방법 논문

전기 자극을 사용하여 Biowires 인간 줄기 세포 유래 심근 세포의 성숙

DOI:

10.3791/55373

⸱

2017년 5월 6일

 , 
1Toronto General Research Institute, University Health Network, 2Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 3Heart & Stroke/Richard Lewar Centre of Excellence, University of Toronto, 4Laboratory of Medicine and Pathobiology, University of Toronto

이 논문에서

요약

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심장 biowire 플랫폼은 전기 자극 3 차원 세포 배양을 조합하여 인간 배아 및 유도 된 다 능성 줄기 세포 유래 심근 (hPSC-CM)를 숙성에 사용되는 시험 관내 방법. 이 원고는 심장 biowire 플랫폼의 자세한 설정을 제공합니다.

초록

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인간 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMS)은 유망한 셀 원천이되어있다, 따라서 약물 발견, 질병 모델링, 조직 공학 및 재생 의학을 포함한 심장 연구에서의 응용 가능성의 조사를 격려했다. 그러나, 기존의 프로토콜에 의해 생산 세포는 네이티브 성인 심실의 심근에 비해 미성숙의 범위를 표시합니다. 많은 노력은 지금까지 달성 완만 한 성숙으로, hPSC-CM이 성숙되었습니다. 따라서 biowire라는 설계 시스템은, 시험 관내에서 성숙 상태 hPSC-CMS에 이끌 물리적 및 전기적 신호를 모두 제공하여 고안되었다. 시스템 I은 점진적으로 증가하는 주파수 전기장 자극을 받는다 정렬 심장 조직 (biowire)에 조립 강성 템플릿 봉합사 따라 겔화 콜라겐 타입 hPSC-CMS에 시드하는 미세 플랫폼을 사용한다. nonstimulated 컨트롤에 비해,biowired 심근 구조적 및 전기 생리 학적 성숙의 강화 정도를 나타내는 자극. 이러한 변화는 자극의 속도에 따라 달라집니다. 이 원고는 구체적으로 biowires의 설계 및 제작에 대해 설명합니다.

서론

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세포 기반 치료는 심장 수리 / 재생을 달성하기 위해 가장 유망한 및 조사 전략 중 하나입니다. 그것은 심장 조직 공학 및 생체 재료 1, 2의 공동 배달의 도움되었습니다. 대부분의 가능한 셀 소스 손상, 질병, 또는 세 마음 3에 잠재적으로 유익한 효과에 대한 동물 모델에서 연구되고있다. 특히, 상당한 노력이 인간 만능 줄기 세포를 사용되었습니다 (hPSC)은 심근 세포 (hPSC-CM), 심장 조직 공학에 대한 잠재적으로 무제한자가 세포 소스 - 유래. hPSC-CMS는 몇몇 확립 된 프로토콜 4, 5, 6을 사용하여 제조 될 수있다. 그러나, 수득 된 세포는 성체 심실의 심근 대비 7 미성숙 특성의 범위와 태아의 형상 표현형을 표시 8. 이는 신약 개발 연구에 성인 심장 질환 모델 (9)의 개발에 성인 심장 조직의 모델로 hPSC-의 CM 응용 프로그램에 장애물이 될 수 있습니다.

표현형 미숙의 이러한 한계를 극복하기 위해 새로운 접근 방식을 적극적으로 심근의 성숙을 촉진하기 위해 조사되었다. 초기 연구는 순환 기계 (10) 또는 전기 자극 (11)을 통해 신생아 래트 심근 세포의 효과적인 친 성숙 특성을 밝혀. 젤 압축 및 고리 기계적 자극은 또한 전기 생리 칼슘 취급 특성의 향상과 최소 hPSC-CM 성숙 (12, 13)의 일부 측면을 개선하는 것으로 나타났다. 따라서, "생물학적 와이어"(biowire)라는 플랫폼 시스템은 큐 구조와 전계 stimulatio 모두를 제공하여 고안된N은 hPSC의 CM-14의 성숙을 증진한다. 이 시스템은 전기장 자극 의무가 정렬 된 심장 조직을 만들기 위해 미세 플랫폼을 사용한다. 이것은 hPSC-CM이의 구조 및 전기 생리학적인 성숙을 개선하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 biowires을의 세부 사항을 설명합니다.

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프로토콜

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1. 마스터 디자인 및 제작

참고 : 장치 제조를위한 소프트 리소그래피를 사용합니다. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 성형 용 이층 SU-8을 마스터.

  1. 장치 (왼쪽 그림 1A) 디자인을 사용하고 제도 소프트웨어를 디자인합니다. 별도로 마스터의 각 층을 그린다. 마스터 (15)의 두 개의 층에 대응하는, dpi로 20,000 개의 포토 마스크에서 디바이스 디자인 인쇄. 투명 같은 디바이스 패턴과 같은 어두운 주변 영역을 설정; 마스크는 (다른 사람 (15)에 의해 기술 된 바와 같이) 광 리소그래피에 의해 SU-8에 디바이스 패턴을 전사하는 템플릿으로서 역할을한다.
  2. 4 인치 실리콘 웨이퍼의 중심에 SU-8 (50)의 약 4 mL로 분배. 코트 SU-8 (50) 30 초 동안 균등 분 (RPM) 2,000 rpm의 속도로 회전하는 스핀 코터를 사용하여 웨이퍼상의. 10 분 동안 95 ° C에서 핫 플레이트 상에 웨이퍼 굽는다. 자외선 (UV)에 리튬 웨이퍼 폭로200에서 엠제이 GHT / cm 2.
  3. 30 초 동안 2,500 RPM으로 상기 웨이퍼 및 회전 중심 상에 SU-8 2050 약 4 mL를 부어. 15 분 동안 95 ° C에서 핫 플레이트상에서 구워. 실온 (RT) 쿨.
  4. 단계를 반복 1.3 두 번 더.
  5. 제 1 층의 투명 마스크로 코팅 된 웨이퍼를 커버. 제 층을 만들기 위해 270 mJ의 / cm 2의 UV 광에 웨이퍼를 노출. 15 분 동안 95 ° C에서 핫 플레이트상에서 구워.
  6. 두 번 단계 1.3를 반복하여 SU-8 2050의 두 번째 레이어를 확인합니다.
  7. 노광 마스크를 이용하여 제 층에있는 기능을 2 층째 마스크 정렬. 그 후, 240 mJ의 / cm2로 UV 광에 노출. 15 분 동안 95 ℃에서 구워.
    주 : 노광 시간이 필요한 총 UV 조사량 사용하기 전에 날에 측정 된 UV 광 출력 세기에 의해 결정된다.
  8. 프로필렌 글리콜 모노 메틸 에테르 아세테이트 (PGMEA)에 침수 및 오비탈 진탕 기에서 30 분 동안 200 RPM으로 진탕하여 웨이퍼를 개발한다.
  9. 장소웨이퍼의 중심 :주의 배양 접시에 마스터는 (1 내지 10 중량의 비율 가교제 염기)를 PDMS 액을 붓는다. 모든 기능을 커버 및 공기 방울을 피하십시오.
  10. 2 시간 동안 70 ° C의 오븐에서 가열한다. PDMS의의 biowire 템플릿의 가장자리 (오른쪽 그림 1A) 주위를 잘라 날카로운 칼날을 사용합니다. 마스터에서 PDMS를 껍질입니다. 블레이드와 트리밍 장치. 20 분 동안 121 ℃에서 멸균 봉지 증기 오토 클레이브에서의 PDMS biowire 템플릿을 넣어.
  11. 바이오 안전성 캐비닛 (BSC)에서, 페트리 접시에 템플릿 biowire PDMS의 배치합니다. 채 채널 (그림 1B-I)의 양쪽에있는 홈에 착석하여 PDMS의 마이크로 웰의 채널의 중앙에 무균 수술 실크 봉합사 (6-0)의 조각을 탑재 핀셋을 사용합니다.

전기 자극 상공 회의소 2. 창조

  1. 2cm의 X : 폴리 직사각형 조각 (세로 × 가로 × 두께 쌍을0.85 cm X 0.35 cm)와 전기 자극 챔버의 구조로 사용 (도 2).
  2. 각각의 폴리 카보네이트 구조 부재의 중심선을 따라 2cm 떨어진 두 3mm 와이드 구멍을 뚫는다.
  3. 1.5 cm 길이 탄소봉 두 조각을 잘라. 끝에서 약 3mm 탄소봉으로 1mm의 폭 구멍을 뚫는다. 카본로드 관통 구멍 백금선 스레드 및 탄소 막대 주위를 감싸는 와이어를 조인다. 전기 자극기와 나중에 연결하기위한 백금 와이어의 타단에 클립을 첨부.
  4. 폴리 카보네이트 프레임 부분에 카본 봉을 삽입한다. 여섯 웰 플레이트의 웰에 탄소봉으로 조립 된 프레임을 놓는다.
  5. 웰에 PDMS 2 용액을 붓는다. 가까운 PDMS 표면 레벨을 유지하지만, 탄소봉의 저부에 도달하지 동안 PDMS에 폴리 카보네이트 프레임의 바닥을 담근다. 2 시간 동안 70 ° C의 오븐에서 가열한다.
  6. 여섯에서 전기 자극 챔버를 타고웰로 20 분 동안 121 ℃에서 증기 멸균 멸균 봉지에 넣고.

hPSC-의 CM 3. 효소 해리

  1. 확립 된 프로토콜을 사용하여 4 심근 세포로 분화를 유도하는 hPSC.
    주 : 간단히 확립 배아 체를 통해 심근 세포를 생성 (EB) 프로토콜 뼈 형태 형성 단백질 (4), 염기성 섬유 아세포 성장 인자, 액 티빈 A, 혈관 내피 성장 인자 및 Dickkopf 상동 1~4와 순차 보급 통해 줄기 프로 매체이다. biowires를 만들기 위해 차별화의 하루 20-34에서 사채를 사용합니다.
  2. P1,000 피펫 팁과 저 부착 판의 EB를 모아서 원추형 튜브에 옮긴다. 125 XG 및 RT에서 5 분 동안 원심 분리하여 펠렛. 하여 펠렛을 상층 액을 제거하고 재현 탁 미리 가온 (37) I 1 %의 데 옥시 리보 뉴 클레아 제를 함유하는 콜라게나 ° C 타입 I (DNase를 I). 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션소화.
  3. 예열, 37 ° C 5 mL를 넣고 125 XG 및 RT에서 5 분 동안 원심 분리하고 배지를 세척한다. 상층 액을 버린다. 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액 2 mL를 펠렛을 재현 탁하고, 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
  4. 3 %를 함유 정지 배지 1 mL를 넣고 (V / V)의 DNase의 I.
  5. 3-5 회 5 ml 주사기에 20 G (0.9 mm) 바늘을 부착하고이를 통해 EB 현탁액을 통과한다.
  6. 5 분 동안 280 XG에서 세탁 매체 원심 7 mL를 넣고. 상층 액을 버린다. Iscove의 수정 둘 베코의 매체 (IMDM)에서 펠렛을 재현 탁하고 얼음에 저장합니다. 혈구와 휴대폰 번호를 확인합니다. 5 분 동안 280 XG에서 원심 분리하여 0.5 × 106 세포 펠렛을보십시오. 상층 액을 제거합니다.
  7. 멸균 튜브를 혼합하기 전에 얼음에 사전 멋진 모든 젤 구성 요소. 다음 콜라겐 겔 성분 (최종 농도)을 믹스 : 2.1 ㎎ / ㎖ 래트 꼬리 콜라겐 타입 I, 24.9 mM의 글루코오스 23.8 mM의 NaH를CO 3 14.3 mM의 NaOH를 10 mM의 HEPES 및 1X M199 배지에서 10 % 세포 외 기질. 콜라겐과 마지막 세포 외 기질을 추가합니다. 로 pipetting 아래로 섞는다.
  8. 콜라겐 겔 3.5 μL와 0.5 × 106 세포를 재현 탁하고 잘 혼합한다.
  9. 0.5 cm 길이의 채널 (도 1B-II)로 세포 현탁액 4 μL를 추가하는 P10 피펫 팁을 사용한다. 멸균 된 핀셋 필요하다면 봉합사의 위치를 ​​조정한다.
  10. 확인 젤을 건드리지 않도록주의하면서 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 페트리 접시의 바닥을 커버. 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
  11. 세포 (그림 1B-III)를 커버하기에 충분한 배지 12 mL를 (예를 들어, 프로 또는 중간 셀 제조업체에서 권장하는 줄기)와 PBS를 교체합니다. 일주 37 ° C에서 인큐베이터에서 문화. 매일 매체를 변경합니다.

Biowire 재배 4. 전기 자극

  1. 에서BSC는, 전기 자극기 챔버를 수용하는 여섯 웰 플레이트의 각 웰에 PBS 2 mL를 넣고. 부드럽게 잘으로 멸균 전기 자극 장치를 배치 멸균 핀셋을 사용합니다. 우물에서 PBS를 폐기하십시오.
  2. 예열 배지 5 ㎖과 탄소봉 커버. 전기 자극 챔버 내의 biowires 마운트 무균 핀셋을 사용하여 상기 탄소봉 (도 2)에 수직 한 방향들을.
  3. 6 웰 플레이트의 상부에 뚜껑을 배치하지만, 전기 자극기와 연결 플레이트 외부 도달 충분한 백금 와이어를 떠난다. 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 6 웰 플레이트를 배치하고, 전기 자극에 백금 와이어를 연결한다.
  4. 이상성 반복 펄스, 1-MS 펄스 듀레이션, 3 V / cm, 초당 1 펄스 (PPS) 전기 다음 설정으로 자극기를 사용 biowires을 자극한다. 다음 값으로 PPS를 24 시간마다 상향 : 1.83, 2.66, 3.49, 40.82, 5.15 및 6 변경 매체 매일.
  5. 10 배 배율에서 현미경으로 전기 자극에 대한 응답으로 심근 수축력을 준수하십시오.
    참고 : 자극 일주일의 biowires이 성숙하게되면 (결과 섹션 참조).

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결과

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biowires의 봉합사를 사용하는 이성 한 축에 정렬하고 심장 섬유의 형상을 모방하는 3 차원 구조물의 형성을위한 템플릿으로서 역할을한다. 우리는 biowire 문화의 7 일 후에, 세포가 봉합 (그림 3A)의 주위에 젤을 개조 한 것으로 나타났습니다. 봉합사의 축을 따라 어셈블 세포는 심장 조직 (도 3)를 배열 형성한다. 예비 배양 7 일 후, 7 biowires 전기장 자극 일 심근의 구조적 및 기능적 성숙 호환 상기 전시 특성을 실시 하였다.

biowires에서 PSC-CM이 인간 심장 수축성 단백질의 강한 발현 sarcomeric α-티닌 및 액틴 (도 4a)을 나타내었다. 우리는 myofibrilar 협착 hPSC-CM 수축성 장치 및 배향 sarcomeri...

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토론

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이 원고는 hPSC-CM의 성숙을 향상시키기위한 엔지니어링 플랫폼 인 biowire의 설정과 구현을 설명합니다. 이 장치는 표준 미세 제조 시설에서 만들 수 있으며, 바이오 와이어는 일반적인 세포 배양 기술과 전기 자극기로 생산할 수 있습니다.

우리가 알기로는, 바이오 와이어와 비슷한 방법은보고 된 바 없다. 이 전략은 개선 된 성숙 특성이보다 높은 자극 속도 상승 요법 (6Hz 대 3Hz)을받은 바이 와이어에서 얻어진 성숙도가 높다는 것을 입증하는 것과 같이 전기 자극 요법에 의존한다는 것을 보여준다. biowires의 심근 세포는 20 일 (EBd20) 또는 40-44 일 (EBd44) 동안 재배 EBs에 비해 적은 자동 성과 높은 hERG 전류와 I K1 을 보여 주었다. EBd20 심근 세포는 biowires에 통합되기 전에 세포의 성질을 나타내는 반면, EBd44 심근 세포는 10 일 동안 배양되었다.onger에도 EB 형식 배양 ...

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공개 사항

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 작품은 보조금의 원조 심장에서 지원되었다 스트로크 캐나다 (G-14-0006265)의 재단, 건강 연구 (137352 및 143066), 그리고 JP 비켈 보조금의 캐나다 연구소에서 운영 보조금 (1013821 ) SSN합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
L-아스코르브산시그마A-4544hPSC-CM 배양 매체
구성 요소 AutoCADAutodesk, Inc장치
설계 소프트웨어 탄소 막대, Ø 3mm전기 자극기 챔버 구성 요소
콜라겐, 유형 1, 쥐 꼬리BD Biosciences354249콜라겐 겔: 10%의 성장 인자 감소 Matrigel이 포함된 1x M199 배지에서 24.9mM 포도당, 23.8mM NaHCO3, 14.3mM NaOH, 10mM HEPES에서 쥐꼬리 콜라겐 I형 2.1mg/mL.
콜라겐 분해 효소 유형 I SigmaC0130Ca2+ 및 Mg2+와 함께 PBS에서 0.2% 콜라겐분해효소 I형(w/v) 및 20% FBS(v/v). 0.22 &mu로 살균하십시오. m을 여과하고 12mL 부분 표본을 만듭니다. -20 °C에서 보관하십시오.
Deoxyribonuclease I (DNase I)EMD Millipore260913-25MU1 mg/mL DNase I 저장 용액을 물에 담가둡니다. 멸균 여과 및 0.5mL 부분 표본 보관 &-inus; 20 > C
드릴 & 드릴 비트 (Ø 1mm 및 2mm)Dremel폴리 카보네이트 프레임의 드릴 구멍
전기 자극기잔디s88x
소 태아 혈청 (FBS)WISENT Inc.080-450
D-(+)-포도당 SigmaG5767콜라겐 젤 구성
요소 L-글루타민Thermo Fisher Scientific25030081
H2OMilliQ18.2 MΩ &미드닷; cm 25 ° C, 초순수, 모든 용액을 만들기 위해
HEPESSigmaH4034콜라겐 젤 구성
요소 핫 플레이트Torrey PinesHS40
Iscove의 Modified Dulbecco's Medium(IMDM)Thermo Fisher Scientific12440053
Mask alignerEVG EVG 620
Matrigel, 성장 인자 감소 Corning354230콜라겐 겔 성분
Medium 199 (M199)Thermo Fisher Scientific11825015콜라겐 겔 성분
모노티오글리세롤(MTG)SigmaM-6145hPSC-CM 배양 배지 구성
Orbital shakerVWR89032-088
페니실린/스트렙토마이신(P/S)Thermo Fisher Scientific15070063
Ca2+ 및 Mg2+ 를 함유한 인산염 완충 식염수(PBS);Thermo Fisher Scientific14040133
플레이트(6-well)Corning353046
플레이트(6-well), 낮은 부착성Corning3471
Platinum wires, 0.2 mm전기 자극기 챔버 구성 요소
폴리디메틸실록산(PDMS)Dow CorningSylgard 184
프로필렌 글리콜 모노메틸 에테르 아세테이트 (PGMEA)Doe & 잉걸스 Inc.웨이퍼 파우치 개발을 위해
Peel-openConvertors92308스팀 살균
실리콘 웨이퍼, 4 inchUniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3)SigmaS5761콜라겐 겔 성분
수산화나트륨SigmaS8045콜라겐 겔 성분
Sprin coater특수 코팅 시스템G3P-8
StemPro-34 배양 배지Thermo Fisher Scientific10639011hPSC-CM 배양 배지. 50 mL를 만들기 위해, 1.3 mL 보충 교재, 500 &mu를 추가하십시오; 100×의 L; L-글루타민, 250 μ 30 mg/mL 트랜스페린의 L, 500 μ 5 mg/mL 아스코르브산의 l, 150 μ L of 26 μ l /2 mL 모노티오글리세롤(MTG) 및 500 μ L (1 %) 페니실린 / 스트렙토 마이신.
매체세척 매체 중지 : FBS (1 : 1)
SU-8 50 마이크로켐 주식회사포토레지스트, 마스터 컴포넌트
SU-8 2050 마이크로켐 주식회사포토레지스트, 마스터 구성 요소
TransferrinRoche10-652-202hPSC-CM 배양 배지 구성
트립신/EDTA, 0.25%Thermo Fisher Scientific25200056hPSC-CM 배양 배지 구성
1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유세척 배지
요소 요소 요소 한 IMDM

참고문헌

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