감수 분열은 gametes DNA 복제의 단일 라운드와 염색체 분리의 두 연속 라운드를 통해 형성 되는 발달 과정입니다. 포유류 감수 분열 meiotic 염색체 스프레드를 준비 하는 기법을 이용 하 여 시험 될 수 있다. 여기, 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵을 준비 하는 방법을 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
포유류의 감수 분열은 생식 세포에서 발생 하 고 공부 하 고 수 있는 특징 동적 개발 프로세스입니다. 메서드를 사용 하 여 슬라이드의 표면에 핵 확산 (보다는 오히려 그들에서 떨어지는 높이), 마우스 spermatocytes에 1997 년에 처음으로 설명 했다는 최적화 된 기술을 보여 줍니다. 이 방법은 널리 이용 되는 고품질 핵 겪고 I. Seminiferous 의향의 substages의 과다 생성 때문에 포유류 감수 분열을 공부 하는 실험실에서 tubules 먼저 spermatocytes를 소형 솔루션에 배치 됩니다. 다음 spermatocytes를 만드는 세포 현 탁 액, 자당 솔루션으로 출시 되 고 핵 정착 액 젖 유리 슬라이드에 전파 됩니다. Immunostaining, 다음 meiotic 프로세스에 밀접 한 단백질의 다양성 시험 될 수 있다. 예를 들어 synaptonemal 복잡 한, homologs의 염색체 축/코어를 함께 연결 하는 3 자간 구조의 단백질은 쉽게 구상 될 수 있다. Meiotic 재결합 단백질, 동종 재결합에 의해 DNA 두 배 물가 틈의 수리에 관련 된, 또한 의향의 진행을 평가 하는 immunostained 수 나. 여기 우리가 설명 하 고 자세하게에서 설명 널리 spermatocytes 청소년 이나 성인 남성 생쥐에서의 포유류 감수 분열을 공부 하는 기술.
서론
마우스는 포유류에서 감수 분열을 연구 모델 생물으로 광범위 하 게 사용 됩니다. 정상적인 발달 과정 및 감수 분열 중 발생 하는 결함을 평가할 수 있습니다. 타임 라인 및 의향 어 substages, 하는 동안 발생 하는 돌출 하는 특징의 진행으로 다양 한 특정 단백질 감수 분열의 규칙에 중요 한 프로세스에 관련 된 야생 유형 및 돌연변이 생쥐에서 특징 수 있습니다. 내가 (헨델과 Schimenti1검토) 세부에서 공부 될 수 있다 감수 분열 중 발생 하는 몇 가지 특수 프로세스. DNA 두 배 물가 틈 (DSB) 형성 및 수리, 재결합, synaptonemal 복잡 한 형성 및 염색체 분리 포함 됩니다.
Meiotic 프로세스의 중요 한 측면은 핵 시각과 광학 해결 되어 더 나은 포함 동종 염색체 구별 하 고 식별 의향 5 substages는 이루어져 I. 의향의 substages를 검사 하는 능력 그 synaptonemal 복잡 한 (SC)의 형성을 포함 하 여 특정 기능에 의해 특징. 사우스 캐롤라이나는 페어링 있도록 자간 단백질 비 계 및 homologs의 DNA 이중 가닥 브레이크 수리. Leptonema, 동안 homologs는 SC의 축 요소 답니다로 맞춥니다. 다음 zygonema 중 ....
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프로토콜
쥐를 포함 하는 모든 방법을 활용 높은 윤리 및 복지 표준, 그리고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 Drexel 대학 대학의과 대학에 의해 승인 했다.
1입니다. 솔루션 및 필요한 악기의 준비
- 초순 실험실 급료 물, pH 8.2-8.4 (표 1) 50 mL에 소형 추출 버퍼 (히)를 준비 합니다. 신선한 때마다, 얼음, 유지 하 고 확산; 준비의 2 시간 이내 사용 솔루션 이것은 줄이고 각각 DTT와 PMSF의 활동을 억제 하는 효소를 최적화 해야 합니다. 히의 10 mL를 사용 하 여 마우스 testes의 각 쌍에 대 한.
- 학년 물 초순 실험실의 10 mL에 자당의 0.342 g를 추가 하 여 100 mM 자당 솔루션 (신선한 각 시간)을 준비 합니다. 8.2에 pH를 조정
- 통 솔루션 준비 (1 %paraformaldehyde (PFA), 0.15% 트라이 톤 X-100, pH 9.2 1 N HCl 또는 1 N NaOH로 조정) 신선한 월별와 스토어 실내 온도에 그것은 빛 으로부터 보호. 작업 사진으로 사용 하기 위해 1 X PBS에서 4%로 16% 상용 PFA 시작 재고 희석 하 고 후-20 ° c.에 4 %aliquots 저장
- 통 솔루션을 준비 하려면 추가 4 %PFA ....
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결과
많은 수의 표면 그대로 homologs를 포함 하는 핵 확산을 제공 하는이 방법의 능력 세 가지 주요 요인에 따라 달라 집니다: 1) 소형 버퍼 (즉 히)를 적절 하 게에서 seminiferous tubules의 적절 한 보육 시간 부 어 spermatocyte 버스트에서 분해 하지 않는 핵 히, 2 부 화 연장) micropipetting 함께, clumped는 핵 3 분리 중단을 얻기 위해 셀의 자당 방울) 한 번에 한 방향으로 슬라이드 코팅 각 정착 제를 기울이기 그리고 아니라 앞 뒤로입니다. 일단 준비, 표면 확산 핵 immunostained 관심사의 단백질에 붙일 레이블된 항 체와 수 고와 현미경 검사 법 (대표적인 예는 그림 1 과 그림 2에 표시 됩니다 다음 몇 군데. 그림 1 (A), 핵 포함 균등.......
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토론
잘 확산, 좋은 품질 spermatocyte 핵의 높은 번호를 얻을,이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 히, 적절 한 seminiferous tubules의 닦지 seminiferous tubules의 적절 한 보육 시간을 포함 하 고 기술을 고용 통 코팅된 슬라이드에 자당 세포 현 탁 액 분산. 우리는 testes comparably 세 Chtf18에서 45 분, HEB에서 성인 기에 출생 후 하루 15에서에서 배열 하는 야생 타입 남성의 고환에서 seminiferous tubules를 품 어-null 생쥐는 인 큐베이 팅만 30 분 testes 절반 크기 포함 하기 때문에 상당히 적은 생식 세포8. 우리의 경험에서는, Chtf18의 부 화-대 제대로 해결된 homologs의 결과로 세포의 무결성을 손상 하는 30 분 이상 testes를 null. Seminiferous tubules만 흐린 자당 세포 현 탁 액을 얻기 위해 다진은 고 각 슬라이드 (2.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자 애비 해리스의 기술 지원을 인정 한다. 그들은 또한 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵 준비의 프로토콜을 최적화 하는 데 도움에 대 한 폴라 코헨과 김 웨이 인정 합니다. 저자는 또한 중요 한 독서의 카 렌 쉰들러에 의해 원고를 주셔서 감사합니다.
이 작품은 NIH R01 GM106262 K.M.B.에 의해 지원 되었다
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% 파라포름알데히드(포름알데히드 수용액) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | 16% 용액을 1X PBS로 4% 작업 재고로 희석하고 -20°C에서 부분 표본을 동결합니다. C |
| 테플론 프린트 3링 슬라이드 | 전자 현미경 과학 | 63418-11 | |
| 프리미엄 충전되지 않은 서리 끝 유리 슬라이드 | 여러 상업 브랜드 | 있습니다. 슬라이드를 에틸 또는 이소프로필 알코올로 청소하고 사용 전에 물기를 떨어뜨려 건조시킵니다; 슬라이드의 후속 사용에 따라 영구 마커 또는 연필로 서리 끝의 슬라이드를 라벨합니다 | |
| 수술용 가위 (날카롭고 뭉툭한 끝) | 고급 과학 도구 | 14001-12 | 유사한 유형의 다른 브랜드가 작동합니다. |
| 미세 팁 수술용 가위(날카로운 팁)Fine | Science Tools | 14058-11 | 유사한 유형의 다른 브랜드가 작동합니다 |
| . 직선 미세 팁 집게 | Fine Science Tools | 11050-10 | 유사한 유형의 다른 브랜드가 작동합니다 |
| . 곡선형 중간 팁 집게 | Fisher | 16100110 | 유사한 유형의 다른 브랜드가 작동합니다. |
| 메스 손잡이 | Fine Science Tools | 10003-12 | 유사한 유형의 다른 브랜드가 작동합니다 |
| 마우스 anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | 1:300에 사용 |
| Anti-centromere protein (human CREST 환자 혈청에서 유래) | 항체 통합 | 15-234-0001 | 1:50 |
| 가습 챔버 | 사용 우리는 Nunc 정사각형 배양 접시 500cm2 / 웰을 촉촉한 종이와 함께 사용합니다. 수건 | ||
| epifluorescence를 가진 광시야 현미경 | Leica microsystems | 모든 표준 모델 | |
| Coplin 항아리 | 여러 상업 브랜드 | 50ml 용량; 직경 40mm(1.6인치), 10개의 슬라이드 수용(뒤로) | |
| 페트리 접시 | 여러 상업 브랜드 | 직경 100 x 15mm 직경, 폴리스티렌 멸균 미처리 |
참고문헌
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spre....
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