Method Article

골지 - 콕스 방법을 사용하여 두꺼운 뇌 섹션 내에서 이미징 뉴런

DOI:

10.3791/55358

⸱

April 18th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 하나의 조직 샘플에 포함 된 긴 수지상 나무와 뉴런을 시각화하기 위해, 두께 뇌 부분에 골지 - 콕스 염색 방법을 사용하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 두 가지 변종은 크레 실 바이올렛으로 대조, 장기 저장을위한 처리되지 않은 뇌의 동결을 포함 그되게됩니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

신경 세포 염색의 골지 - 콕스 방법은 조직 학적 뇌 샘플 내에서 신경 세포의 형태에 대한 우리의 이해를 사전에 200 개 이상의 년 동안 사용되어왔다. 완전히 단일 구역 내에 포함 된 스테인드 뉴런을 식별하는 가능성을 증가시키기 위해, 가능한 한 최대 두께 뇌 부분을 제조 실용적인 관점에서 바람직하지만,이 방법은 높은 작업 거리만큼 기술적 인 관점에서 제한 -magnification 현미경 목표. 우리는 여기에 500 개 μm의 두께로 절단 마우스 뇌 섹션의 골지 - 콕스 방법을 사용하여 신경 세포를 염색하고, 고해상도 30 배 1.05 NA 실리콘 장착 직립 현미경을 사용하여이 부분의 깊이를 통해 뉴런을 시각화하기 위해 프로토콜을보고 800 μm의 작동 거리를 갖는 오일 액침 대물. 우리는 또한의 표면을 Counterstain과에 이용 될 수있다이 프로토콜의 두 가지 유용한 변종을보고크레 실 바이올렛 니슬 뇌 부분을 장착하기 전이나 절편 및 최종 처리에 장기 저장을위한 전체 뇌 동결. 주요 프로토콜과의 두 가지 변종은 전체 신경 세포의 수지상 나무와 수상 돌기 가시가 안정적으로 시각화 및 정량화 할 수있는 전체에 스테인드 두께 뇌 부분을 생산하고 있습니다.

Introduction

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조직 샘플 내의 개별 뉴런의 시각화는 뇌에 대한 우리의 이해를 전진 크게하고이 내인성 질환이나 외생 적 환경 적 요인에 의해 영향을받을 수있는 방법 신경 세포의 형태 학적 특성의 현장에서 분석이 가능합니다. 골지 - 콕스 염색법은 뇌에서 뉴런의 무작위 샘플을 염색하는 비용 효율적인 상대적으로 단순한 방법이다. 먼저 1800 년대에 골지 (1)에 의해 개발 콕스 2에 의해 수정, 연구자들은 또한, 시각화 및 수지상 트리 형태와 척추 밀도 3, 4 모두 정량화하는 데 사용할 수있는 명확하고 잘 스테인드 뉴런을 생산하기 위해 수년에 걸쳐이 기술을 세련했다 5, 6, 7, 8, 9,.

뇌 섹션 내에서 스테인드 뉴런의 시각화를위한 주요 ....

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Protocol

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성인 여성 CD1 - 변형 마우스는이 연구에 사용되었다. 유사 염색은 다양한 연령층에서 남녀 모두를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 실험 동물은 원칙과 동물 관리에있는 캐나다 협의회의 지침에 따라 마음에 든다고하고, 실험 프로토콜은 구 엘프 동물 관리위원회의 대학에 의해 승인되었다.

1. 골지 - 콕스 염색

  1. 두뇌의 골지 - 콕스 함침
    1. 별도로 고품질 물로 칼륨 중크롬산 및 크롬산 칼륨을 용해시켜 1 %의 골지 - 콕스 용액 (w / v)의 중크롬산 칼륨 0.8 % (w / v)의 크롬산 칼륨 1 % (w / v)의 염화 수은 만들기 . 상기 혼합 용액을 염화 수은을 추가 등급 1 여과지를 이용하여 최종 용액을 필터. 최대 1 개월 어둠 속에서 솔루션을 저장합니다.
    2. 5 %의 이소 플루 란을 사용하여 마우스를 마취.
    3. 잘린 마우스를 안락사 빠르게 두뇌를 제거합니다.
    4. 골지 - 콕스 용액 17 mL를 함유하는 20 ML 글래스 섬광 바이알로 뇌를 놓고 25 일 동안 실온에서 어두운 곳에서 배양한다.
    5. 24 시간 동안 4 ℃의 어두운 곳에서 (0.1 M 인산 완충액, pH가 7.4 / V) 슈 크로스 W (30 %) ....

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Results

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500 μm의 두께 뇌 구역 -이 골지체 콕스 - 염색 프로토콜과 두 바와 선택적 변이체 (400) 내의 개별 뉴런을 시각화하는데 이용 될 수있다. 10 배의 대물 렌즈와 Z 축에서 5 ㎛의 단계를 사용하여 캡처 이차원 Z-돌기 대표 화상 몽타주는도 1에 도시된다 : A1 - 전방 피질 영역 (1)과를 포함하는 코로나 뇌 부분의 넓은 영역에 대한 C1 이차 운동 피질 (18). 섹션 500 μm의 절단했다. 도 1B1의 부분의 표면을 따라 피질 pial 레이어 1 본 크레 실 바이올렛 염색 프로토콜을 포함하는 변형, 예를 들어 피질 세포층의 식별이 가능합니다. 모든 신선한 조직 (그림 1A1)과 프로토콜의 변형을 사용하여 주요 프로토콜을 사용하는 경우도 스테인드 섹션의 유사한 .......

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Discussion

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우리는 두께 뇌 부분에서 신경을 시각화 여기 골지 - 콕스 염색 프로토콜이 유용한 변종과 함께 설명합니다. 대표 결과에 나타낸 바와 같이, 긴 800 μm의 작동 거리가있는 고해상도 목적의 사용은 500 μm의 절단 뇌 부분의 깊이에 걸쳐 전체 뉴런의 신뢰성 시각화 수 있습니다. 비교적 두꺼운 뇌 섹션의이 연구는 모든 유형의 스테인드 신경 세포가 완전히 길고 복잡한 꼭대기 수지상 나무와 피라미드 뉴런에 특히 중요하다 슬라이스에 포함되는 확률을 증가시킨다. 예를 들어, 설치류 뇌의 관상 부에, 이는 입쪽 또는 꼬리 방향으로 멀리 연장 뉴런의 포함을 가능하게하고, 절편 단계 정면 뇌 차단시에도 오차 자유도를 증가시킨다. 우리는,이 프로토콜은 다른 PL에 절편을 위해 적용 할 수있는 관상면에서 절편의 뇌를 설명하지만필요에 따라 anes 완전히 하나의 섹션 내에서 신경 세포를 표지 포함합니다. 고용 단면의 평면은 조사중인 신경 세포 인구의 형태 학적 특성에 따라 달라집니다. 돌기 쪽이 시각과 높은 배율의 대물 렌즈가 척추 입력 / <.......

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Disclosures

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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이 작품은 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회, 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI 프로젝트 번호 30381)에서 CDCB에 존 R. 에반스 지도자 기금 연구 인프라 보조금, 그리고에 의해에서 CDCB에 발견 그랜트에 의해 지원되었다 NSERC에서 NJM에 발견 그랜트. ELL는 온타리오 대학원 장학금에 의해 구 엘프 대학의 온타리오 수의과 대학에서 OVC 장학금에 의해 지원되었다. CDS는 NSERC에서 학부 학생 연구 조교에 의해 지원되었다. ALM은 NSERC에서 알렉산더 그레이엄 벨 (Alexander Graham Bell) 장학금에 의해 구 엘프 대학의 온타리오 수의과 대학에서 OVC 장학금에 의해 지원되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
중크롬산 칼Fisher ScientificP188-100유해
크롬산 칼륨Fisher ScientificP220-100유해
염화수은Fisher ScientificS25423유해
Whatman 등급 1 여과지Fisher Scientific1001-185
이소플루란캐나다 제약 파트너
20mL 섬광 바이알Fisher Scientific03-337-4
자당Bioshop CanadaSUC700.1
인산나트륨 일염기시그마 AldrichS5011-500G
인산나트륨 이염기성 시그마 AldrichS9390-500G
50mL 원추형 튜브Fisher Scientific12-565-271
이소 펜탄피셔 사이언티픽AC1264700102- 메틸 부탄으로도 알려져 있습니다. 위험
한천Sigma AldrichA1296-100G
소형 중량 접시Fisher Scientific02-202-100
vibratomeLeicaVT1000 S
6-well tissue culture platesFisher Scientific08-772-1b
메쉬 바닥 조직 배양 인서트Fisher Scientific07-200-214
파라포마델히드(PFA), 16%전자 현미경 과학15710-S유해
수산화암모Fisher ScientificA669S-500유해
코닥 고정제 ASigma AldrichP7542
슈퍼프로스트 플러스 슬라이드Fisher Scientific12-550-15
CitroSolv 투명화제Fisher Scientific22-143-975
무수 에틸 알코올상업용 알코올N/A
크레실 바이올렛시그마 알드리치C1791
퍼마운트피셔 사이언티픽SP15-100
정립 현미경올림푸스BX53 모델
컬러 카메라, 12MBF BiosciencesDV-47dQImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
3D 전동 현미경 스테이지, 컨트롤러 및 에노더MBF BiosciencesN/AMBF Biosciences
4X 현미경 대물Olympus4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X 현미경 대물렌즈 Olympus10x 0.3 N.A. UPlan FL N 
30X 현미경 대물Olympus30x 1.05 N.A. UPlanSApo 
60X 현미경 대물렌즈Olympus60x 1.42 N.A. PlanAPO N
실리콘 이멀젼 오일OlympusZ-81114
Neurolucida 소프트웨어MBF Biosciences버전 10
ImageJ 소프트웨어미국 국립보건원(U.S. National Institutes of Health)현재 버전OME Bio-Formats 플러그인 설치
포토샵 소프트웨어Adobe버전 CS6
륨 CP0406V2성 늄 비트 렌즈 렌즈

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
  2. Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
  3. Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step....

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