상대적인 힘의 안티-TNF 단 클론 항 체 (mAb) 중화 방 청 TNF는 시험관에서 생물 메서드를 사용 하 여의 결정

요약

프로토콜 WEHI 164 셀 중립화 메커니즘을 사용 하는 안티-TNFα mAb의 상대 안티-apoptotic 활동의 결정에 대 한 여기에 제공 됩니다. 이 프로토콜은 같은 생물 학적 기능을 가진 다른 분자의 중립화 강도 비교 하는 데 유용.

초록

이 프로토콜 안티 TNFα mAb를 사용 하 여 마우스 fibroblast 세포 모델 (WEHI 164)에서 TNFα의 apoptotic 활동 중립화의 측정을 보여줍니다. 또한,이 프로토콜 융해 단백질 등 다른 안티 TNFα 분자를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 여기 고용 셀룰러 모델 TNFα 중재 된 apoptosis에 민감한 때 추가 스트레스 요소가 셀 문화 조건 (예: 혈 부족)에서 유도 된다. 이 절차 실행이 분석 분석 결과, 샘플 준비, 셀 희석, apoptosis 유도, 성공적인 결과 보장 하기 위해 중요 한 spectrophotometric 측정에 관련 된 주요 작업을 강조 표시 하는 방법을 예로 보여주. 이 프로토콜 apoptosis 유도 및 효율적인 신호 기록, 낮은 불확실성 값을 선도 하는 최고 성능 조건을 보여준다.

서론

생물 학적 힘 수량 (대량 표현)는 단백질 함량의 물리 화학적 측정 관련 생물 속성에 연결 된 분석 제품 특성에 따라 생물 학적 활동의 양적 척도 이다. 다른 분석 방법론을 함께 힘 테스트 제품 적합성, 안정성, 및 comparability 연구의 일부로 수행 됩니다. 이런이 의미에서 힘 측정 제품 배치에 맞는지 중요 한 품질 특성 (CQAs) 또는 승인 기준 및 시장 승인 후 임상 시험의 모든 단계를 설명 하는 데 사용 됩니다.

Apoptosis는 프로그램된 한 세포 죽음, 그 타협 세포 생존 능력 및 기능^1,2요소 바이러스 또는 세포는 환경에 의해 스트레스 세포 감염 때 자연스럽 게 발생. 다른 가운데, apoptosis 억제, 또는 생물 학적 중화 면역 중재 염증 성 질환 등 만성 질환의 치료에 특히 mAbs의 주로 알려진된 치료 메커니즘 중 하나입니다. 안티 TNFα 분자는 p55 p75 세포 표면 수용 체³, 마지막으로 세포 apoptosis 이어질 신호 경로 방지와 종양 괴 사 인자 알파 (TNFα)의 상호 작용을 차단 하 여 그들의 치료 속성을 발휘 한다.

프로토콜

1. 미디어와 솔루션의 준비

1. 문화 매체를 준비: RPMI-1640 10 %FBS, pH 7.4.
2. 준비 분석 결과 문화 매체: RPMI-1640 페 놀 레드 하지 않고 있지만 1 %FBS, pH 7.4.
3. 세포 세척 솔루션 준비: DPBS Mg 및 Ca 무료 솔루션 0.02 %EDTA, pH 7.4.
4. 세포 분리 솔루션 준비: 1 mm EDTA 0.125 %trypsin.
   1. 녹여 100 mL의 트립 신-EDTA와 메 마른 500 mL 플라스 크에 0.25% 솔루션.
   2. 믹스 셀의 100 mL와 함께 솔루션을 세척 하 고 15 mL 무 균 튜브에 15 mL aliquots 분배. -70-80 ° C까지 사용 하 게.
   3. 0.22 μ m 멤브레인 통해 이러한 솔루션을 필터링 하 고 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 37 ° C 까지의 따뜻한.
5. Apoptosis 유도 재고 솔루션 TNFα 솔루션 3.3 µ g/mL에서 준비.
   1. 500 µ L의 기본 컨테이너와 완전 한 ....

결과

(컨트롤)와 복용량 응답 그래프
그림 1 mAb 농도 대 발광 응답을 나타냅니다. 이 자형 기능 분석 결과 배양 세포 세포의 용 해 때문에 caspase 3 및 7 릴리스를 예로 보여주. 세포 죽음은 혈 청 기아 플러스 TNFα 유도 신호에 의해 향상 됩니다. 따라서, 안티-TNFα 분자 (mAb)는 TNF 세포 수용 체와의 상호 작용 (입체 방해)에 의해 억제 사이토카인 상호 작용 합니다. 이 인해 높은 mAb 농도에서 세포 생존.

메서드에서 사용 하는 컨트롤 했다: 분석 결과와 세포 매체, 셀 플러스 TNFα 플러스 분석 결과 문화 매체, 문화 및 문화 mediumalone 분석 결과. FBS 기아에서 분석 결과 문화 매체와 혼자 셀 apoptosis, 따라서 발광을 개.......

토론

이 특성화 비싸고 시간이 많이 걸리는 임상 시험 실시 전에 선험적으로 개발 중인 분자의 생물 학적 행동 결정에 도움이 됩니다. 승인 된 약 제품의 일괄 처리를 일괄 처리 릴리스도 유용합니다. 이 분석 실험 분자는 그것의 행동의 메커니즘에 대 한 적절 한 생물학적 효과 여부를 확인 하는 데 유용은 언급 가치가 있다. 이 자습서에 바이오 분석 방법은 다른 안티-TNFα 분자의 비교에 매우 중요입니다. 일반적인 물리 화학 방법에도 불구 하 고이 방법론 생물 학적 의미, 효능 및 따라서 이펙터 기능의 완전 하 고 전체 의미를 보여주는 품질 특성으로 약물의 효능을 통해 확인할 수 있다.

일반적으로, 세포 apoptosis 응답 TNFα 연구자 수행에 대 한 어려운 작업을 수 있습니다. 이 생물 학적 방법을 표준화 하기 전에 매일에 사용 되는 셀 뱅크의 특성화를 통해 문제 해결을 수행할 수 있습니다. 한 예로 셀 라인 노화¹²에 관.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
WEHI 164	ATCC	CRL-1751	Mus musculus의 섬유육종 세포
RPMI-1640 매체	ATCC	30-2001	매체 2 °에서 매체 저장; C에서 8 ° C
RPMI 1640 매체, 페놀 레드 없음	GIBCO	11835-030	매체 2°C에서 보관; C에서 8 ° C
Trypsin-EDTA (0.25 %), 페놀 레드	GIBCO	25200-056	-10 °C에서 매체를 저장; C에서 -20 ° C
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음	GIBCO	14190-136	에 매체 저장; C에서 8 ° C
재조합 인간 TNF-알파 단백질	R& D Systems	210-TA-020	-20 °에 저장; C에서 -70 ° C
태아 소 혈청 (미국), 슈퍼 로우 IgG	HyClone	SH3089803	-10 °에서 보관; C에서 -20 ° C
Fetal Bovine Serum (미국), -	HyClone	SH3007103	Store를 특성화; C에서 -20 ° C
Caspase-Glo 3/7 분석 키트	Promega	G8093	저장 Caspase-Glo. 3/7 기질 및 Caspase-Glo. 3/7 버퍼 at – 20 & 순서; C 보호 대상 Light
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. 시약	J.T.Baker	8993-01	--
Sample mAb Adalimumab	Probiomed	NA	마이크로플레이트의 최종 농도는 다음과 같습니다:  0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 및 0.004 μ g/mL
참조 및 제어 mAb Adalimumab	Abbvie	NA	마이크로플레이트의 최종 농도는 다음과 같습니다.  0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 및 0.004 μ g/mL
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