 기술을 통해 얼음을 흡착 IBPS의 속성을 이용하여 단백질을 오염으로부터 격리 될 수있다. 식물 추출물에서 수집 한 세포 용 해물을 사용하여, 얼음 반구 천천히 황동 프로브에 성장시킬 수있다. 이는 다결정 얼음의 결정 구조에 IBPS를 통합합니다. 아니오 IBP의 선험적 생화학 적 또는 구조적 기술을 요구하는이 방법은 단백질의 활성 회복을 허용한다. 아이스 정제 단백질 분획 격려의 식별을 포함하여 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다질량 분석 및 천연 단백질의 생화학 적 분석에 의한 조수 시퀀스.

서론

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ICP (Ice-binding proteins)는 식물 1 , 곤충 2 , 어류 3 , 미생물 4 등 여러 유기체에서 발견 된 다양한 보호 단백질 군입니다. 이 단백질의 핵심 특징은 얼음 결정에 특이하고 효율적으로 흡착되어 성장을 수정하는 독특한 능력입니다. IBP는 몇 가지 문서화 된 성질을 가지고 있는데, 가장 잘 특징 지어지는 두 가지는 열 히스테리시스 (TH)와 얼음 재결정 억제 (IRI)입니다. TH 활성은 동결 - 내성이없는 동물에서 생산 된 IBP에서보다 쉽게 ​​관찰된다. 이 활동으로 인해 동결을 방지하기 위해 유기체의 순환 또는 간질 유체의 응고점이 낮아집니다. 대조적으로, 영하의 온도에서 필연적으로 동결 될 동결 내성 유기체에서, IBPs는 TH 활성이 낮게 나타난다. 낮은 TH 활동에도 불구하고, 얼음 울기를 제한하는 높은 IRI 활동STAL 성장은 종종 이러한 단백질과 관찰된다. 동결 내성 미생물의 경우,이 IRI의 활동은 아마도 세포 외 구획 얼음의 조절되지 않는 성장 세포를 보호하는 데 도움이됩니다.

은 "매트리스 버튼"모델 IBPS 얼음 결정 ....

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프로토콜

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1. Splat 장치 설정

  1. 온도 조절이 가능한 순환 수 욕조에 에틸렌 글리콜 (물 50 % v / v)을 채우십시오.
    참고 : 녹색 자동차 용 에틸렌 글리콜을 사용할 수 있습니다.
  2. 외부 챔버를 조립하려면 단열 플라스틱 튜브를 사용하여 수조를 이중벽 유리 그릇에 부착하십시오. 유리 그릇을 폴리스티렌 폼으로 절연시키고 플라스틱 페트리 접시 뚜껑으로 덮으십시오. 광원이 유리 챔버를 통해 볼 수 있도록 폴리스티렌 챔버의 바닥에 3-4 인치 구멍을 자르십시오.
  3. 카메라 포트와 10X 안구 렌즈와 4X 편광 객관적인 렌즈가 장착되어 해부 현미경에 외부 챔버를 탑재하십시오. 외부 챔버 바닥에 편광 필름을 추가로 놓습니다.
  4. 레토르트 스탠드 위에 1-1.5m 튜브 (직경 ~ 5cm)를 클램핑하고 레토르트 스탠드의 바닥에있는 튜브 아래에 위치한 냉각 블록과 함께 대형 폴리스티렌 컨테이너 안에 넣으십시오.

기본 단백질 2. 준비 IRI 분석을위한 추출

  1. 낮은 조명 조건 (6 시간 광 / 18 시간 어둠)에 따라, 4 ° C에서 최대 1 주 동안 동결 내성 잔디 나 기타 동결 - 내성 식물 종, 저온 적응 식물 IBPS의 발현을 유도한다. 이것은 이....

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결과

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셋업의 편의를 위해, 그림 1과 도 2는 각각 IRI 분석 얼음 화성 정제에 사용되는 장비의 시각적 표현을 포함한다. IBPS와없이 겨자 식물로부터 수집 된 추출물을 사용 IRI 분석 결과는도 3에 도시된다. 이러한 결과는 동결 허용되지 겨자 잡초에서 수집 추출물이 때문에 IBPS 존재의 부족으로 얼음 결정 성장을 제한 할 수 없습니다 것을 보여준다. 대조적으로, 작은 아이스 결정은 트랜스 제닉 식물은 실질적 얼음의 결정 성장을 제한 다년생 라이 그래스로부터 IBPS을 함유하는 볼. 도 4는 정제의 두 라운드 후에 IBPS 표현 다년생 라이 그라스 추출물을 이용하여 성장 된 얼음 반구를 나타낸다. 정제의 첫번째 라운드 고차 .......

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토론

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IBPS의 성공적인 분석 및 정제를 들어,이 단백질의 일부의 온도에 민감한 특성을 이해하는 것이 중요합니다. 특정 식물 IBPS는 전개, 침전 및 활동의 결과로, 0 ° C 이상의 온도에서 불안정해질. IBPS 활성을 얻기 위해서는 식물은 냉장실 (~ 4 ° C)에서 처리되고, 샘플은 실험하는 동안 얼음에서 유지되는 것이 종종 중요하다. 전체 셀 원유 해물을 사용하여 내생 단백질 분해 효소에 의한 단백질의 분해가있을 때 또 다른 요인은 고려해야합니다. 식물에서 IBPS의 표현은 일반적으로 낮고, 따라서 단백질 수율 손실은 향후 실험 또는 분석을위한 불충분 한 물질이 발생할 수 있습니다. 신뢰할 수있는 프로테아제 억제제 칵테일의 추가와 함께, 단백질 추출하는 동안 신속하게 작업 단백질의 손실을 줄일 수 있습니다. 또한,이 추위에 적응 기간이 실험실 성장의 IBPS의 가장 큰 축적에 최적화하는 것이 중요합니다식물.

IBPS 작업 또 다른 일반적인 문제는 분석의 대부분은 온도와 습.......

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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이 작품은 VKW에 NSERC (캐나다) 부여에 의해 투자되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 마이크로 원심분리기Fisher05-408-129
조절 가능한 실험실 잭FisherS63080
벤치탑 원심분리기Desaga MC2
황동 프로브맞춤형
카메라/카메라 포트CanonCanon Power Shot SX110 디지털 카메라; 맞춤형 현미경 포트
치즈클로스 Purewipe/Fisher Scientific06-665-25A
농축 튜브(0.5 mL)EMD MilliporeUFC501008
농축 튜브(15 mL)EMD MilliporeUFC900308
원뿔형 튜브(50 mL)Thermo FisherAM12502
냉각 블록VWR13259금속 가열 블록 사용
제습기Whirlpool50 파인트 에너지 스타 제습기; 현지 공급업체로부터 구매
Dessciation beadst.h.e. Dessicant/VWREM-DX0017-26-8 메시 크기; 100% 해
부 현미경Olympus Tokyo
이중 벽 유리 그릇일반현지 실험실 유리 공급 업체에서 구매
드라이 아이스Generic현지 공급 업체 사용; 위험한 
EDTA-프로테아제 억제제 정제Sigma Aldrich11836170001Roche cOmplete mini
에틸렌 글리콜GenericGreen 자동차 에틸렌 글리콜은 모든 지역 철물점(i.e. Home Depot)에서 구입할 수 있습니다.
HexaneSigma Aldrich296090무수, 95%; 위험한
침지 오일Sigma Aldrich56822
JA10/20 원심분리기Beckman
대형 플라스틱 페트리 접시일반
액체 질소일반공급 업체; 위험한 
자기 교반 플레이트Hanna InstrumentsHI190M
현미경 커버 슬라이드Fisher12-542A
플라스틱 튜브일반현지 철물점에서 PVC 파이프 구매
편광 필름Edmund Optics43-781
폴리스티렌 폼일반폴리스티렌 배송 상자에서 구성 가능
Poreclain 모르타르 및 유봉FisherFB961
PVPPSigma Aldrich77627110 µ m 입자 크기
레토르트 스탠드Fisher12-000
소형 교반 막대Fisher14-513-51
온도 프로그래밍 가능한 수조VWR13271-118
진공 그리스Dow Corning/Sigma AldrichZ273554
비닐 튜빙일반
현지

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sidebottom, C., et al. Heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256(2000).
  2. Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
  3. Davies, P. L., Hew, C. L.

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재인쇄 및 허가

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