방법 논문

다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

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DOI:

10.3791/55341

⸱

2017년 5월 5일

 ,  ,  , 
1Physiology, Michigan State University, 2Center for Neurodegenerative Science Van Andel Institute, 3Pharmaceutical Sciences, Wayne State University

이 논문에서

요약

안정화 신규 이차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 결합 된 아민 반응성 단백질 가교제를 사용하여 변성 조직 파쇄물로부터 천연 단백질 복합체를 분리하는 방법 (PAGE) 시스템이 제공된다.

초록

정화 및 단일 단백질과 펩티드를 연구하는 많은 잘 개발 된 방법이 있습니다. 그러나, 대부분의 세포 기능들은 그들의 비공유 쉽게 정제 기술에 의해 교란 바인딩 때문에 조사하기 어려운 작용 단백질 복합체의 네트워크에 의해 수행된다. 이 작업은 안정화 이차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 사용하여 개질 된 조직으로부터 천연 단백질 복합체를 분리하는 방법을 설명한다. 조직 파쇄 액은 단백질 겔로 짧은 거리를 마이그레이션 될 때까지 전류를인가하고, 비 변성 청색 기본 폴리 아크릴 아미드 겔 상에 로딩된다. 이주 된 단백질을 함유하는 겔 조각은 절제하고 공유 단백질 복합체를 안정화 아민 반응성 가교 시약 디티 오비스 (숙신 이미 딜 프로 피오 네이트)와 함께 배양된다. 가교 결합 된 복합체를 포함하는 겔 스트립이어서 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔에 캐스팅되고, t그는 단지가 완전히 분리된다. 이 방법은 저렴하고 쉽게 배울 수 의미, 기술과 대부분의 분자 생물 학자들에게 친숙한 소재에 의존한다. 이 적절 매우 큰 단지를 분리하는 능력에 제한되고, 보편적으로 성공하지 않은 반면, 방법은 잘 연구 단지의 다양한 캡처 할 수 있었고, 관심이 많은 시스템에 가능성이 적용됩니다.

서론

정상 세포 기능은 단백질 - 단백질 상호 작용 1, 2에 따라 달라집니다. 그 결과, 인간의 질병은 종종 다양한 단백질 복합체 (3)의 조립 및 행동 교란에 의해 표시된다. 이러한 상호 작용의 특성을 할 수있는 능력 때문에 중요하다. 이러한 상호 작용을 검출하는 수단은 현재 자주 상호 작용 파트너 풀다운 하였다 목적 단백질의 정제를 필요로한다. 통상적 인 정제를 차동 원심 분리, 침전, 및 / 또는 크로마토 그래피 (4)에 의해 달성된다. 이 방법은 시간이 많이 소요되어 각 대상 단백질을 변경해야합니다, 종종 낮은 수율을 초래한다. 현대 정제 방법은 포획 분자 (5)에 결합 된 비드 로케이션 컬럼에 면역 또는 추출하여 단백질을 표적으로하는 펩티드 태그의 융합을 포함이것은 많은 단백질 신성이지만 "> 6. 그것은 잠재적으로 보통 결합 파트너에 대한 친 화성이 다른 구조의 결과, 타겟의 순서 변경을 필요로한다. 일부 단백질 - 단백질 상호 작용에 민감한 성질은이 방법이 적용되지 않을 수 있음을 의미 많은 시나리오. 또한, 단백질 - 단백질 상호 작용을 매핑하는 데 사용 풀다운 분석으로 인해 자유와 미끼 단백질의 비 네이티브 수준의 제한된 도로, 정확한 세포 사진을 캡처 할 수 있습니다.

이상적으로, 단백질 복합체가 정화 또는 풀다운 할 필요없이, 그 나라의 상태를 검출 할 수있다. 블루 천연 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동법 (BN-PAGE)의 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동법 (SDS-PAGE)에 덜 변성 대안으로 개발 및 생체 시료 7의 일부 단백질 복합체의 분리를 허용 하였다. 그러나, BN-PAGE 단백질은 LAR에 기초하여 구분하기다른 분자 크기, 전하, 입체 구조, 및 결합을 포함한 변수의 GE 번호. 이러한 요소의 상호 작용은 종종 단백질의 공동 분리, 집계 형성, 가난한 단백질 밴드 해상도를 초래한다. 두 차원 네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 이러한 문제 8의 모든 일부를 해결 있지만.

기본 분리와 관련된 합병증을 피하기 위해, 일부 저자는 조직 해물 4 단백질 복합체를 캡처하는 등의 디티 오비스 (숙신 이미 딜 프로 피오 네이트)와 같은 아민 반응성 가교 시약 (DSP)를 사용합니다. 이 처리 해물을 다음 변성 및 단백질 복합체의 원래 크기와 메이크업을 유지하면서, SDS-PAGE에 의해 분리 될 수있다. 가교 시약이 조직 용해 액에 다른 한 분자의 근접성, 그리고 단백질을 기반으로 반응하기 때문에, 많은 자유도를 가지고 확률 적, 비특이적 배경 크로스를 상호 작용할 수 있습니다-linking 특히 농축 샘플에서 높을 수있다. 이 어려운-해석 결과로 이어질 수 있습니다.

여기서는 하이브리드 BN-PAGE / SDS-PAGE 법의 사용을 입증 분리 복잡한 혼합물에 단백질 어셈블리를 감지하는 멀티 머 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (다량 체-PAGE)을 불린다. 우선, 세포 용 해물을 통해 BN-PAGE 폴리 아크릴 아미드 겔에 현탁시킨다. 용 해물을 함유하는 겔은 가교 시약 DSP와 반응시킨다. 의사 고정화 약간 겔상에서 분리 된 단백질은 배경 가교제의 반응성이 감소 의미 훨씬 비특이적 반응 할 가능성이있다. 가교 후, 겔 밴드를 절제하고 SDS-PAGE로 분리 하였다. 생성 된 겔은 전형적 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동법과 연관된 임의의 수단에 의해 분석 될 수있다. 이 방법은 추가로 정제 또는 당기 다우 없이도 변성 조직 파쇄물에서 천연 단백질 복합체의 분리 및 검출을 허용엔.

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프로토콜

1. 조직 준비

  1. 200 x BN-PAGE 샘플 버퍼 (200 mM Bis (2- 하이드 록시 에틸) 아미노 - 트리스 (하이드 록시 메틸) 메탄 (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40 % w / v 글리세롤, 0.004 % Ponceau S, pH 7.2 ).
    비고 :이 저장 용액은 미리 제조하여 4 ℃에서 보관할 수있다.
  2. 1x 상업용 프로 테아 제 억제제 칵테일을 포함하는 750 μL dH 2 O에서 4x 샘플 버퍼 250 μL를 희석하십시오. 소용돌이 치고 얼음 위에서 식히십시오.
  3. 30 ML 획기적인 깨끗한 dounce homogenizer와 1 ML 1X 얼음 차가운 BN - 페이지 샘플 버퍼에 대상 조직 20 MG을 균질.
    참고 :이 시범 실험을 위해 대상 조직은 전체 쥐 뇌 조직입니다. 균질화 후 샘플을 2 % digitonin과 같은 중성 세제로 처리하여 막 단백질의 가용화 및 전기 영동을 허용 할 수 있습니다.
  4. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 homogenate를 전송하고, 불용성 세포 내용을 펠렛에 30 분 14,000 XG에서 원심 분리기. 애프터R 원심 분리는 얼음에 깨끗한 튜브에 뜨는을 가만히 따르다.
  5. bicinchoninic 산 (BCA) 또는 유사한 단백질 정량 분석법을 이용하여 상등액의 단백질 농도를 측정하기 위해 제조 지시에 따라.
  6. 균질 시료 (S)에 세제를 포함 할 경우, 0.25 % 쿠마시에 균질 액을 가지고 충분한 수용액에 5 % 쿠마시 블루 G-250의 양을 추가한다.

2. BN-PAGE

  1. 25 mL의 20 배 청색 기본 희석 (BN)이로 버퍼 스톡 (1.0 M 비스 - 트리스, 1.0 M 트리 신, pH를 6.8) 전기 영동 475 mL의 DH 1X 실행 완충액 500 mL로 0.002 % 쿠마시 블루를 함유하는 2 O.
    1. 샘플 세제를 포함하는 경우, 그 대신 0.02 %를 함유하는 쿠마 1X 실행 완충액 250 mL의 어느 것도 포함하지 않는 다른 250 mL로 만든다.
  2. 4 ℃로 냉각 완충액 (들).
  3. 청소 및 제조업체의 지침에 따라 카세트를 붓는 폴리 아크릴 아마이드 젤을 조립.
  4. 표준 제조법 7 항 BN 폴리 아크릴 아미드 겔 (3 % T 적층 층, 6 % T 해결 층)을 붓고 잘 빗 놓는다.
  5. 겔을 중합 후에 DH 2 O와 카세트 헹구고 제조사의 지시에 따라 전기 영동 장치를 조립한다.
  6. 잘 빗를 제거하고 1 배 BN-PAGE 실행 버퍼로 우물을 입력합니다. 샘플이 로딩 될 때까지 버퍼에 전체 내부 챔버를 채우기 피한다.
    1. 샘플 세제를 포함하는 경우, 0.02 % 코마시 블루를 함유하는 완충액으로 각 웰을 채운다.
      참고 : 4 ° C에서 단계 2.7-2.9를 수행합니다.
  7. 겔 로딩 정보를 사용하여, 목적하는 웰에 20 μg의 단백질을 함유하는 균질 부피 피펫. 미사용 웰로 1X BN-PAGE 샘플 버퍼의 등가 부피 피펫.
    참고 :에 추가 균질의 적절한 볼륨을 계산하기 위해 BCA 분석에서 결정된 단백질 농도를 사용하여우물.
  8. 샘플이 로딩 된 후, 1X BN-PAGE 주행 완충액 내부 챔버를 채운다. 젤이 완전히 버퍼에 빠져들되어 있는지 확인합니다. 다음에, 제조자에 의해 지시 된 레벨로 1X 주행 완충액 외부 챔버를 채운다.
    1. 샘플 세제를 포함하는 경우, 0.02 % 코마시 블루를 함유하는 1X 버퍼, 염료 무 1X 런닝 버퍼와 외부 챔버와 내부 챔버를 채운다.
  9. 전원 공급 장치에 전극을 연결하고, 상기 염료 밴드 층으로 해결 ~ 2cm까지 진행됨에 150 V의 겔의 단백질 electrophorese. 중지하고 전원 공급 장치를 분리합니다.

3. 교차 연결

참고 : 4 ° C에서 단계를 3.1-3.6를 수행합니다.

  1. 전기 영동 장치를 분해 및 겔 카세트의 유리창을 분리한다. 제거하고 스태킹 층을 버린다.
  2. 조심 다만 염료 전면의 하단 아래에 겔을 잘라. 갖다이 컷은 같은 부드럽고 똑바로 가능하도록 배려하고 젤의 사용하지 않는 부분을 폐기합니다. 이는 균질 샘플의 모든 단백질을 포함 폭 ~ 2cm, 폴리 아크릴 아마이드 젤의 수평 스트립을 떠날 것이다.
  3. 겔 스트립의 가장자리에 따라 사용되지 않은 부분을 잘라.
  4. 조심스럽게 작은 용기에 10 ㎖의 인산염 완충 식염수 (PBS)로 스트립을 배치하고 부드럽게 평형 30 분간 장동 섞는다.
  5. 평형화 후 폐기하고 다른 10 ㎖ PBS로 대체. 피펫 500 μL의 25 mM의 DSP는 PBS로 디메틸 술폭 시드에 용해하고, 30 분 동안 상기와 같이 (단계 34) 계속 혼합한다.
  6. 는 DSP 솔루션을 붓고. DSP 미 반응을 종결 2 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS)를 포함 0.375 M 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 히드로 클로라이드 (트리스 - 염산)의 pH 8.8, 10 ㎖의 추가. 15 분 동안 장동를 계속합니다.

4. SDS-PAGE

  1. 겔 스트립 급랭되지만, SDS-PA를 제조표준 방법에 따라 9 GE 겔 용액. 중합 시약을 추가하지 마십시오.
  2. 급냉 후, 실온 ΒΝ 겔 스트립 돌아가서 새로운 카세트로 겔 스트립 캐스팅.
    1. 이렇게하려면 신중 젤을 선택하고 깨끗한 젤 카세트 스페이서 플레이트에 배치합니다.
    2. 오리엔트 염료 앞의 바닥 즉, BN-PAGE 동안에 가장 멀리 이동 측이 새로운 카세트의 상단에 가까운되어야 새로운 카세트 상부 (가장 가깝도록 스트립; 겔 스트립이 종래로부터 대칭되어야 정위). 그림 3을 참조하십시오.
    3. 상단 모서리에도 상기 커버 플레이트의 상부 에지가되는 위치에 놓여 지도록 배치 스트립 (즉, 그것은 새 겔의 정상에있을 것이다). 염료 전면 유리판의 수평 에지에 평행 확인.
    4. t에 공간을두고 이격 벽 중 하나에 대해 절개 띠의 한쪽을 눌러젤 그 반대편 부어하고 단백질 표준 또는 사다리를로드한다.
    5. 겔 스트립의 하단은 어떤 고르지 않거나 고르지 영역을 포함하는 경우, 신중하게 버려야. 존재하는 경우, 그들은 겔 중에 트랩 기포 주입한다.
    6. 겔 스트립이 정확하게 위치되면, 스페이서 플레이트 위에 커버 플레이트를하다. 어떤 갇힌 공기 방울을 밀어 부드러운 압력을 적용합니다.
    7. 제조업체의 지침에 따라 젤 주입 장치를 조립하기 위해 계속합니다.
  3. 분해능 겔 버퍼 중합 시약을 추가하고 혈청 피펫을 사용하여 제조 된 겔 카세트로 붓는다. 스택 층을위한 공간을 떠나, 절제된 BN-PAGE 젤 스트립 아래 ~ 2cm로 겔 카세트를 채 웁니다.
  4. 부어 겔의 정상에 100 μL 부탄올을 추가하고 해결 층의 중합을 30 분을 허용한다. 부탄올을 붓고.
  5. 스태킹 겔 용액에 중합 시약을 추가합니다. serolog 사용피펫의 iCal 겔 카세트 나머지 빈 공간을 채우도록 적층 층을 붓는다.
    1. 이 겔 스트립 아래의 공간을 채우고, 기포가 트랩되지 않도록 적층 층 붓고 같이 겔 카세트 틸트.
    2. 스태킹 겔 버퍼 겔 스트립 아래의 빈 공간을 채우는 같이 서서히 레벨에 기초 겔 카세트를 반환한다.
    3. 거의 오버 플로우 할 때까지 옆에 스태킹 겔 버퍼로 적출 된 젤 스트립에 빈 공간을 채우기 위해 계속합니다.
  6. 적층 층을 30 분 동안 중합하도록 허용.
    주 : 겔 중합 동안 10 배 SDS-PAGE에서 러닝 완충액 (250 개 mM의 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스), 1.9 M 글리신, 1 % SDS)을 확인. 이것은 또한 미리 만들어 실온에서 저장 될 수있다.
  7. 1X 작업 버퍼를 만들기 위해 450 mL의 DH 2 O에 50 mL의 10 배 SDS-PAGE 실행 버퍼 주식을 희석.
  8. 적층 층을 중합 한 후, 겔로부터 주입 카세트 삭제장치는 DH (2) O로 세정하고, 제조자의 지시에 따라 전기 영동 장치를 조립한다.
  9. 그 제조자에 의해 지정된 레벨로 외부 챔버를 채우 1X SDS-PAGE에서 러닝 완충액으로 완전히 내부 챔버를 채운다.
  10. 다음 분자량 래더 또는 적절한 단백질 표준 적출 겔 스트립 공간로드.
  11. 전원 공급 장치에 전극을 부착하고, 쿠마시 염색이 겔을 실행하면 (120)에서 V. 샘플 electrophorese 중지하고 전원을 분리.
  12. (10) 결합 항체 및 단백질 electroblotting 검출의 표준 방법을 사용하여 겔 분석.

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결과

이 데모 실험에서 다량 체-PAGE는 전체 쥐의 뇌 해물을 시행 하였다. 얻어진 단백질 분리 diflouride 폴리 비닐 (PVDF) 멤브레인에 블 롯팅 한 후, 복합체를 형성하는 것으로 알려진 단백질에 대한 항체로 프로빙 하였다. 도 1은 두 가지 방법에 의해 프로토콜의 유효성을 나타낸다. 먼저, 가교 결합 단백질 가교 시약 형성된 관찰 고 분자량 종을 의미 환원제의 첨가에 의해 절단하고, 프로토콜 (도 1a)의 다른 구성 요소에 의한 아니라는 것을 입증 . 둘째, 가교 결합은 가교 결합은 단백질 복합체에 특이 겔에 가까우므로 임의의 반응성이 최소화된다는 것이다 의미 세제 (도 1b)의 첨가에 민감하다는 것을 보여준다. 그림 2는 방법은 RESP를 캡처 실패 보여줍니다그렇지 iratory 복합체 II 있지만, 수용성 및 막 결합 복합체 모두를 캡...

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토론

단백질 - 단백질 상호 작용은 생물이 수행하는 모든 작업에 중요하다. 이 때문에, 그들은 강렬한 조사 및 연구의 주제이다. 다량 체-PAGE는 캡처 분리 및 단백질 복합체의 다양한 분석을위한 신규 한 방법이다. 우리는 이전에 질병 관련 단백질의 α-synuclein의 11 oligimerization 연구에의 적용 가능성을 증명하고있다. 그림 2에서 설명하지만, 그것은 많은 단백질 복합체로 확장합니다. 단백질 복합체를 연구하는 다른 방법에 비해, 다량 체-PAGE 때문에 단순성과 간결성 유리하다. 조직 샘플에서 시간은 완전히 SDS 겔은 약 8 시간이다 분리한다. 검출 일반적인 웨스턴 블롯에 의해 수행 될 수 있기 때문에, 프로토콜은 풀다운 실험과 관련된 것보다 훨씬 더 낮은 검출 한계와 변성 조직 파쇄물에서 수행 될 수있다. 또한, 대부분의 시설이 완비 된 분자 생물학 라보ratories는 작은 선행 투자와 기술을 수행 할 수 있습니다. 나중에 설명으로...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

국립 보건원 / NIDA의 DA034783 지원. 우리는 다량 체-PAGE와 기술 지원 브라이언 A 킬링거합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Chemicals
ε - 아미노카프로산시그마A2504
아크릴아미드아크로스 유기물164855000독성.
아크릴아미드/비사크릴아미드 37.5:1(40%T 원액)BioRad161-0148독성.
과황산 암모늄시그마A3678
산타 크루즈 생명 공학안티 토끼 IgG-HRPsc-2004
Bicinchoninic acid assay kitThermofisher23225
Bis-trisSigmaB9754
소 혈청 알부민SigmaA9647
ButanolFisher ScientificA399-1
화학발광 기판 키트ThermoFisher24078
Coomassie blue, G-250Sigma-Aldrich,B0770
Digitonin,SigmaD141독성.
디메틸 설폭사이드Fisher ScientificD128-1
디티오비스(숙시니미딜프로피오네이트)Thermo Scientific22585
건조 무지방 우유LabScientificM0841
글리세롤시그마G9012
글리신Fisher ScientificBP381-5
정지 프로테아제 억제제 칵테일Thermofisher78430
염산Fisher ScientificA144SI-212적정용. 신랄한.
메탄올피셔 사이언티픽A412-4PVDF 멤브레인 활성화용. 유독.
산타 크루즈 생명 공학sc-7011-R
N,N'-메틸렌비스아크릴아미드아크로스 유기16479독성의 단
NP40Boston BioproductsP-872
Polysorbate 20 (tween-20)Fisher ScientificBP337-500
폴리비닐리덴 플루오라이드 전달막Thermo Scientific88518
Ponceau SSigmaP3504
염화칼Fisher ScientificP217-3
인산칼륨 monobasicSigmaP9791
프로테아제 억제제 칵테일Thermo Scientific88265
SDS 용액 (10% w/v)BioRad161-0416
염화나트륨Fisher ScientificBP358-212
도데실황산나트륨SigmaL37771
인산나트륨 일염기Fisher ScientificBP329-1
트리신시그마T0377
트리스 베이스피셔 사이언티픽BP152-500
트리스-HCl(0.5M 버퍼, pH 6.8)BioRad161-0799
트리스-HCl(1.5M 버퍼, pH 8.8)BioRad161-0798
이름회사 카탈로그 번호Comments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000GE Healthcare28-9558-10
ImageJ 소프트웨어NIH
Synergy H1 마이크로플레이트 리더BioTek
Gel Former + StandBiorad
마이크로퓨지 22R 원심분리기Beckman Coulter
2mL dounce 균질화기
Vortex 믹서Fisher Scientific
초음파 조직 균질화기Fisher ScientificFB120220
염소 의, , , , , , 토끼 N, N, N', N', N'-테트라메틸에틸렌디아민 시그마 T9281물 클론 항 &알파;-시누클레인 IgG.륨 성

참고문헌

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