동적 3D 복막의 마이크로 디바이스의 모델링 난소 암 다세포 회전 타원체 동작

요약

생리 관련 모델에서 난소 종양의 진행을 연구하기 위해, 다세포 회전 타원체는 시뮬레이션 된 유체의 흐름에 따라 마이크로 디바이스에서 배양 하였다. 이 동적 3D 모델은 난소 암 전이가 발생 셀룰러 및 기계 부품과 복강 환경을 에뮬레이트합니다.

초록

난소 암은 일반적으로 악성 복수에서 발견 된 종양 분야와 광범위한 복막 전이 특징으로한다. 이것은 가난한 임상 결과와 관련, 현재 효과적인 치료가 부족합니다. 모두 3 차원 환경과 동적 기계적 힘이 전이성 캐스케이드에서 매우 중요한 요소이다. 그러나, 기존의 세포 배양이 자연 종양 미세 환경 요점을 되풀이하지 못한다. 따라서, 복강 환경을 에뮬레이션 할 수 있습니다 생체 -like 모델은 분명 중요하다. 이 연구에서, 복막의 새로운 미세 전이 플랫폼 동안 복강 난소 암 타원체의 상황을 모방하기 위해 설립되었다. 비 - 부착 성 조건하에 생성 된 난소 암 타원체는 생리 학적으로 관련이 전단 응력을 실시 복막 중피 세포로 코팅 된 미세 채널에서 배양 하였다. 요약하면,이 역동적 인 3D 난소 암 mesothelium 마이크rofluidic 플랫폼은 기본 암 생물학에 새로운 지식을 제공하고 잠재적 인 약물 검사 및 개발을위한 플랫폼 역할을 할 수 있습니다.

서론

난소 암은 부인과에서 가장 치명적인 암이며 널리 보급 복막 악성 복수 형성 ^한 것을 특징으로한다. 이 광범위한 복막 전이 주요 임상 도전을 나타내고 빈약 한 임상 결과와 연결되어 있습니다. 혈액을 통해 전이 가장 단단한 암과는 달리, 난소 암은 주로 복강 내에서 발신. 종양 세포는 전이 ^(2)의 과정에서와 같은 다세포 응집체 / 타원체 존재한다. 현탁 배양은 줄기 난소 암 / 종양 세포를 풍부하게 개시 할 수 있다는 사실이 상기 스페 로이드는 모두 종양의 공격성과 연관 chemoresistance ^3,4- 향상 될 수 있음을 시사한다. 아마도 다른 분자 메커니즘 ^5가 2D 및 3D 문화 사이의 약물 반응에 차이가 있습니다.

_content는 ">는 mesothelium에 필수적인 상호 작용은 난소 종양 진행에 대한 기본 미세 환경을 구성한다.이 중피 세포를 피브로넥틴은 유비쿼터스 성분 인 세포 외 기질 (ECM)에 거짓말. 증가 중피 세포 유래 피브로넥틴의 표현 사이의 링크를 종양의 진행을 도시하고있다. 피브로넥틴 악성 복수 ^{(6, 7)에} 풍부하게 존재한다. 난소 암 세포는 또한 초기 난소 암 전이 ^(8)을 촉진하기 위해 중피 세포에서 파이브로 넥틴의 분비를 유도 할 수있다.

증거 신흥 전단 응력을 포함한 기계적 자극, 세포 형태, 유전자 발현을 조절하고, 따라서, 종양 ^{세포를도 9,도 10,도 11의} 표현형 수 있음을 보여준다. 악성 복수로 개발 및 t 동안 축적umor 진행성 난소 종양 세포는 유체 유동하고, 생성 된 전단 응력에 노출된다. 그룹의 수는 우리가 포함 골격 변형, 상피 간 간엽 전환 및 암 stemness ^{12, 13, 14, 15을} 포함하여, 난소 암의 진행에 대한 전단 응력의 영향을 보여준다. 따라서, 생리 학적으로 관련 미세 종양 복막 전이의 조사를 위해 중요하다. 그러나, 현재의 체외 배양 유체 시스템은 일정한 낮은 생리 학적 관련성 전단 응력 ^{16, 17, 18, 19를} 모방하고 제어하는 방법에 제한이있다. 체외에서 기존 여전히 제한되어 세포 또는 기계적 환경 중 하나에 초점을 맞추고 접근적절한 생리 학적 관련성과 복강 내 미세 환경의 복잡성을 흉내 낸.

여기서, 종래의 전략의 한계를 극복하고, 암전의 복강 구획 연구를 진행하는 복막의 새로운 모델을 설계하기 위해서는, 제어 된 유체 유동을 가진 3 차원 미세 기반 플랫폼을 설계 하였다. 이 모델에서, 난소 암 타원체 연속 유체 흐름 (도 1a) 아래에 미세 유체 칩 차 인간 복막 중피 세포와 공동 배양 하였다. 중피 세포를 피브로넥틴에 도금했다. 비 - 부착 성 난소 암 타원체는 시린지 펌프에 의해 관류 연속 유동 매질과 미세 유체 채널로 접종 하였다. 3 차원 환경과 동적 기계적 힘 모두 전이성 캐스케이드 매우 중요한 요인이다. 이 플랫폼은 복잡한 CEL의 관점에서 복강 미세 조사를 위해 사용될 수있다뿐만 아니라 동적 기계적 큐에 관해서적인 다공질 공동 배양 상호 작용.

프로토콜

1. 미세 유체 장치 설계 및 제작

1. 미세 유체 마스터 디자인
   1. 디자인은 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 미세 유체 채널 패턴을 그린다.
      주 : 일반적으로, CAD 도면은 포토 마스크를 제조하는 마스크 회사에 전송 될 수있다. 미세 유체 설계는 3 개의 동일한 병렬 채널, 다음과 같은 크기와 각 구성 : 4 mm μm의 250 × mm 25 × (폭 × 높이 × 길이)와 떨어져 2mm를 설정합니다. 두 채널이 종료 된 액체 입구와 출구 (그림 1B)를 용이하게하기 위해 127 ° 각도로 설계되었다. 이 프로토콜에서 사용되는 채널이 이전에 발행 ^{(13)에보고되었다.}
   2. 15 분마다 아세톤, 이소프로판올 초음파 처리 (500 W / 42 KHZ), 탈 이온수로 상기 실리콘 웨이퍼를 세척 하였다. 압축 된 질소 가스는 웨이퍼를 건조. 15 분 완전히 건조에 250 ° C에서 핫 플레이트에 실리콘 웨이퍼를 가열그것.
   3. 스핀 코트 1800 rpm의 회전 속도로 실리콘 웨이퍼 상 (125 μm의 두께) SU-8 2075 포토 레지스트 층을 포함한다. 합니다 (SU-8 제품 설명서에 따라), 각각 5 및 25 분 동안, 과량의 용매를 제거하고, 65 ℃로 한 후 95 ℃의 핫 플레이트 상에 직접 레지스트 코팅 된 웨이퍼를 굽는다.
   4. 3 단계를 반복 스핀 코팅 SU-8 2,075 포토 레지스트의 또 다른 층은 250 ㎛의 최종 두께을 얻었다. 7 분 동안 65 ℃에서 핫 플레이트 상에 직접 레지스트 - 코팅 된 웨이퍼 베이크 한 다음 30 분 동안 95 ° C에서. 천천히 실온까지 웨이퍼를 냉각. 압축 공기로 냉각하지 마십시오.
   5. 정렬 및 웨이퍼 위에 직접 포토 마스크를 넣어. 패턴 가교 20 초 동안 UV 광에 노출.
   6. 65 ° C에서 포토 레지스트와 웨이퍼, 5, 12 분 동안 핫 플레이트에 95 ° C 구워 각각합니다 (SU-8 제품 설명서에 따라) 중합 용매를 제거합니다. 그 후, 웨이퍼를 냉각실온.
   7. 25 분 동안 SU-8 개발자의 웨이퍼를 침지하여 비가 교 포토 레지스트를 제거합니다. 이소프로판올로 웨이퍼를 씻어 압력을 공기로 건조.
      참고 : 이소프로판올로 세척 불완전 개발을 표시 할 때 우유 용액이 관찰 된 경우, 긴 개발 시간 SU-8 개발에 다시 웨이퍼를 담가.
   8. 10 분 잠재적 인 균열 패턴을 치유하는 180 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 놓습니다. 핫 플레이트를 끄고 천천히 핫 플레이트에 두어 실내 온도로 웨이퍼를 냉각.
   9. 유리 병 모자 트리클로로 (1H, 1H, 2H, 2H-퍼플 루오로 옥틸) 실란을 몇 방울을 추가합니다. 진공 데시 케이 터에서 병 뚜껑을 넣습니다. 10 분 동안 웨이퍼를 silanization합니다하기 위해 병 뚜껑 옆에 웨이퍼를 놓습니다.
2. PDMS 칩 제조
   1. 홀더를 만들기 위해 알루미늄 호일로 웨이퍼 감싸.
   2. 1 질량 비율 : 10의 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)베이스와 경화제를 혼합혼합 및 탈기 기능에서 원심 믹서. 약 5 mm의 높이로 웨이퍼 상에 천천히 PDMS 액을 붓는다. 40 분 동안 진공 하에서 탈기를 PDMS. 2 시간 동안 65 ° C의 오븐에서 PDMS 큐어.
   3. 조심 마스터 오프 PDMS 슬래브를 박리하고 유리 슬라이드의 크기까지의 채널을 따라 PDMS 트림. 장치의 입구와 출구를 만들 수있는 1-mm 생검 펀치와 PDMS를 펀치.
   4. 먼지와 PDMS 파편을 제거하기 위해 압축 공기 및 접착 테이프와 PDMS 표면을 청소합니다.
   5. 채널 측이 플라즈마 클리너로, 위쪽으로 향하도록 PDMS의 슬래브를 놓습니다. PDMS의 슬래브와 함께 플라즈마 클리너로 청소 유리 슬라이드를 놓습니다.
   6. 1 분 동안 높은 RF 레벨에서 공기 플라즈마에서 PDMS와 유리 슬라이드를 취급합니다. 비가 역적 공유 결합을 생성하기 위해 유리 슬라이드에 PDMS를 바인딩합니다.
   7. 접합 강도를 향상시키기 위해 1 시간 동안 150 ℃에서 핫 플레이트상의 PDMS 칩을 놓고 hydrop를 반환사용하기 전에 PDMS의 hobicity.

2. 시드 차 복막 중피 세포와 미세 유체 칩 (HPMCs)

1. 미세 유체 채널의 피브로넥틴 코팅
   1. 75 %의 에탄올을 30 μL와 미세 유체 채널을 소독. 에탄올을 제거하고 피펫 팁을 사용하여 멸균 인산 완충 생리 식염수 30 μL (PBS)로 두 번 씻어. 철저히 채널에서 PBS를 대기음.
      주 : 오염을 최소화하기 위해, 미세 세포 배양 신중 층류 후드의 사용을 통해 완전히 무균 조건 하에서 수행되어야한다.
   2. MCDB105 (1 : 1) 매체 무 혈청 M199에서 10 μg의 / ML의 피브로넥틴 솔루션을 준비합니다. 기포 형성을 방지하기 위해 특별한주의를 상하 용액을 피펫. 소용돌이하지 마십시오.
   3. 천천히 피브로넥틴 용액 30 μL 각 채널을 입력합니다. 테이프로 채널을 밀봉하고 4 ℃에서 하룻밤 칩을 품어.
3. 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 배지에서 배양 HPMCs : 80 % 합류 할 때까지 37 ℃에서 5 % CO _2에서 (M199 MCDB105 10 % FBS, 100 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된).
4. PBS의 3 mL를 HPMCs을 씻어 0.05 % 트립신 2 ㎖ / 30 초 동안 0.01 % EDTA (TE) 솔루션를 Trypsinize. 10 % FBS 배지 4 mL로 중화 5 분 동안 1,000 XG에서 세포를 스핀 다운.
5. 10 % FBS 배지 2ml를 상기 HPMCs를 재현 탁. 혈구와 세포 수를 계산하고 3.5 × ¹⁰⁶ / mL의 세포 농도를 조정합니다.
6. 사용하기 전에 5 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 피브로넥틴 코팅 된 미세 유체 칩을 따뜻하게. 완전히 피브로넥틴 용액 대기음.
7. 천천히 각 채널에 HPMC 현탁액의 30 μL를 피펫. 테이프로 채널을 밀봉하고 하룻밤 CO ₂ 배양기에서 장치를 배치합니다.

1. 난소 암 타원체 형성
   1. 실험 전에 37 ℃에서 5 % CO ₂ 미만, (5 % FBS, 100 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신 MCDB105 M199) 5 % FBS 배지에 인간 난소 암 세포주 SKOV-3을 유지한다.
   2. 끓는 소독 물에 0.5 % 아가 로스를 녹여. 96 웰 플레이트의 각 웰에 아가 용액을 50 μL 분주. 아가로 오스가 고형화 할 수 있도록 20 분 동안 후드에있는 접시를 남겨; 우물은 세포 부착을 방지 할 수 있습니다 코팅 응고 아가로 오스는 플레이트를 사용할 준비가되어 있음을 나타냅니다.
   3. PBS 3 mL로 SKOV-3 세포를 씻어. 3 분 TE 용액 2 mL로를 Trypsinize. 5 % FBS 배지 4 mL로 중화 5 분 동안 1,000 XG에서 세포를 스핀 다운.
   4. 혈구와 SKOV-3 세포 수를 계산하고 5000 세포 / ㎖의 밀도로 5 % FBS 배지에서 세포를 재현 탁. TR각각에 세포 현탁액 ansfer 200 μL을 48 시간 동안 37 ℃에서 5 % CO _2하에 웰 배양 아가는 코팅.
2. 암 회전 타원체로드
   1. 50 mL의 원심 분리 튜브 혈청 배지 1 ㎖의 사전 - 습윤에 암 타원체를 전송하고 5 분 동안 750 XG에서 스핀 다운.
      참고 : 피펫 팁을 전 습윤 및 원심 분리기 튜브는 원심 분리기 튜브 상 바람직하지 않은 회전 타원체의 부착을 방지 할 수 있습니다.
   2. 무 혈청 M199에 5 chloromethylfluorescein 디 아세테이트 (CMFDA) 솔루션의 2.5 μg의 / mL로 준비 : MCDB105 매체를. CMFDA 용액 1 ㎖에 재현 탁 암 타원체와 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 5 분 동안 750 XG에 원심 분리기.
   3. 5 분 동안 750 XG에서 무 혈청 배지 원심 2 mL를 암 타원체 린스. 매체에 남아있는 형광 염료를 제거하기 위해 두 번이 단계를 반복합니다.
      주 : 형광 신호보다 96 시간 동안 회전 타원체로 유지 될 수있다.
   4. 암 재현 탁무 혈청 M199의 회전 타원체 : MCDB105 매체와는 혈구와 회전 타원체 수를 계산합니다. 무 혈청 배지로 000 타원체 / ㎖의 농도를 조정한다.
   5. 채널 내부에 비 부착 중피 세포를 씻어 MCDB105 배지 : 서서히 로딩 타원체 무 혈청 M199 100 μL를 주입하기 이전.
      참고 : 빠른 주사, 흡입, 또는 거품 형성은 중피 단일 층의 분리로 이어질 것입니다.
   6. 각 채널에 형광 표지 된 회전 타원체 현탁액의 부하 30 μL. _{이산화탄소} 배양기에 미세 유체 칩을 놓습니다.
3. 관류 플랫폼 조립 및 공동 문화
   1. 1 M-긴 튜브 MCDB105 매체 : 신선한, 무 혈청 M199로드 주사기를 연결합니다.
   2. 주사기 펌프의 주사기를 배치하고, 플런저와 주사기 본체를 고정. 배양기 내부의 마이크로 유체 칩과 동일한 높이에서 수평 위치에서 주사기 펌프를 설치한다.
      엔OTE는 : 개수 및 주사기의 크기는 사용 채널 수 및 실험 기간에 의존한다.
   3. 빠르게 눌러 매체가 튜브를 오버 플로우 때까지 빨리 감기 버튼을 길게 매체와 전체 튜브를 주입.
   4. 원하는 유량의 주입을 실행. 다음 식을 사용하여 벽 전단 응력을 측정 :
      
      τ는 벽 전단 챔버, Ǫ = 유량 내부 응력 μ = 점도 (0.01 g CMS ^-1)을 나타내고; 시간 = 유량 용기의 높이 및 w = 흐름 챔버의 폭입니다.
   5. 채널의 입구에 튜브를 연결합니다. 매체가 전 채널에 주입 가온 수 있도록 인큐베이터의 과잉 입구 튜브를 배치합니다. 튜브 및 상기 채널 사이의 연결을 용이하게하기 위해, 적절한 커넥터가 선택 될 수있다. 참고 : syrin 모든 거품을 소개하지 조심GE, 배관 및 연결.
   6. 짧은 출력 튜브 유출 매체를 수집하기 위해 50 ML 원뿔 튜브에 채널의 출구를 연결합니다.
      참고 : 전체 동적 공동 배양 시스템은 그림 1D에 표시됩니다.

관류 후 HPMCs 및 암 회전 타원체 4. 관측

1. 밝은 필드 또는 형광 현미경으로 HPMCs 암 회전 타원체를 관찰하고 관류 1 시간 후 사진을 촬영.

결과

이 프로토콜을 이용하여 미세 유체 플랫폼은 유체 역학적 조건 중피 세포 난소 암 타원체를 모델링하기 위해 설정되었다. 차 인간 복막 중피 세포는 16 시간을위한 마이크로 디바이스에서 배양하고, 명 시야 현미경으로 관찰 하였다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 채널 하부 성공적 HPMCs의 단층으로 덮었다. 이는 채널 코팅 실패로 이어질 피브로넥틴 또는 HPMC 패터닝 동안 그 기포 형성을 주목하는 것이 중요하다. 비 접착 현탁 배양을 통해 환자의 복수에있는 것과 비슷한 크기입니다 약 100 μm의 직경을 가진 다세포 회전 타원체는 생성 된 녹색 형광 염료, CMFDA으로 표시. 타원체는 HPMC 코팅 된 미세 유체 채널에 옮기고 현탁액에 남아 있었다. 셀 모폴로지는도 2 (현미경 관찰 및 이미지 캡처 된B). 형광 표지 된 암 타원체 용이 형광 현미경 (도 2c) 아래 중피 세포...

토론

이 분석은 접착 분석, 중피 통관 분석, 약물 검사, 제한 등의 다양한 생화학 및 세포 기반 분석과 통합,하지만 할 수있는 유연하고 생리 학적으로 관련 모델을 제공합니다. 이것은 암 진행에 복강 내 미세 환경의 영향의 평가에 적용 할 수있다. 그러나, 여러 실험 조건은 프로젝트의 목적에 따라 최적화 할 수있다 (예를 들어, 채널, 공동 배양 시간 등 당 시드 HPMCs 암 타원체의 수). 이러한 섬유 아세포, 내피 세포 또는 면역 세포로 복강 내 미세 환경에서 다른 세포 유형은 또한 난소 암 타원체와 주변 셀 간의 중요한 상호 작용을 연구하기 위해 시스템에 포함될 수있다. 이러한 라미닌, 비트로 넥틴, 콜라겐과 같은 다른 ECM 성분이 사용될 수도있다. 고려 될 필요가있다이 프로토콜의 하나의 약점은, 그 동안영양 보충 및 전단 응력의 결합은 생체 내에서 본 그 연상, 우리의 현재 시스템에서 영양 보충과 전단 응력의 별도의 제어가 없습니다. 또한, 이러한 형광 - 활성화 세포 분류...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
실리콘 웨이퍼	대학 웨이퍼	#1196	100 mm
SU-8 2075 포토레지스트	Microchem
SU-8 개발자	Microchem	108-65-6
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실란	Sigma	448931
Sylgard 184	Dow Corning		1673921 Polydimethylsiloxane (PDMS) + 경화제 키트
생검 펀치	Miltex	33-31AA	1 mm 직경
플라즈마 클리너	Harrick Plasma	PDC-002
폴리에틸렌 튜빙	SCI	BB31695-PE/5	0.86 mm (내경)
주사기	Terumo
주사기 펌프	더 긴 정밀 펌프	LSP01-2A
중간 199	Invitrogen	31100-035	2.2 g/L 중탄산 나트륨
MCDB 105 중간 크기	Sigma	M6395
태아 소 혈청 (FBS)	Hyclone	SH30068.02
페니실린/스트렙토마이신	Invitrogen	15070-063
트립신 EDTA 솔루션	Gibco	25300-054	0.05% 트립신 - 0.01% EDTA, 페놀 레드
피브로넥틴 인간	BD	354008
아가로스	Invitrogen	15510-027
5-chloromethylfluorescein diacetate	Life technologies	C7025	Green CMFDA
CO2 인큐베이터	SANYO	MCO-18AIC
원심분리기	Hitachi	CT15RE
형광 현미경	Nikon		모델: 80i 또는 ECLIPSE Ti; 소프트웨어: SPOT
SKOV-3& 주의;			N Auersperg 박사(브리티시 컬럼비아 대학교)의 선물