Method Article

다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

DOI:

10.3791/55341

⸱

May 5th, 2017

 ,  ,  , 
1Physiology, Michigan State University, 2Center for Neurodegenerative Science Van Andel Institute, 3Pharmaceutical Sciences, Wayne State University

In This Article

Summary

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안정화 신규 이차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 결합 된 아민 반응성 단백질 가교제를 사용하여 변성 조직 파쇄물로부터 천연 단백질 복합체를 분리하는 방법 (PAGE) 시스템이 제공된다.

Abstract

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정화 및 단일 단백질과 펩티드를 연구하는 많은 잘 개발 된 방법이 있습니다. 그러나, 대부분의 세포 기능들은 그들의 비공유 쉽게 정제 기술에 의해 교란 바인딩 때문에 조사하기 어려운 작용 단백질 복합체의 네트워크에 의해 수행된다. 이 작업은 안정화 이차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 사용하여 개질 된 조직으로부터 천연 단백질 복합체를 분리하는 방법을 설명한다. 조직 파쇄 액은 단백질 겔로 짧은 거리를 마이그레이션 될 때까지 전류를인가하고, 비 변성 청색 기본 폴리 아크릴 아미드 겔 상에 로딩된다. 이주 된 단백질을 함유하는 겔 조각은 절제하고 공유 단백질 복합체를 안정화 아민 반응성 가교 시약 디티 오비스 (숙신 이미 딜 프로 피오 네이트)와 함께 배양된다. 가교 결합 된 복합체를 포함하는 겔 스트립이어서 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔에 캐스팅되고, t그는 단지가 완전히 분리된다. 이 방법은 저렴하고 쉽게 배울 수 의미, 기술과 대부분의 분자 생물 학자들에게 친숙한 소재에 의존한다. 이 적절 매우 큰 단지를 분리하는 능력에 제한되고, 보편적으로 성공하지 않은 반면, 방법은 잘 연구 단지의 다양한 캡처 할 수 있었고, 관심이 많은 시스템에 가능성이 적용됩니다.

Introduction

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정상 세포 기능은 단백질 - 단백질 상호 작용 1, 2에 따라 달라집니다. 그 결과, 인간의 질병은 종종 다양한 단백질 복합체 (3)의 조립 및 행동 교란에 의해 표시된다. 이러한 상호 작용의 특성을 할 수있는 능력 때문에 중요하다. 이러한 상호 작용을 검출하는 수단은 현재 자주 상호 작용 파트너 풀다운 하였다 목적 단백질의 정제를 필요로한다. 통상적 인 정제를 차동 원심 분리, 침전, 및 / 또는 크로마토 그래피 (4)에 의해 달성된다. 이 방법은 시간이 많이 소요되어 각 대상 단백질을 변경해야합니다, 종종 낮은 수율을 초래한다. 현대 정제 방법은 포획 분자 (5)에 결합 된 비드 로케이션 컬럼에 면역 또는 추출하여 단백질을 표적으로하는 펩티드 태그의 융합을 포함이것은 많은 단백질 신성이지만 "> 6. 그것은 잠재적으로 보통 결합 파트너에 대한 친 화성이 다른 구조의 결과, 타겟의 순서 변경을 필요로한다. 일부 단백질 - 단백질 상호 작용에 민감한 성질은이 방법이 적용되지 않을 수 있음을 의미 많은 시나리오. 또한, 단백질 - ....

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Protocol

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1. 조직 준비

  1. 200 x BN-PAGE 샘플 버퍼 (200 mM Bis (2- 하이드 록시 에틸) 아미노 - 트리스 (하이드 록시 메틸) 메탄 (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40 % w / v 글리세롤, 0.004 % Ponceau S, pH 7.2 ).
    비고 :이 저장 용액은 미리 제조하여 4 ℃에서 보관할 수있다.
  2. 1x 상업용 프로 테아 제 억제제 칵테일을 포함하는 750 μL dH 2 O에서 4x 샘플 버퍼 250 μL를 희석하십시오. 소용돌이 치고 얼음 위에서 식히십시오.
  3. 30 ML 획기적인 깨끗한 dounce homogenizer와 1 ML 1X 얼음 차가운 BN - 페이지 샘플 버퍼에 대상 조직 20 MG을 균질.
    참고 :이 시범 실험을 위해 대상 조직은 전체 쥐 뇌 조직입니다. 균질화 후 샘플을 2 % digitonin과 같은 중성 세제로 처리하여 막 단백질의 가용화 및 전기 영동을 허용 할 수 있습니다.
  4. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 homogenate를 전송하고, 불용성 세포 내용을 펠렛에 30 분 14,000 XG에서 원심 분리기. 애프터R 원심 분리는 얼음에 깨끗한 튜브에 뜨는을 가만히 따르다.
  5. bic....

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Results

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이 데모 실험에서 다량 체-PAGE는 전체 쥐의 뇌 해물을 시행 하였다. 얻어진 단백질 분리 diflouride 폴리 비닐 (PVDF) 멤브레인에 블 롯팅 한 후, 복합체를 형성하는 것으로 알려진 단백질에 대한 항체로 프로빙 하였다. 도 1은 두 가지 방법에 의해 프로토콜의 유효성을 나타낸다. 먼저, 가교 결합 단백질 가교 시약 형성된 관찰 고 분자량 종을 의미 환원제의 첨가에 의해 절단하고, 프로토콜 (도 1a)의 다른 구성 요소에 의한 아니라는 것을 입증 . 둘째, 가교 결합은 가교 결합은 단백질 복합체에 특이 겔에 가까우므로 임의의 반응성이 최소화된다는 것이다 의미 세제 (도 1b)의 첨가에 민감하다는 것을 보여준다. 그림 2는 방법은 RESP를 캡처 실패 보여줍니다그렇지 iratory 복합체 II 있지만, 수용성 및 막 결합 복합체 모두를 캡.......

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Discussion

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단백질 - 단백질 상호 작용은 생물이 수행하는 모든 작업에 중요하다. 이 때문에, 그들은 강렬한 조사 및 연구의 주제이다. 다량 체-PAGE는 캡처 분리 및 단백질 복합체의 다양한 분석을위한 신규 한 방법이다. 우리는 이전에 질병 관련 단백질의 α-synuclein의 11 oligimerization 연구에의 적용 가능성을 증명하고있다. 그림 2에서 설명하지만, 그것은 많은 단백질 복합체로 확장합니다. 단백질 복합체를 연구하는 다른 방법에 비해, 다량 체-PAGE 때문에 단순성과 간결성 유리하다. 조직 샘플에서 시간은 완전히 SDS 겔은 약 8 시간이다 분리한다. 검출 일반적인 웨스턴 블롯에 의해 수행 될 수 있기 때문에, 프로토콜은 풀다운 실험과 관련된 것보다 훨씬 더 낮은 검출 한계와 변성 조직 파쇄물에서 수행 될 수있다. 또한, 대부분의 시설이 완비 된 분자 생물학 라보ratories는 작은 선행 투자와 기술을 수행 할 수 있습니다. 나중에 설명으로.......

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Disclosures

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저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgements

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국립 보건원 / NIDA의 DA034783 지원. 우리는 다량 체-PAGE와 기술 지원 브라이언 A 킬링거합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
ε - 아미노카프로산시그마A2504
아크릴아미드아크로스 유기물164855000독성.
아크릴아미드/비사크릴아미드 37.5:1(40%T 원액)BioRad161-0148독성.
과황산 암모늄시그마A3678
산타 크루즈 생명 공학안티 토끼 IgG-HRPsc-2004
Bicinchoninic acid assay kitThermofisher23225
Bis-trisSigmaB9754
소 혈청 알부민SigmaA9647
ButanolFisher ScientificA399-1
화학발광 기판 키트ThermoFisher24078
Coomassie blue, G-250Sigma-Aldrich,B0770
Digitonin,SigmaD141독성.
디메틸 설폭사이드Fisher ScientificD128-1
디티오비스(숙시니미딜프로피오네이트)Thermo Scientific22585
건조 무지방 우유LabScientificM0841
글리세롤시그마G9012
글리신Fisher ScientificBP381-5
정지 프로테아제 억제제 칵테일Thermofisher78430
염산Fisher ScientificA144SI-212적정용. 신랄한.
메탄올피셔 사이언티픽A412-4PVDF 멤브레인 활성화용. 유독.
산타 크루즈 생명 공학sc-7011-R
N,N'-메틸렌비스아크릴아미드아크로스 유기16479독성의 단
NP40Boston BioproductsP-872
Polysorbate 20 (tween-20)Fisher ScientificBP337-500
폴리비닐리덴 플루오라이드 전달막Thermo Scientific88518
Ponceau SSigmaP3504
염화칼Fisher ScientificP217-3
인산칼륨 monobasicSigmaP9791
프로테아제 억제제 칵테일Thermo Scientific88265
SDS 용액 (10% w/v)BioRad161-0416
염화나트륨Fisher ScientificBP358-212
도데실황산나트륨SigmaL37771
인산나트륨 일염기Fisher ScientificBP329-1
트리신시그마T0377
트리스 베이스피셔 사이언티픽BP152-500
트리스-HCl(0.5M 버퍼, pH 6.8)BioRad161-0799
트리스-HCl(1.5M 버퍼, pH 8.8)BioRad161-0798
이름회사 카탈로그 번호Comments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000GE Healthcare28-9558-10
ImageJ 소프트웨어NIH
Synergy H1 마이크로플레이트 리더BioTek
Gel Former + StandBiorad
마이크로퓨지 22R 원심분리기Beckman Coulter
2mL dounce 균질화기
Vortex 믹서Fisher Scientific
초음파 조직 균질화기Fisher ScientificFB120220
염소 의, , , , , , 토끼 N, N, N', N', N'-테트라메틸에틸렌디아민 시그마 T9281물 클론 항 &알파;-시누클레인 IgG.륨 성

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
  2. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev

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