방법 논문

측정 및 모델링 수축성 건조 인간의 각질층에

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⸱

DOI:

10.3791/55336

⸱

2017년 3월 1일

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Binghamton University

이 논문에서

요약

이 문서 공간적 엘라스토머 기판에 부착 된 원형 조직 샘플의 면내 건조 변위를 측정함으로써 확인할 동적 건조 거동 및 각질층의 기계적 특성을 정량화하는 방법을 설명한다. 이 기술은 건조 티슈 기계적 특성을 변경하는 방법을 다른 화학 처리 측정하는데 사용될 수있다.

초록

각질층 (SC)는 가장 표피 층이다. 외부 환경과의 접촉이 조직 층이 모두 클렌징 에이전트 및 주변 수분의 일일 변동에 노출되는 것을 의미한다; 이는 모두 조직의 수분 함량을 변경할 수있다. 심각한 장벽 기능 장애 또는 습도가 낮은 환경에서 수분 함량의 감소는 SC 강성을 변경 및 건조 스트레스의 축적을 일으킬 수 있습니다. 극한의 상황에서, 이러한 요인은 조직의 기계적 파열의 원인이 될 수 있습니다. 우리는 건조시 SC의 기계적 특성의 동적 변화를 정량화하는 고효율 방법을 확립했다. 이 기술은 건조 행동 변화 및 화장품 클렌저 및 로션 트리트먼트 SC의 기계적 특성을 정량화하기 위해 이용 될 수있다. 이것은 엘라스토머 기판에 부착 된 원형 조직 샘플의 공간 분해 면내 건조 변위의 동적 변화를 측정함으로써 달성된다. 면내 방사상 변위 ACQ건조시 uired은 방위각 평균 선형 탄성 수축력 모델에 기초하여 프로파일이 장착되어있다. 건조 스트레스와 SC 탄성률의 동적 변경 후 피팅 모델 정보로부터 추출 할 수있다.

서론

가장 외부 표피 층 또는 각질층 (SC)의 지질 풍부 매트릭스 (1, 2)에 의해 둘러싸여 응집 각질 세포의 세포로 구성된다. SC의 조성 및 구조적 무결성 미생물 침입을 방지하며, 기계적 힘 과도한 수분 손실 (4) 모두 정확한 저항 배리어 기능 (3)를 유지하기 위해 필수적이다. 유지 또는 피부 보호막 기능을 저하 퍼스널 케어 제품의 용량은 피부 건강 및 화장품 산업 5 중대한 관심사이다. 퍼스널 케어 제품의 일 출원은 SC 6, 7, 8의 기계적 특성을 변경하는 것으로 알려져있다. 예를 들어, 화장품 세정제에 포함되는 계면 활성제는 상당한 탄성률의 증가와의 축적을 일으킬 수조직의 성향을 증가 SC에서 건조 응력, 9, 7 균열합니다. 거의 모든 화장 용 보습제에 함유 글리세롤 SC 부드럽게 조직 파열 가능성을 감소 건조 스트레스 8, 10, 11의 형성을 감소시킬 수있다.

이 문서에 설명 된 방법은 동적 건조 동작 및 제어 환경 7 SC 건조의 기계적 특성, 8 정량화 할 수있다. 이전에, 이러한 기술은 동적 건조 행동 변화 및 SC 조직의 기계적 특성에 다른 화장품의 효과를 해명 할 수있는 것으로 입증되었다. 이것은 간단한 변위로 건조 피팅 부드러운 엘라스토머 기판에 부착 SC 인간 조직의 건조 - 유도 수축을 정량함으로써 달성된다수축성 모델 후 탄성률 추출 피팅 프로파일에서 건조 스트레스. 다중 SC 샘플 시험이 요구되는 경우,이 방법은 일축 tensometry에보다 신속한 대체가 훨씬 적은 조직을 이용하고 샘플 밑면에서 증발을 방지하여 더욱 중요한 생리 건조 제공 제공한다.

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프로토콜

면제 승인 (3002-13)는 CFR 46.101 (45)의 (b) (4) 부여했다, 드 식별 보건부에 따라 조직 샘플 복지부 규정을 사용하여 연구를 수행합니다. 전층 피부 과목 수술로부터 수신된다. 이 기사에서는 조직 소스는 66 세의 백인 여성 유방이다.

엘라스토머 코팅 Coverslips는 1. 준비

  1. 20 mL 유리 바이알에, 5.893 g의 염기 실 가드 184 경화제의 0.107 g을 혼합한다. 총 혼합물의 질량은 (55)의 에이전트 비율을 경화에베이스 6g : 1입니다.
  2. 균일 성을 보장하기 위해 유리 막대로 혼합 한 후, 모든 기포를 제거하는 진공 탈기 실과 상기 유리 바이알을 놓는다.
  3. 스핀 코터의 중심에 유리 커버 슬립 (55mm X 25mm)을 놓는다. 커버 슬립의 중심에 혼합물의 ~ 1 ML을 추가합니다. 가위로 잘라 끝으로 5000 μL 피펫을 사용합니다. 스핀 코팅 (60)의 2,000 rpm에서 커버 슬립.
    1. 이 페이지를 반복로웠 5-6 기판을 만들 수 있습니다.
  4. 60 ° C에서 12 시간 동안 오븐에서 커버 슬립을 치료.
  5. 부분적으로 희생 기판으로부터 엘라스토머 필름을 제거하는 면도날을 사용한다. 엘라스토머 필름과 노출 된 유리의 윗면을 표시 씻을 마커를 사용합니다.
  6. 거꾸로 현미경의 샘플 마운트 두 마크의 초점 평면 사이의 Z 높이의 차이를 기록하는 원격 포커스 부속품을 사용한다. 이 탄성체 기판 두께, H에 대응한다.

각질층 2. 준비

  1. 60 ° C의 탈 이온수에 반 (DW)로 채워진 유리 비커를 가열하여 수조 및 가열 교반 판을 사용한다. 생물 안전 캐비닛 내부, 4 분 동안 물에 전체 두께 인간의 피부를 체험.
  2. 즉시 DW 4 분 동안 10 ° C <냉각 넣은 비커에 넣고, 피부 샘플을 옮긴다. 비커를 작성 절반은 생물학적 물질의 튀는을 최소화.
  3. 구부러진 코의 조직 핀셋을 이용하여 표피를 분리 부드럽게 페트리 접시 비커 장소로부터 피부를 제거.
  4. 거즈 늘어선 페트리 접시에서 아래로 분리 된 표피에게 기부 쪽을 놓습니다. 기초 층이 완전히 거즈와 접촉해야합니다.
    1. 0.25 % (중량 / 부피) 실온에서 6-8 시간 동안 0.1 M 인산 완충 식염수에 용해 IX-S 돼지 췌장 트립신 솔루션을 입력에 거즈를 적시. 거즈 젖은 용기 만 충분히 트립신을 추가합니다.
  5. 조직 핀셋 거즈를 들어 올리고 부분적으로 DW로 채워진 용기에 떠. 조심스럽게 거즈에서 분리 할 수있는 SC 당깁니다.
  6. SC에 부착 된 상태로 유지 잔류 표피 조직을 제거하기 위해 DW에 각질층을 3 ~ 4 회 반복한다.
  7. DW에서 0.4 % 글리신 맥스 (대두) 트립신 억제제의 용액에 절연 SC 플로트. 10 분 동안 조직을 선동하는 판 쉐이커를 사용합니다.
  8. 부분적으로 배양 접시에서 SC 플로트DW 가득합니다. 10 분 동안 조직을 선동하는 판 쉐이커를 사용합니다.
  9. 실온에서 48 시간 동안 초 미세 플라스틱 메쉬 격리 SC 시트를 건조 (25 ℃, 40 % 상대 습도 (RH)).
  10. 메쉬에서 SC를 분리하고 원형 구멍 펀치를 사용하여 개별 원형 R = 3mm 반경 샘플을 잘라. 마크 지워지지 않는 마커를 사용하여 작은 나선형 마크 최 얼굴의 중심. 이는 SC의 윗면을 인식하기위한 시각적 큐를 제공합니다.
    주 : 씻을 수없는 마크가 건조 변형이 최소가 될 샘플의 중심에 적용되어야한다. 이것은 기록 된 건조 용량 프로파일에 대한 마커의 영향을 최소화한다.

3. 샘플 처리 및 증착

  1. 90 μL 형광 마커 비드를 함유하는 15 mL의 DW에서 30 분 동안 SC 샘플 교반 (515분의 505 nm의 직경을 1 ㎛, 카르 복실 레이트 - 개질 된). 이 예금은 SC 표면에 비즈
    참고 : 동안 리터의 증착SC의 비드 ARGE 번호, 그것은 계속해서 얻을 수있는 평면 변형 필드의 공간 해상도를 비드 (12)없이 본 샘플 가장자리 느린 건조 대해 최대화된다. 추가 비드 볼륨의 선택은 따라서 임시해야한다.
  2. SC 샘플을 제거하고 부분적으로 DW 가득 페트리 접시에 배치합니다.
  3. 부분적으로 15 ~ 30 °의 얕은 각도로 DW에서 기판을 담그지.
  4. 기판과 물 계면의 접촉 선에서 플로팅 SC 샘플의 가장자리에 핀. 세로 자연스럽게 주름이나 기포 혼입이없는 기판에 대한 SC 샘플을 적층 할 물로 기판을 회수.
  5. 단계를 반복 3.4 각 기판 상에 6 SC 샘플까지 배치합니다. 샘플 사이에 적어도 2 ~ 3 밀리미터 간격을두고 기판의 가장자리에 샘플 적층을 피하십시오. 이것은 또 다른 하나의 샘플에 영향을 미치는 건조 변위의 건조를 방지한다.
  6. 60 분 동안 실험실 조건에서 장착 SC 샘플을 건조시킵니다. 이는 SC와 기판 사이의 잔여 물이 증발 할 수 있으며, 전체 조직 유착을 보장합니다.
    주 :이 시점에서, SC 샘플 필요한 시간 동안 소망하는 용액에 상하 기판을 배치하여 화학적 또는 화장품 제제 (7, 8)로 처리 할 수있다. 처리 단계 회 반복 단계 3.6 행한다. 건조 후, 기판 SC 샘플들의 불완전 접착 투과광 현미경을 사용하여 확인 될 수있다. 사우스 캐롤라이나 샘플 또는 박리 가장자리 아래에 갇혀 거품은 잘 정의 된 가장자리와 샘플의 명확한 대비 변동을 형성 할 것이다.
  7. 부분적으로 밀폐 용기에 물이 가득 페트리 접시를 배치하여 습도 챔버를 만듭니다.
  8. 24 시간 동안 챔버 내로 배치 기판은 99 %의 상대 습도로 평형화한다. 페트르에 기판을 배치하지 마십시오나는 접시.

4. 현미경 환경 제어

  1. 현미경으로 장착 관류 챔버에 접속 된 조습 장치를 통해 환경 조건의 제어를 달성한다. 조습 장치 등의 상세 등 독일어로 제공된다. (2013) 7 리우와 독일 (2015) 8.
  2. 현미경에 기판을 탑재 기판 위에 관류 챔버를 배치하고, 진공 그리이스를 사용하여 엘라스토머 관류 챔버의 가장자리를 밀봉.
  3. 일단 장착, 사전 실험에 99 % RH 내부 공기를 평형. 이것은 이전의 실험에 물의 증발을 방지 할 수 있습니다. 섹션 5 또는 7의 영상이 시작되면, 원하는 값으로 내부 공기의 습도를 줄일 수 있습니다.
    참고 :이 기사에서는 SC 샘플은 25 % RH에 건조

비행기 건조 변위 5. 이미지

  1. 반전 microsco을 사용하여 SC 샘플의 이미지를 수집1X 대물 렌즈로 퍼가기. FITC 필터 (503-530 nm의 방출 대역 통과)와 광 엔진을 사용하여 형광 구슬을 자극. 여러 샘플을 자동 XY 스테이지를 사용하여 건조 걸쳐 순차적으로 묘화 될 수있다.
  2. 기록 형광등 1392 X 1040 픽셀의 해상도로 디지털 CCD 카메라를 사용하여 투과광 화상. 각 이미지의 시야는 전체 SC 샘플을 캡처하는 하나의 이미지를 허용 8.98 X 6.71 mm이다. 16 시간 동안 10 분의 주파수 이미지를 가져 가라.

두께 측정 6. 기판 준비

  1. 일부 작은 플라스틱 모자, 화학 흄 후드에서 1 mL로 실란 (≥98 % 3- 아미노 프로필 트리에 톡시 실란)를 배치합니다. 섹션 1과 5 시간 동안 밀폐 용기에서 뚜껑에서 엘라스토머 기판을 배치합니다. 기판 실란과 접촉 직접 제공 할 수 없습니다.
  2. 1.5 ML의 튜브 (≥99 % N 다이이 미드 염산염 - - (3- 디메틸 아미노) N) 5 EDC의 밀리그램을 추가합니다. 50 추가EDC에 DW 0 μL. 볼텍스 믹서로 10 초 동안 용액을 교반한다.
  3. 20 mL의 DW에 0.076 g의 붕산 나트륨 0.1 g의 붕산을 추가합니다. 70 ° C (1H)에 자기 교반기를 사용하여 혼합한다. pH가 7.4이 될 때까지 붕산을 추가합니다.
  4. 50 ML의 원심 분리기 튜브에 붕산 완충액 20 mL를 넣고. 보레이트 버퍼에 1 ㎛ 구슬 (575분의 535 nm의, 카르 복실 레이트 수정) 60 μL를 추가합니다. 마지막으로, 200 μL EDC 솔루션은 병의 추가합니다. 10 센티미터 직경 페트리 접시에 부어 다음 비드 솔루션을 혼합하기 위해 튜브를 흔들어.
  5. 컨테이너에서 silanated 기판을 제거하고 그들을 비드 솔루션들로 필름 측 엘라스토머 놓습니다. 포획되는 것을 거품을 방지하기 위해 천천히 마십시오. 두 기판은 각각의 페트리 접시에 맞게됩니다.
  6. 45 분 동안 비드 용액에 떠있는 기판을 둡니다.
  7. 다음, 비드 용액으로부터 기판을 제거 언 바운드 구슬을 제거하기 위해 DW에 씻어 핀셋을 사용합니다.
  8. 공기는 기판을 건조. 를 통해 압축 공기를 불어엘라스토머 필름 표면은 물 반점의 형성을 감소시킨다.
  9. SC 샘플 증착 될 때까지 구슬의 사진 표백을 방지하기 위해 불투명 한 상자에 기판을 밀봉합니다.

SC 7. 이미징 두께

  1. 그러나 부 (3)를 사용하여 기판에 예금 SC 샘플은 DW에 형광 구슬을 추가하지 않고 3.1 단계를 수행합니다. 또한 단계 3.6를 완료하기 전에 피펫 각 증착 SC 시료 표면에 희석 형광 마커 비드 용액 (515분의 505 내지 0.1 ㎛의 직경)의 5 μL 강하를 적용한다.
  2. 40X 대물 렌즈와 현미경을 사용하여 SC 두께의 측정을 설정합니다. 는 SC-기판 계면에있는 2 개의 비드 층 초점 평면 및 SC의 윗면 사이 Z 높이의 차이를 기록하는 원격 포커스 부속품을 사용하여 시간에 따른 SC 샘플의 두께를 측정한다.
  3. 3 시간 건조 기간 동안 각 SC 샘플 3 영역의 두께를 측정한다. 두께SC 샘플들의 현재 프레임 (8) 내에서 정상 값에 도달한다.

8. 정량화 및 모델링 조직의 변형

  1. 각 기록 시간 단계에서 형광 이미지에서 공간적으로 해결 평면 건조 변위를 얻기 위해 입자 영상 속도계 (13)를 사용합니다.
  2. 각각의 방사상 대칭 SC 샘플의 변위 필드에서 방위각 평균 반경 방향 및 방위각 변위 프로파일을 얻기 위해 MATLAB을 사용합니다.
    주 : 예를 들어 데이터 세트 (자격 'd.mat')이 단계와 단계 8.3을 모두 수행 MATLAB 코드 (권리 'PIV-processing.m')가 보충 정보를 제공하고있다.
  3. 수축 선형 탄성 circula로 건조 SC를 설명하는 모델 7, 8, 14, 15, 16 방사상 변위 프로파일에 맞는, E.는 SC 가정 탄성률 변형 가능한 탄성 기판에 부착 두께 시간 SC, 반경 R, 및 탄성률 E의 SC를 시변의 R 디스크가 잘 정의 된 일정한 포아송 비를 가지며, ν SC = 0.4 7 8. 최소 최소 제곱 방법을 사용하여 가장 적합를 얻습니다.
    참고 : 피팅에 사용되는 모델은 수정 된 베셀 함수의 관점에서 반경 방향 변위를 설명입니다 :
    figure-protocol-1 (1)
    와 figure-protocol-2 , figure-protocol-3 과 figure-protocol-4
    용어 figure-protocol-5 주어진 침투 깊이에 대응
    식.
    figure-protocol-7 기판 강성 파라미터를 나타내고; 유효 샘플 크기는 기판의 두께보다 큰 경우. 여기서, 파라미터 figure-protocol-8 과 figure-protocol-9 각각 기판 두께 포아송 비를 나타낸다. 실리콘 엘라스토머 기판 (17)의 푸 아송의 비 ν = 0.5이다.
  4. 모델 파라미터는 방사상 변위 프로파일 식 (1)에 맞는 최소 제곱 각 시간 단계에서 α와 β 얻었다.
    1. 식을 사용하여 SC 탄성률 E의 SC를 얻을 피팅 파라미터 β를 채택
      figure-protocol-10
    2. 수축 건조 헤어 구조 강화 시변을 얻었다 피팅 파라미터 α를 사용SS, PSC, 표현을 사용하여,
      figure-protocol-11

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결과

도 1 (a) 형광 비드 (3 부)로 코팅 SC 샘플의 대표적인 형광 화상을 도시한다. 샘플의 상응하는 투과광 화상 (b)로 인해 샘플의 원형 대칭으로 25 % RH에서 16 시간 건조 후에 형성 공간 분해 건조 변위 떨림 플롯 겹쳐 1도에 도시되며,이 변위는 방위각 될 수 평균. 그림 1의 (c) 및 방위각 (U θ, 파란색 파선) 변위 프로파일은 차원 반경 위치, R / R에 대해 도시 (u는 R, 고체 레드 라인) 반경을 보여줍니다. 여기서, R은 R / R = 0 에지를 나타내며 샘플 중심 및 R / R = 1을 나타내고, 평균 SC 시료 반경을 나타낸다. 각 반경 위치에서의 표준 편차가 평균 주위에 음영 영역에 의해 표시된다. 이러한 변동은 주로 SC (3)의...

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토론

이 문서에서는 동적 건조 동작과 인간 SC의 기계적 성질을 측정하는데 사용될 수있는 기술을 설명한다. 이전의 연구는 이러한 기술은 일반적 SC (7, 8)의 동적 거동에 건조 화장품 클렌저 및 보습제로 사용되는 환경 조건 및 화학 제품의 영향을 정량화하는데 사용될 수 있다는 것을 증명하고있다. 프로토콜의 주요 단계가 있습니다. 우선, SC 물 함량, 특히 팽윤; 따라서, SC 두께뿐만 아니라 면내 변위 측정 정밀도 탄성률 예측 스트레스 정도 건조 필수적이다. 둘째로, 시료가 완전히 기판에 부착 할 필요가있다. 그들은 매우 건조 변형의 분포에 영향을 미칠 것이며, 반경 방향 변위 정보를 사용하기 때문에 불완전한 접착, 비 방사상 대칭 샘플 또는 작은 구멍이나 눈물 시료 피해야모델 피팅 라.

조습 장치를 사용할 수없는 경우,이 기술이 사용될 수있다. 환경 제어하지 않고, 조직...

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공개 사항

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감사의 글

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
실리콘 엘라스토머 베이스Dow-Corning1064291
실리콘 엘라스토머 경화제Dow-Corning1015311
FluoSpheres Carboxylate 0.1 &마이크로; M 옐로우 그린 형광 505/515 Thermo FisherF8803
FluoSpheres 카르복실레이트 1 &마이크로; M 옐로우 그린 형광 505/515 Thermo FisherF8823
FluoSpheres Carboxylate 1 &마이크로; M 나일 레드 형광 535/575 Thermo FisherF8819
돼지 췌장에서 추출한 트립신Sigma-AldrichT6567
트립신 억제제 II-s형Sigma-AldrichT9128
(3-aminopropyl)triethoxysilaneSigma-Aldrich440140
사붕산나트륨Sigma-Aldrich221732
붕산Sigma-AldrichB0294
인산염 완충 식염수시그마-알드리치P7059
N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 염산염시그마-알드리치E7750
볼텍서 믹서VWR58816-123
6mm 직경 홀 펀치시그마-알드리치Z708860
SOLA 6-LCR-SB Lummencor 라이트 엔진No.3526
Cfi Plan Achro Uw 1X ObjectiveNikon Plan UWMRL00012
CFI Plan Fluor 40X Oil Objective 1.3 na - 0.20  mm wdNikon Plan FluorMRH01401
Nikon Eclipse Ti-U 도립 현미경 니콘MEA53200
클라라-E 카메라AndorDR-328G-C02-SIL
원격 초점 어태치먼트 E-RFA 에르고 디자인니콘99888
Ti-S-E 전동 스테이지니콘MEC56110

참고문헌

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  16. Edwards, C. M., Schwarz, U. S. Force localization in contracting cell layers. Phys. Rev. Lett. 107 (12), 128101(2011).
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