방법 논문

동적 3D 복막의 마이크로 디바이스의 모델링 난소 암 다세포 회전 타원체 동작

DOI:

10.3791/55337

⸱

2017년 2월 18일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, University of Hong Kong, 2Department of Mechanical Engineering, University of Hong Kong, 3Department of Medicine, University of Hong Kong, 4Department of Biomedical Sciences, Key Laboratory of Biochip Technology, Biotech and Health Centre, Shenzhen Research Institutes of City University of Hong Kong

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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생리 관련 모델에서 난소 종양의 진행을 연구하기 위해, 다세포 회전 타원체는 시뮬레이션 된 유체의 흐름에 따라 마이크로 디바이스에서 배양 하였다. 이 동적 3D 모델은 난소 암 전이가 발생 셀룰러 및 기계 부품과 복강 환경을 에뮬레이트합니다.

초록

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난소 암은 일반적으로 악성 복수에서 발견 된 종양 분야와 광범위한 복막 전이 특징으로한다. 이것은 가난한 임상 결과와 관련, 현재 효과적인 치료가 부족합니다. 모두 3 차원 환경과 동적 기계적 힘이 전이성 캐스케이드에서 매우 중요한 요소이다. 그러나, 기존의 세포 배양이 자연 종양 미세 환경 요점을 되풀이하지 못한다. 따라서, 복강 환경을 에뮬레이션 할 수 있습니다 생체 -like 모델은 분명 중요하다. 이 연구에서, 복막의 새로운 미세 전이 플랫폼 동안 복강 난소 암 타원체의 상황을 모방하기 위해 설립되었다. 비 - 부착 성 조건하에 생성 된 난소 암 타원체는 생리 학적으로 관련이 전단 응력을 실시 복막 중피 세포로 코팅 된 미세 채널에서 배양 하였다. 요약하면,이 역동적 인 3D 난소 암 mesothelium 마이크rofluidic 플랫폼은 기본 암 생물학에 새로운 지식을 제공하고 잠재적 인 약물 검사 및 개발을위한 플랫폼 역할을 할 수 있습니다.

서론

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난소 암은 부인과에서 가장 치명적인 암이며 널리 보급 복막 악성 복수 형성 한 것을 특징으로한다. 이 광범위한 복막 전이 주요 임상 도전을 나타내고 빈약 한 임상 결과와 연결되어 있습니다. 혈액을 통해 전이 가장 단단한 암과는 달리, 난소 암은 주로 복강 내에서 발신. 종양 세포는 전이 (2)의 과정에서와 같은 다세포 응집체 / 타원체 존재한다. 현탁 배양은 줄기 난소 암 / 종양 세포를 풍부하게 개시 할 수 있다는 사실이 상기 스페 로이드는 모두 종양의 공격성과 연관 chemoresistance 3,4- 향상 될 수 있음을 시사한다. 아마도 다른 분자 메커니즘 5가 2D 및 3D 문화 사이의 약물 반응에 차이가 있습니다.

_content는 ">는 mesothelium에 필수적인 상호 작용은 난소 종양 진행에 대한 기본 미세 환경을 구성한다.이 중피 세포를 피브로넥틴은 유비쿼터스 성분 인 세포 외 기질 (ECM)에 거짓말. 증가 중피 세포 유래 피브로넥틴의 표현 사이의 링크를 종양의 진행을 도시하고있다. 피브로넥틴 악성 복수

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프로토콜

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1. 미세 유체 장치 설계 및 제작

  1. 미세 유체 마스터 디자인
    1. 디자인은 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 미세 유체 채널 패턴을 그린다.
      주 : 일반적으로, CAD 도면은 포토 마스크를 제조하는 마스크 회사에 전송 될 수있다. 미세 유체 설계는 3 개의 동일한 병렬 채널, 다음과 같은 크기와 각 구성 : 4 mm μm의 250 × mm 25 × (폭 × 높이 × 길이)와 떨어져 2mm를 설정합니다. 두 채널이 종료 된 액체 입구와 출구 (그림 1B)를 용이하게하기 위해 127 ° 각도로 설계되었다. 이 프로토콜에서 사용되는 채널이 이전에 발행 (13)에보고되었다.
    2. 15 분마다 아세톤, 이소프로판올 초음파 처리 (500 W / 42 KHZ), 탈 이온수로 상기 실리콘 웨이퍼를 세척 하였다. 압축 된 질소 가스는 웨이퍼를 건조. 15 분 완전히 건조에 250 ° C에서 핫 플레이트에 실리콘 웨이퍼를 가열그것.
    3. 스핀 코트 1800 rpm의 회전 속도로 실리콘 웨이퍼 상 (125 μm의 두께) SU-8 2075 포토 레지스트 층을 포함한다. 합니다 (SU-8 제품 설명서에 따라), 각각 5 및 25 분 동안, 과량의 용매를 제거하고....

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결과

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이 프로토콜을 이용하여 미세 유체 플랫폼은 유체 역학적 조건 중피 세포 난소 암 타원체를 모델링하기 위해 설정되었다. 차 인간 복막 중피 세포는 16 시간을위한 마이크로 디바이스에서 배양하고, 명 시야 현미경으로 관찰 하였다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 채널 하부 성공적 HPMCs의 단층으로 덮었다. 이는 채널 코팅 실패로 이어질 피브로넥틴 또는 HPMC 패터닝 동안 그 기포 형성을 주목하는 것이 중요하다. 비 접착 현탁 배양을 통해 환자의 복수에있는 것과 비슷한 크기입니다 약 100 μm의 직경을 가진 다세포 회전 타원체는 생성 된 녹색 형광 염료, CMFDA으로 표시. 타원체는 HPMC 코팅 된 미세 유체 채널에 옮기고 현탁액에 남아 있었다. 셀 모폴로지는도 2 (현미경 관찰 및 이미지 캡처 된B). 형광 표지 된 암 타원체 용이 형광 현미경 (도 2c) 아래 중피 세포.......

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토론

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이 분석은 접착 분석, 중피 통관 분석, 약물 검사, 제한 등의 다양한 생화학 및 세포 기반 분석과 통합,하지만 할 수있는 유연하고 생리 학적으로 관련 모델을 제공합니다. 이것은 암 진행에 복강 내 미세 환경의 영향의 평가에 적용 할 수있다. 그러나, 여러 실험 조건은 프로젝트의 목적에 따라 최적화 할 수있다 (예를 들어, 채널, 공동 배양 시간 등 당 시드 HPMCs 암 타원체의 수). 이러한 섬유 아세포, 내피 세포 또는 면역 세포로 복강 내 미세 환경에서 다른 세포 유형은 또한 난소 암 타원체와 주변 셀 간의 중요한 상호 작용을 연구하기 위해 시스템에 포함될 수있다. 이러한 라미닌, 비트로 넥틴, 콜라겐과 같은 다른 ECM 성분이 사용될 수도있다. 고려 될 필요가있다이 프로토콜의 하나의 약점은, 그 동안영양 보충 및 전단 응력의 결합은 생체 내에서 본 그 연상, 우리의 현재 시스템에서 영양 보충과 전단 응력의 별도의 제어가 없습니다. 또한, 이러한 형광 - 활성화 세포 분류.......

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공개 사항

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저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

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이 작품은 홍콩 연구 보조금위원회에 의해 지원되었다 (보조금 17,122,014, C1013-15G, 719813E 및 17,304,514). AST 웡은 Croucher 수석 연구 활동의받는 사람입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
실리콘 웨이퍼대학 웨이퍼#1196100 mm
SU-8 2075 포토레지스트 Microchem
SU-8 개발자 Microchem108-65-6
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실란Sigma448931
Sylgard 184Dow Corning1673921 Polydimethylsiloxane (PDMS) + 경화제 키트
생검 펀치 Miltex33-31AA1 mm 직경
플라즈마 클리너Harrick PlasmaPDC-002
폴리에틸렌 튜빙SCIBB31695-PE/50.86 mm (내경)
주사기Terumo
주사기 펌프더 긴 정밀 펌프   LSP01-2A
중간 199Invitrogen31100-0352.2 g/L 중탄산 나트륨
MCDB 105 중간 크기SigmaM6395
태아 소 혈청 (FBS)HycloneSH30068.02
페니실린/스트렙토마이신 Invitrogen15070-063
트립신 EDTA 솔루션 Gibco25300-0540.05% 트립신 - 0.01% EDTA, 페놀 레드
피브로넥틴 인간BD354008
아가로스 Invitrogen15510-027
5-chloromethylfluorescein diacetateLife technologiesC7025Green CMFDA
CO2 인큐베이터SANYOMCO-18AIC
원심분리기HitachiCT15RE
형광 현미경Nikon모델: 80i 또는 ECLIPSE Ti; 소프트웨어: SPOT
SKOV-3& 주의;N Auersperg 박사(브리티시 컬럼비아 대학교)의 선물

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).
  2. Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
  3. Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H.....

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재인쇄 및 허가

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