Method Article

방법은 3D로 재배 원주민 소장과 카코 2 세포에서 상피 전송 단백질의 기능과 발현을 연구하는

DOI:

10.3791/55304

⸱

March 16th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D.

One of the authors' names was corrected from:

Arivarasu N. Anabazhagan

to:

Arivarasu N. Anbazhagan

Summary

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우리는 3 차원으로 성장 카코 -2 세포를 시험관 내 세포 배양 모델 및 마우스 창자의 생체 모델을 이용하여 장내 세로토닌 운반체 (SERT) 기능과 발현의 조절을 연구하는 간단한 방법을 설명한다. 이러한 방법은 다른 상피 수송의 연구에 적용 할 수있다.

Abstract

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장 상피 세포는 이물질에 대한 장벽을 제공하면서 신체의 정상적인 생리 기능에 중요한 역할을 중요 전송 및 장벽 기능이 있습니다. 손상된 상피 전송 (이온 영양 또는 약물)는 많은 질환과 관련되어 있으며, 상피 무결성 및 장내 마이크로 바이 영향으로 같은 컨베이어의 정상적인 생리 학적 기능을 넘어 연장 결과를 가져올 수있다. 기능 및 수송 단백질의 조절을 이해하는 것은 개선 된 치료 적 개입의 발전을 위해 중요하다. 상피 수송의 연구에서 가장 큰 문제는 네이티브 장 상피 세포의 중요한 기능 되풀이되었습니다 적합한 모델 시스템을 개발하고있다. 예컨대 카코-2, T-84, 및 HT-29 세포 Cl.19A 여러 시험 관내 세포 배양 모델은 일반적으로 상피 전송 연구에 사용된다. 이 세포주는 전자를 모델링에 환원 접근 방식을 나타냅니다pithelium 및 상피 미생물 작용들의 검사를 포함한 다양한 역학적 연구에서 사용되어왔다. 그러나, 세포 단일 층 정확하게 세포 - 세포 상호 작용과 생체 내 미세 환경을 반영하지 않습니다. 3D에서 자란 세포는 약물 투과 연구 모델 유망한 것으로 도시 하였다. 우리는 3 차원의 카코 -2 세포는 상피 수송을 연구하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 카코 2 세포 연구는 세포 특정 효과를 배제하고 계정에 기본 대장의 복잡성을 다른 모델로하고 있습니다 것이 중요하다. 여러 방법들이 이전에 이러한 절연 상피 세포 또는 절연 세포막 소포에 everted SAC와 같은 흡수 수송의 기능을 평가하기 위해 사용되었다. 모델에 대한 및 수송 기능의 측정을 고려하여 현장에서 문제를 가지고, 여기에서 3D 카코 -2 세포 성장과 같은 Ussing 챔버의 사용을 설명하기위한 프로토콜을 보여효과적인 접근법은 그대로 편광 장내 상피 같이 세로토닌 수송을 측정한다.

Introduction

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장 상피 세포는 루멘에 유체의 분비 및 이온 다양한 수송 단백질 (채널, -ATPase를, 공동 운송 및 기) 영양소, 전해질의 흡수에 이르기까지 다양한 기능을 수행하고, 마약을 갖추고있다. 수송 단백질이 방식의 vectorial 이온 또는 분자의 이동을 허용하는 전기 화학적 구배를 생성한다. 이것은 편광 상피 세포의 정단 및 기저 세포막 반송 시스템의 비대칭 분포에 의해 달성된다. 또한, 인접하는 상피 세포 밧줄 단단한 접합부는 꼭대기 및 기저 멤브레인 도메인 사이 intramembrane 성분의 확산에 대한 장벽으로서이 과정에서 중요한 역할을한다. 네이티브 소장의 이러한 특징적인 기능을 흉내 낸 적합한 모델 시스템 (즉, 극성, 분화, 꽉 접합 무결성)은 능의 연구에 중요한상피 교통 시스템의 된 스위치들.

모델에 관해서는, 장 상피 전송 연구에 현재 사용되는 전형적인 세포주는 카코이 완전히 분화의 모델이다 소장 상피 세포를 흡수; 및 T-84 세포 또는 HT-29 서브 클론, 토굴에서 파생 된 큰 장 상피 세포 하나의 모델. 통상적으로, 이러한 세포 라인은 플라스틱 표면에 단일 층 또는 코팅 된 트랜스 웰 인서트에서 재배된다. 어느 정도 트랜스 웰 세포 배양 인서트 편광 세포 basolaterally....

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Protocol

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젤라틴 단백질 혼합물에 성장 3D 카코 2 세포 배양 : 카코 2의 3D 문화 시스템에 소장 전송기 1. 연구

  1. 해동 성장 인자는 8 시간 동안 얼음에 젤라틴 단백질 혼합물을 감소 (또는 O / N) 4 ℃에서. 일단 1 mL를하거나 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 사용하거나 보관 500 μL 씩을, 해동.
  2. 문화의 날, 얼음에 문화 (RNA 및 단백질 추출을위한) 판 또는 (면역 염색 용) 챔버 슬라이드를 사전 냉각. 여덟 잘 챔버 유리 슬라이드 (또는 6 웰 플레이트의 웰 당 120 μL)의 각 웰에 젤라틴 단백질 혼합물의 30 μL를 추가하고 균일하게 확산. 과정에서 기포가 발생하지 않도록주의하십시오.
  3. (15) 37 ℃에서 세포 배양 용 인큐베이터 안에서 슬라이드 / 플레이트 플레이스 - 30 분, 젤라틴 단백질 혼합물을 응고 할 수있다.
  4. 젤라틴 단백질 혼합물이 응고하는 동안, 카코 -2 세포의 합류 플라스크를 Trypsinize.
  5. 수를 계산세포의 5 분 탁상 원심 분리기 500 XG에서 그들을 스핀. 필요한 3D 카코이 배지에서 세포 펠렛을 다시 일시.
  6. (플레이트 잘 당 20,000) 잘 4,000 세포에서 유리 챔버 슬라이드를 시드. 세포를 37 ℃에서 5 % CO

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Results

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3D 카코 2 낭종의 면역 염색은 그림 1과 같다. 팔로이 딘의 굴지 염색 차원 낭종에 잘 경계가 루멘을 나타내는 XY 평면의 대표적인 이미지는도 1a에 도시되어있다. 루멘에 직면 측면은 혀끝의 측면이다. 강력한 상피 표현형의 3D 환경의 결과에서 배양 상피 세포. 액틴과 SERT 공동 염색 하루 12에 다른 카코 2 낭종은 그림 1B에 표시됩니다. XY 평면 (도 1a에 도시 된 평면과 다른)이 표현에서, SERT 염색 서브 정점 염색과 함께 주로 내강 막에서 볼 수있다. 도 2는 12 일째의 postplating에서 단층으로 성장 카코 -2 세포에 비해 SERT 단백질 수준 3D 낭종에서 높은 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 카코 2 세포의 3 차원 문화 노나 모방 신호 이벤트를 트리거 수 있음.......

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Discussion

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장내 트랜스 10, 11, 12, 13, 14, 15 공부 상피 단층 편광으로 완전히 분화 카코 -2 세포 단층을 광범위하게 사용되어왔다. 그러나, 장 상피 세포의 생체 조직을 모방하는 3 차원의 카코 -2 문화의 발달에 상당한 관심이 있었다. 장 상피 세포에 대한 3 차원 세포 배양 모델의 수는 최근 원시 세포 - 세포 및 세포 - 세포 외 기질 (ECM)의 2D 시스템 (16)보다 큰 생체 적합성과의 상호 작용을 모방 개발되었다. 따라서, (예를 들면 라미닌, 콜라겐 IV 및 헤파린 설페이트 프로테오글리칸과 같은) 공통의 요소를 포.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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원고 편집과 교정에 도움을 주신 RKG 연구실의 MD/PhD 학생인 Christopher Manzella 씨에게 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x PBSATCCATCC를 참조하십시오. HTB&샤이; 37&트레이드;셀
10x PBSCarl Zeiss마이크로소프 for confocal Imaging
3[H]-5-HT LabtekII152453현미경 검사용 세포 배양
5-HT Gibco70013-032유해 물질 아님
95% O2- 5% CO2 실린더KPL71-00-27유해 물질 아님
한천 (한천 플레이트용)FischerBP151-100급성 독성, Ora
한천 (전극용)SigmaG7126-1KG유해 물질 아님
Alexa Fluor PhalloidinSigmaC3867-1VL유해 물질 아님
소 혈청 알부민 (BSA)SigmaP6148-500G삼키거나 흡입하면 유해
CaCl2LifeTechnologiesA12380유해 물질 아님
Caco-2 CellsSigmaA8806-5G유해 물질 아님
Cell lysis BufferFischerBP337-100Not a a 유해 물질
Chabered 슬라이드SigmaS5886-1KG유해 물질 아님
콜라겐 1형 용액SigmaS8045-500G
전극SigmaS-0876
EMEMGibco by Life Technologies25200-056
소 태아 혈청(FBS)Corning356234세포외 기질로 사용
플루옥세틴Qiagen74104
겐타마이신ATCC30-2003세포 배양 매체
글리신세포 신호전달, Danvers, MA
Hepes Roche11836145001
IndomethacinGibco by Life Technologies15070-063
K2HPO4Gibco by Life Technologies15710-064
KOHGibco by Life Technologies15630-080
L-아스코르빈산 생명 과학의 Gibco10082147
액체 섬광 카운터 Gibco by Life Technologies70013--032
LSM710 MetaPhysiologic Instruments, 샌디에고, 캘리포니아 EM-CSYS-8
MannitolPhysiologic Instruments, 샌디에이고, CA P2304
MatrigelPhysiologic Instruments, 샌디에이고, 캘리포니아 VCC MC8
MgCl2Physiologic Instruments, 샌디에이고, 캘리포니아 DM MC6
멀티채널 전압/전류 클램프생리학적 기기, 샌디에고, 캘리포니아 P2300
NaCl생리학적 기기, 캘리포니아주 샌디에이고 P2023-100
NaClFisher Scientific, Hampton, NHBP1423
NaHCO3Sigma-Aldrich, St Louis, MOS5886
일반 염소 혈청(NGS, 10%)Fisher Scientific, Hampton, NHS233
파라포름알데히드(PFA)Sigma-Aldrich, St Louis, MOP288
Pen-StrpSigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리C3881
단백질 분석 시약시그마-알드리치, 세인트루이스, MO10420
단백질분해효소 억제제 칵테일메독스, 시카고, 일리노이주;스타일 G- 12300
RNA 쉬운 미니 키트Sigma-Aldrich, St Louis, MOM4125
단일 채널 전극 입력 모듈 Sigma-Aldrich, St Louis, MOA92902
스냅웰 챔버용 슬라이더Sigma-Aldrich, St Louis, MOH9523
인산나트륨(Na2HPO4)Sigma-Aldrich, St Louis, MOF132
수산화나트륨(NaOH)Sigma-Aldrich, St Louis, MOT7039
TGF-β 1Perkin-Elmer,Waltham, MANFT1167250UC
Triton X-100Packard Instruments, Downers Grove, ILB1600
Trypsin EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO221473
Tween-20Bio Rad Laboratories, Hercules, CA5000006
Ussing Chamber (챔버 전용)Sigma-Aldrich, St Louis, MOI7378
Ussing 챔버 시스템Sigma-Aldrich, St Louis, MOA1296
함 주

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
  2. Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. B....

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Caco 2 Cells3D CultureUssing ChamberSerotonin TransportEpithelial TransportIntestinal EpitheliumSERT ProteinWestern BlotImmunofluorescenceCell Culture

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