심장 biowire 플랫폼은 전기 자극 3 차원 세포 배양을 조합하여 인간 배아 및 유도 된 다 능성 줄기 세포 유래 심근 (hPSC-CM)를 숙성에 사용되는 시험 관내 방법. 이 원고는 심장 biowire 플랫폼의 자세한 설정을 제공합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
인간 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMS)은 유망한 셀 원천이되어있다, 따라서 약물 발견, 질병 모델링, 조직 공학 및 재생 의학을 포함한 심장 연구에서의 응용 가능성의 조사를 격려했다. 그러나, 기존의 프로토콜에 의해 생산 세포는 네이티브 성인 심실의 심근에 비해 미성숙의 범위를 표시합니다. 많은 노력은 지금까지 달성 완만 한 성숙으로, hPSC-CM이 성숙되었습니다. 따라서 biowire라는 설계 시스템은, 시험 관내에서 성숙 상태 hPSC-CMS에 이끌 물리적 및 전기적 신호를 모두 제공하여 고안되었다. 시스템 I은 점진적으로 증가하는 주파수 전기장 자극을 받는다 정렬 심장 조직 (biowire)에 조립 강성 템플릿 봉합사 따라 겔화 콜라겐 타입 hPSC-CMS에 시드하는 미세 플랫폼을 사용한다. nonstimulated 컨트롤에 비해,biowired 심근 구조적 및 전기 생리 학적 성숙의 강화 정도를 나타내는 자극. 이러한 변화는 자극의 속도에 따라 달라집니다. 이 원고는 구체적으로 biowires의 설계 및 제작에 대해 설명합니다.
서론
세포 기반 치료는 심장 수리 / 재생을 달성하기 위해 가장 유망한 및 조사 전략 중 하나입니다. 그것은 심장 조직 공학 및 생체 재료 1, 2의 공동 배달의 도움되었습니다. 대부분의 가능한 셀 소스 손상, 질병, 또는 세 마음 3에 잠재적으로 유익한 효과에 대한 동물 모델에서 연구되고있다. 특히, 상당한 노력이 인간 만능 줄기 세포를 사용되었습니다 (hPSC)은 심근 세포 (hPSC-CM), 심장 조직 공학에 대한 잠재적으로 무제한자가 세포 소스 - 유래. hPSC-CMS는 몇몇 확립 된 프로토콜 4, 5, 6을 사용하여 제조 될 수있다. 그러나, 수득 된 세포는 성체 심실의 심근 대비 7 미성숙 특성의 범위와 태아의 형상 표현형을 표시 8. 이는 신약 개발 연구에 성인 심장 질환 모델 (9)의 개발에 성인 심장 조직의 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 마스터 디자인 및 제작
참고 : 장치 제조를위한 소프트 리소그래피를 사용합니다. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 성형 용 이층 SU-8을 마스터.
- 장치 (왼쪽 그림 1A) 디자인을 사용하고 제도 소프트웨어를 디자인합니다. 별도로 마스터의 각 층을 그린다. 마스터 (15)의 두 개의 층에 대응하는, dpi로 20,000 개의 포토 마스크에서 디바이스 디자인 인쇄. 투명 같은 디바이스 패턴과 같은 어두운 주변 영역을 설정; 마스크는 (다른 사람 (15)에 의해 기술 된 바와 같이) 광 리소그래피에 의해 SU-8에 디바이스 패턴을 전사하는 템플릿으로서 역할을한다.
- 4 인치 실리콘 웨이퍼의 중심에 SU-8 (50)의 약 4 mL로 분배. 코트 SU-8 (50) 30 초 동안 균등 분 (RPM) 2,000 rpm의 속도로 회전하는 스핀 코터를 사용하여 웨이퍼상의. 10 분 동안 95 ° C에서 핫 플레이트 상에 웨이퍼 굽는다. 자외선 (UV)에 리튬 웨이퍼 폭로200에서 엠제이 GHT / cm 2.
- 30 초 동안 2,500 RPM으로 상기 웨이퍼 및 회전....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
biowires의 봉합사를 사용하는 이성 한 축에 정렬하고 심장 섬유의 형상을 모방하는 3 차원 구조물의 형성을위한 템플릿으로서 역할을한다. 우리는 biowire 문화의 7 일 후에, 세포가 봉합 (그림 3A)의 주위에 젤을 개조 한 것으로 나타났습니다. 봉합사의 축을 따라 어셈블 세포는 심장 조직 (도 3)를 배열 형성한다. 예비 배양 7 일 후, 7 biowires 전기장 자극 일 심근의 구조적 및 기능적 성숙 호환 상기 전시 특성을 실시 하였다.
biowires에서 PSC-CM이 인간 심장 수축성 단백질의 강한 발현 sarcomeric α-티닌 및 액틴 (도 4a)을 나타내었다. 우리는 myofibrilar 협착 hPSC-CM 수축성 장치 및 배향 sarcomeri.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 원고는 hPSC-CM의 성숙을 향상시키기위한 엔지니어링 플랫폼 인 biowire의 설정과 구현을 설명합니다. 이 장치는 표준 미세 제조 시설에서 만들 수 있으며, 바이오 와이어는 일반적인 세포 배양 기술과 전기 자극기로 생산할 수 있습니다.
우리가 알기로는, 바이오 와이어와 비슷한 방법은보고 된 바 없다. 이 전략은 개선 된 성숙 특성이보다 높은 자극 속도 상승 요법 (6Hz 대 3Hz)을받은 바이 와이어에서 얻어진 성숙도가 높다는 것을 입증하는 것과 같이 전기 자극 요법에 의존한다는 것을 보여준다. biowires의 심근 세포는 20 일 (EBd20) 또는 40-44 일 (EBd44) 동안 재배 EBs에 비해 적은 자동 성과 높은 hERG 전류와 I K1 을 보여 주었다. EBd20 심근 세포는 biowires에 통합되기 전에 세포의 성질을 나타내는 반면, EBd44 심근 세포는 10 일 동안 배양되었다.onger에도 EB 형식 배양 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 보조금의 원조 심장에서 지원되었다 스트로크 캐나다 (G-14-0006265)의 재단, 건강 연구 (137352 및 143066), 그리고 JP 비켈 보조금의 캐나다 연구소에서 운영 보조금 (1013821 ) SSN합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| L-아스코르브산 | 시그마 | A-4544 | hPSC-CM 배양 매체 |
| 구성 요소 AutoCAD | Autodesk, Inc | 장치 | |
| 설계 소프트웨어 탄소 막대, Ø 3mm | 전기 자극기 챔버 구성 요소 | ||
| 콜라겐, 유형 1, 쥐 꼬리 | BD Biosciences | 354249 | 콜라겐 겔: 10%의 성장 인자 감소 Matrigel이 포함된 1x M199 배지에서 24.9mM 포도당, 23.8mM NaHCO3, 14.3mM NaOH, 10mM HEPES에서 쥐꼬리 콜라겐 I형 2.1mg/mL. |
| 콜라겐 분해 효소 유형 I | Sigma | C0130 | Ca2+ 및 Mg2+와 함께 PBS에서 0.2% 콜라겐분해효소 I형(w/v) 및 20% FBS(v/v). 0.22 &mu로 살균하십시오. m을 여과하고 12mL 부분 표본을 만듭니다. -20 °C에서 보관하십시오. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | 1 mg/mL DNase I 저장 용액을 물에 담가둡니다. 멸균 여과 및 0.5mL 부분 표본 보관 &-inus; 20 > C |
| 드릴 & 드릴 비트 (Ø 1mm 및 2mm) | Dremel | 폴리 카보네이트 프레임의 드릴 구멍 | |
| 전기 자극기 | 잔디 | s88x | |
| 소 태아 혈청 (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-포도당 | Sigma | G5767 | 콜라겐 젤 구성 |
| 요소 L-글루타민 | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ &미드닷; cm 25 ° C, 초순수, 모든 용액을 만들기 위해 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | 콜라겐 젤 구성 |
| 요소 핫 플레이트 | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove의 Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, 성장 인자 감소 | Corning | 354230 | 콜라겐 겔 성분 |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11825015 | 콜라겐 겔 성분 |
| 모노티오글리세롤(MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM 배양 배지 구성 |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| 페니실린/스트렙토마이신(P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Ca2+ 및 Mg2+ 를 함유한 인산염 완충 식염수(PBS); | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| 플레이트(6-well) | Corning | 353046 | |
| 플레이트(6-well), 낮은 부착성 | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | 전기 자극기 챔버 구성 요소 | ||
| 폴리디메틸실록산(PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| 프로필렌 글리콜 모노메틸 에테르 아세테이트 (PGMEA) | Doe & 잉걸스 Inc. | 웨이퍼 파우치 개발을 위해 | |
| Peel-open | Convertors | 92308 | 스팀 살균 |
| 실리콘 웨이퍼, 4 inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | 콜라겐 겔 성분 |
| 수산화나트륨 | Sigma | S8045 | 콜라겐 겔 성분 |
| Sprin coater | 특수 코팅 시스템 | G3P-8 | |
| StemPro-34 배양 배지 | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM 배양 배지. 50 mL를 만들기 위해, 1.3 mL 보충 교재, 500 &mu를 추가하십시오; 100×의 L; L-글루타민, 250 μ 30 mg/mL 트랜스페린의 L, 500 μ 5 mg/mL 아스코르브산의 l, 150 μ L of 26 μ l /2 mL 모노티오글리세롤(MTG) 및 500 μ L (1 %) 페니실린 / 스트렙토 마이신. |
| 매체 | 세척 매체 중지 : FBS (1 : 1) | ||
| SU-8 50 | 마이크로켐 주식회사 | 포토레지스트, 마스터 컴포넌트 | |
| SU-8 2050 | 마이크로켐 주식회사 | 포토레지스트, 마스터 구성 요소 | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM 배양 배지 구성 |
| 트립신/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM 배양 배지 구성 |
| 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유 | 세척 배지 |
참고문헌
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005(2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and t....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
