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방법 논문

Solea Senegalensis 정 충에 반응성 산소 종의 세포내 위치 평가

5.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55323

⸱

2018년 3월 11일

 , 
1Department of Molecular Biology, University of León, 2INDEGSAL, University of León, 3Planta de Cultivos el Bocal, Spanish Institute of Oceanography (IEO)

이 논문에서

요약

이 프로토콜 H2O2 지역화 Solea senegalensis 정 충을 사용 하 여 민감한 형광 색소 DCFH 다 선생님, 미토 콘 드리 아에 대 한 라이브 미토 콘 드리 아 얼룩 DAPI 핵에 대 한 내 검색에 대 한 자세한 방법을 설명 합니다. 시각화, 각각. 프로토콜은 신선한 또는 해 동 정 충으로 2 시간 내에서 수행 하도록 설계 되었습니다.

초록

산화 스트레스는 감소 하는 정자의 품질에 중요 한 요소 중 하나입니다. 어떤 종에서 높은 중요성의 이다 정 충에 반응성 산소 종 (선생님)을 탐지 하기 위한 효율적인 프로토콜을 개발 하지만 이러한 메서드는 거의 사용 하 고 덜 teleost에. Cryopreservation은 유전자 은행을 포함 하 여 다른 목적에 대 한 양식 업에 유용한 기술 이며 연중 정자 가용성을 보장 합니다. 냉동/해 동 절차 선생님 생산을 일으킬 수 있고, 정자 세포 손상. 고려는 예비 손상 선생님 생산의 과잉 발생할 수 그들의 지역화, 여기에 따라 정 충에 H2O2 를 감지 하 고 그것의 세포내 지역화 confocal 현미경 검사 법에 의해 평가 하는 상세한 방법론 제공 됩니다. 이 위해 3 형광 (2, 7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-다), 라이브 미토 콘 드리 아 얼룩 및 4, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI))의 조합2 H2O의 공동 지역화를 평가 하 되 정 충 핵 이나 미토 콘 드리 아 Solea senegalesis 정자 샘플에.

서론

정자 품질 반응성 산소 종 생산 연결 되었습니다 최근1. 미토 콘 드리 아에서 선생님 생산 정상적인 생리 적인 과정 이라고 여겨질 수 있다, 비록 선생님 생산의 과잉에 의해 산화 스트레스 서로 다른 수준에서 정 충에 손상의 명확한 원인입니다. 인간에서는, 산화 스트레스는 남성 불 임, 운동 성 및 capacitation2;을 능력 변경 관련 포유류에서 냉동된 정자 샘플에서 DNA 무결성의 변화는 H2O23의 합성에도 관련 되어있다.

Cryopreservation은 유전자 은행 양식 업에 대 한 일반적인 기법입니다. 이 기술은 Solea senegalensis같은 생식 문제 종에서 특히 중요 하다. 시장에서이 귀중 한 종 구 혼의 부족으로 인해 포로에서 태어난 개인 생식 기능 장애를 보여줍니다. 이 사실은 정자 cryopreservation 인공 수정 위한 정자 가용성 필요 합니다. 그러나, cryopreservation 연구 항 산화 보충의 유익한 효과 보고 있다 정 충4 해로운 수 있는 산화 스트레스의 원천이 될 수 있습니다. 선생님 억제 대상으로 미토 콘 드 리아 산화를 통해 소문에 하면 정자 cryopreservation 노란색 메기5에 대 한 유익한 했다.

따라서, 정자 샘플에서 선생님의 수준을 알고, 특히 cryopreservation6,7 후 있기 때문에 이러한 분자 정자 생존 및 다 산8에 대 한 단점으로 인정을 받고 있다 중요 하다. 또한, 셀 내에 선생님의 배급을 공부 하 고 손상의 정도 추정 하는 것 중요 한 수 있습니다. 예를 들어, 정상 및 정자 기능, 호환 되는 미토 콘 드리 아에서 선생님의 낮은 수준의 추측 될 수 있지만 핵 내 선생님의 높은 수준의 정 충 DNA 손상의 지표 수 있습니다. H2O2 는 미토 콘 드리 아에서 나올 수 있는 작고 충전 없는 분자9이기 때문에 핵을 관통 하는 가장 관련성이 높은 선생님 중 하나입니다. Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-다) 특히 녹색 형광을 방출 하는 세포내 과산화물을 밝힐 수 있다. 이 문서에서는, Solea senegalensis 정자 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 H2O2 세포내 지역화를 탐지 하기 위한 상세한 프로토콜 제공 됩니다.

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프로토콜

참고: 형광 색소 외피와 confocal 분석 컨트롤 및 치료 샘플에 대 한 2-3 h 이상 소요 됩니다. 데이터 처리는이 시간 계산에 포함 되지 않습니다. 필요한 재료는 재료의 테이블에서에서 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜은 신선한 또는 cryopreserved 정 충에 적용할 수 있습니다. Solea senegalensis 냉 수, 차가운 조건 (4-7 ° C)에서 항상 작업에서에서 생성 하는 어 종입니다. 프로토콜의 일반적인 보기에 대 한 그림 1 을 참조 하십시오.

1. 실험 하기 전에 준비 작업

  1. 1mm 미토 콘 드리 아 얼룩 분석 학년 DMSO 재고 솔루션을 준비 합니다.
  2. 4 ' 1 μ g/mL, 이온된 수에서 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) 재고 솔루션을 준비 합니다.
  3. 200 mOsm/kg 벨 솔루션 (116 m m NaCl, 2.9 m m KCl, 1.8 m m CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.7) 준비
  4. 4 m m 2 ', 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-다) 재고 솔루션 분석 학년 메탄올에서 준비 합니다.
    참고:-20 ° C까지 필요에서 aliquots에 재고 솔루션을 유지.
  5. 4-7 ° c.에 있는 microcentrifuge를 설정

2. 형광 색소 부 화 하기 전에 샘플 준비

참고: 정 충의 부드러운 처리 때 바람직한 pipetting 및 resuspending.

  1. Cryopreserved 셀 작동, Solea senegalensis 정 충1040 ° C에 녹고 물 목욕 준비. 7 물 목욕에 짚 샘플을 담가 s.
  2. 잘라가 위를 사용 하 여, 샘플 microfuge 관으로 빈 하 고 1000 x g, 1 분에 4-7 ° C에서 원심.
  3. 정액 플라스마 또는 cryoprotectants와 정액 플라스마 cryopreserved 샘플에서 pipetting 얼룩 프로토콜을 방해할 수 있는 모든 구성 요소를 삭제 하 여 제거 합니다.
  4. 4 ° C 200 mOsm/kg 벨 솔루션의 50-100 μ 셀 resuspend
  5. Neubauer 또는 입체 현미경 비슷한 세 챔버 정자 농도 결정 합니다.
  6. 1-4 ° C 벨 솔루션에에서 0.5 mL의 최종 볼륨에서 106 셀/mL x 2를 세포 현 탁 액을 희석.

3. 형광 색소 인큐베이션

참고: 형광 특히 솔루션에서에서 낮은 조명 조건에서 처리 되어야 합니다.

  1. DCFH-다 재고 솔루션의 3.125 μ 추가 (샘플에서 최종 농도: 25 μ M) 작업 샘플 희석을. 어둠10에서 40 분 4-7 ° C에서 품 어.
  2. 30 분 후 DAPI 재고 솔루션의 0.5 μ 추가 (샘플에서 최종 농도: 2 μ M) 및 재고 솔루션 얼룩은 미토 콘 드리 아의 0.5 μ (샘플에서 최종 농도: 100 nM) 샘플을. 어둠 속에서 10 분 동안 두 형광을 품 어.

4. 샘플 준비 Confocal 현미경 검사 법에 대 한

  1. 보육 시간 후 1000 x g, 1 분에 4-7 ° C에 세포 현 탁 액을 원심.
  2. Pipetting으로 상쾌한을 신중 하 게 삭제 합니다.
  3. 200 mOsm/kg 벨 솔루션의 10-20 μ를 추가 합니다.
  4. 집중된 세포 현 탁 액의 장소 5 μ 슬라이드에 드롭.
  5. 신중 하 게, 준비에 커버 슬라이드를 넣어 그것을 봉인 폴란드어와. 폴란드는 건조, 일단 준비는 confocal 현미경 검사 법에 대 한 준비.

5. 실험 전에 confocal 설치

참고: 현미경, 따라 DCFH 다 수 수 "점화". 먼저 비-귀중 한 샘플을 최상의 조건을 설정 합니다.

  1. 현미경, 레이저, 카메라와 현미경을 실행 하는 컴퓨터를 켭니다.
  2. 설정된 여기 레이저 각 형광 색소의 여기 및 방출 최대값을 고려:
    1. DAPI, 358의 여기 최대 사용 nm와 465의 방출 최대 nm.
    2. 미토 콘 드 리아 얼룩 사용 644의 여기 최대 nm와 662의 방출 최대 nm.
    3. DCFH-다, 504의 여기 최대 사용 및 525의 방출 최대 nm.
  3. 25 X 목표는 정 충에 초점 작업을 시작 합니다. 이 형광 색소는 높은 강도 보고 있기 때문에 초점 DAPI 채널을 선택 합니다. 셀의 초점을 맞추고 사용 하 여 63 X 또는 100 X 목표 철저 한 평가 위해 Solea senegalensis 정 충 크기 때문에 약 2 μ m.
  4. 각 채널에 대 한 최적화 pinhole, 이득 및 전압. 같은 방식으로 배경을 줄이기 위해 디지털 오프셋을 조정 합니다. 모든 매개 변수는 사용 하는 형광 색소에 대 한 최적화 설정을 저장. 단일에 대 한 일상적인 실험 Solea senegalensis 정자 세포 (이 매개 변수는 각 실험에서 변경 될 수 있습니다) 다음 사용: 1, 750 V의 이득 전압의 작은 구멍.

6입니다. 이미지 수집

  1. 이미지 수집에 대 한 원하는 품질 조건을 선택 합니다. 비트 깊이, 이미지 포맷, 빛 시트 두께, 수집 설정을 정의 하 고 단일 양면된 조명 선택 합니다. 단일에 대 한 일상적인 실험 Solea senegalensis 정 충 (이 매개 변수는 각 실험에서 변경 될 수 있습니다) 다음 사용: 프레임 크기 1024 픽셀; 16;의 픽셀 당 비트 스캔의 속도 2-4)입니다.
  2. 열고 시작 하는 필드의 이미지 스캔 영역을 가운데로.
  3. 자르기 도구를 사용 하 여 관심 영역을 선택 하 고 라이브를 누릅니다.
  4. 범위 표시기 도구의 도움으로 배경을 줄이기 위해 디지털 오프셋을 조정 합니다. 각 채널에 대 한이 작업을 수행 하 고 이미지를가지고.
  5. 각 형광 색소와 그들의 조합에 대 한 개별 채널의 품질을 확인 합니다.

7. 3D 이미지 비디오를 만들기

  1. Z-스택 수집 설정입니다.
    1. 소프트웨어에서 Z-스택 옵션을 선택 합니다.
    2. 단일 셀을 셀의 그룹 또는 관심 영역을 선택 하 고 그것을 집중.
    3. Z-스택 ' 첫 번째 조각 '과 ' 마지막 조각 ' 옵션으로 구분 하 고 정밀한 초점의 도움으로 0.2 µ m 간격 z 단계를 설정. 이 형광 색소는 높은 강도 보고할 수 있습니다 쉽게 전체 정 충 머리를 선택할 수 있기 때문에 초점 DAPI 채널을 선택 합니다. 각 채널에 대 한 최적의 인수 매개 변수를 선택 하 고 실험을 실행.
  2. Z-스택 실험을 실행 합니다. 채널을 분할 하 고 각 신호는 세포 내에서 지역화 합니다.
  3. Z-스택 프로세스입니다.
    1. 볼륨 렌더링: 실험 완료 되 면 Z 스택 처리 소프트웨어의 옵션을 선택 하 고 볼륨 렌더링 옵션을 선택 하십시오. 단계와 회전도 (360 °)의 수를 선택 합니다. 비디오 확장명으로 파일을 저장 합니다.
    2. 스테레오 입체 사진: 옵션에서 스테레오 글리프를 선택 프로세스 창. 이 도구는 분할 채널 비디오 3D 이미지를 만들 수 있습니다.

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결과

Confocal 현미경 검사 법 teleost 정자에서 세포내 선생님 평가 위한 이상적인 방법입니다. 이 연구는 (그림 1)에 3 개의 형광 (DAPI 미토 콘 드리 아 얼룩, DCFH-다)의 조합 기초 연구에 적용 될 수 있으며 응용 프로그램에 사용 되는 절차를 개선 할 수 있는 많은 유용한 정보를 제공 합니다. 산업 양식 식물, cryopreservation 프로토콜 등입니다. 다른 유형의 분석 세포내 선생님 존재와 다른 매개 변수를 연결 하기 위해 실행 될 수 있습니다: 운동 성, 생존, 좋은 나쁜 종 축, 운동 성 또는 많은 다른 사람 사이 계절 정자 변이의 활성화 사이 다른 패턴. 현재 작업에는 정 충 내에서 세포내 H2O2 분산의 두 가지 서로 다른 패턴 같습니다: mitochondrion 또는 확산 핵 (그림 2, 3)에 배치. 그 정 ...

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토론

그것은 잘 알려진 미토 콘 드리 아는 정자의 운동 성 및 기능에 대 한 주요 세포입니다. 이러한 세포는 동시에 직접 선생님 생산에 참여 했다. 흥미롭게도, 선생님의 제어 수준은 적절 한 정자 기능1필요 합니다. 다 산과 산화 스트레스 사이의 긍정적인 관계 포유류11 에 표시 되었습니다 하지만 과도 한 수준에 영향을 미칠 정자 품질12. 긍정적 이거나 부정적인 효과로 결정 될 수 있는 하나의 중요 한 요소는 선생님 수준 뿐만 아니라 선생님 세포내 지역화입니다. 선생님의 해로운 효과의 한 DNA 손상9 생산 고 따라서 선생님의 핵 존재 반면 선생님 수준 미토 콘 드리 아에서 정상적인 수 핵에서 손상의 지표로 될 수 있습니다. 그것은 같은 선생님 세포내 지역화에 대 한 정보를 제공할 수 있는 confocal 현미경 검사 법 기술로 기존의 양적 방법(, cyt...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리 AQUAGAMETE FA 1205 비용 작업을 감사합니다. 이 작품 AGL201568330-c 2-1-R 프로젝트 (MINECO/페더)에 의해 재정적으로 지원 되었다. 데이비드 G. 발 카 르 세 드 의회에 의해 투자 되었다 카스 티 야와 레온 (EDU1084/2012)와 Fondo 사회 Europeo. 저자는 박사 아나 Riaza 및 Stolt 바다 농장 소화기, 닥터 폴 리 드 파스, 박사가 그 나 시오 마르티네스 몬테로 호세 라몬 Guiérrez 인정합니다. 우리 또한 videography 폴라 페르난데스 Colado 감사.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) 시그마-알드리치D6883
4&프라임;,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 시그마-알드리치D9542
CaCl2시그마-알드리치C1016 
컨포칼 현미경ZeissLSM800
커버 슬립Thermo Fisher Scientific12-541B
DMSO, 분석 등급Sigma-AldrichW387520
HEPESSigma-AldrichH3375
KClSigma-AldrichP9541
메탄올, 분석 등급Sigma-Aldrich34860
MitoTracker딥 레드 Thermo Fisher ScientificM22426
마이크로 원심분리기 (냉장)Thermo Fisher Scientific75002441
NaClSigma-AldrichS7653 
NeubauerchamberSigma-AldrichBR717810
슬라이드Thermo Fisher Scientific10143562BEF

참고문헌

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  2. Morielli, T., O'Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
  3. Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
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  6. Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
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  9. Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
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  11. Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
  12. Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).

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