감수 분열은 gametes DNA 복제의 단일 라운드와 염색체 분리의 두 연속 라운드를 통해 형성 되는 발달 과정입니다. 포유류 감수 분열 meiotic 염색체 스프레드를 준비 하는 기법을 이용 하 여 시험 될 수 있다. 여기, 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵을 준비 하는 방법을 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
포유류의 감수 분열은 생식 세포에서 발생 하 고 공부 하 고 수 있는 특징 동적 개발 프로세스입니다. 메서드를 사용 하 여 슬라이드의 표면에 핵 확산 (보다는 오히려 그들에서 떨어지는 높이), 마우스 spermatocytes에 1997 년에 처음으로 설명 했다는 최적화 된 기술을 보여 줍니다. 이 방법은 널리 이용 되는 고품질 핵 겪고 I. Seminiferous 의향의 substages의 과다 생성 때문에 포유류 감수 분열을 공부 하는 실험실에서 tubules 먼저 spermatocytes를 소형 솔루션에 배치 됩니다. 다음 spermatocytes를 만드는 세포 현 탁 액, 자당 솔루션으로 출시 되 고 핵 정착 액 젖 유리 슬라이드에 전파 됩니다. Immunostaining, 다음 meiotic 프로세스에 밀접 한 단백질의 다양성 시험 될 수 있다. 예를 들어 synaptonemal 복잡 한, homologs의 염색체 축/코어를 함께 연결 하는 3 자간 구조의 단백질은 쉽게 구상 될 수 있다. Meiotic 재결합 단백질, 동종 재결합에 의해 DNA 두 배 물가 틈의 수리에 관련 된, 또한 의향의 진행을 평가 하는 immunostained 수 나. 여기 우리가 설명 하 고 자세하게에서 설명 널리 spermatocytes 청소년 이나 성인 남성 생쥐에서의 포유류 감수 분열을 공부 하는 기술.
서론
마우스는 포유류에서 감수 분열을 연구 모델 생물으로 광범위 하 게 사용 됩니다. 정상적인 발달 과정 및 감수 분열 중 발생 하는 결함을 평가할 수 있습니다. 타임 라인 및 의향 어 substages, 하는 동안 발생 하는 돌출 하는 특징의 진행으로 다양 한 특정 단백질 감수 분열의 규칙에 중요 한 프로세스에 관련 된 야생 유형 및 돌연변이 생쥐에서 특징 수 있습니다. 내가 (헨델과 Schimenti1검토) 세부에서 공부 될 수 있다 감수 분열 중 발생 하는 몇 가지 특수 프로세스. DNA 두 배 물가 틈 (DSB) 형성 및 수리, 재결합, synaptonemal 복잡 한 형성 및 염색체 분리 포함 됩니다.
Meiotic 프로세스의 중요 한 측면은 핵 시각과 광학 해결 되어 더 나은 포함 동종 염색체 구별 하 고 식별 의향 5 substages는 이루어져 I. 의향의 substages를 검사 하는 능력 그 synaptonemal 복잡 한 (SC)의 형성을 포함 하 여 특정 기능에 의해 특징. 사우스 캐롤라이나는 페어링 있도록 자간 단백질 비 계 및 homologs의 DNA 이중 가닥 브레이크 수리. Leptonema, 동안 homologs는 SC의 축 요소 답니다로 맞춥니다. 다음 zygonema 중 synaptonemal 복잡 한 중앙 요소 첨부 파일 homologs의 쌍 사이 연결 및 물리적 연결을 (synapsis)을 촉진 한다. Pachynema, 동안 homologs의 synapsis 완료 되 고 DNA 크로스 동종 재결합을 통해 DNA 두 배 물가 틈의 선택 인구의 수리에서 형성 된다. 사우스 캐롤라이나 동안에 diplonema, homologs desynapse 하지만 그들의 centromeres, DNA 크로스의 사이트에 연결 된 남아 있도록 디스어셈블 합니다. 마지막으로 동안에 diakinesis, homologs recondense 그리고 분열에 전환1.
역사적으로, 특히 그 의향의 초기 단계에서 몇 가지 핵 나왔고 meiotic chromatin의 표면 확산 나2. 결과적으로, 이러한 방법은 조직 즉 고환 (난소)에서 세포의 분리, 확산 meiotic chromatin의 기술과 높은 품질 meiotic 핵 평가2,3, 의 수확량을 개선 하기 위해 수정 된 4. 또한,이 방법은 핵 보존에 유용 하 게 입증 하 고 chromatin meiotic 핵에서 단백질 바인딩 같이 게시 된 immunolocalization 기법5,,67. 메서드를 처음 피터 스2 로 설명 하 고 시연 여기 수익률 겪고 의향의 leptotene, zygotene, pachytene, diplotene, 및 diakinesis substages homologs를 포함 하는 많은 별도 버스트 spermatocyte 핵 따라서, 내가.
표면 확산 핵 (chromatin 확산 분석이 라고도 함)을 준비 하는 기술은 감수 분열 생식과 세포 생물학의 분야에서 연구에 널리 사용 됩니다. 표면 확산 핵 포함 된 슬라이드 수 이후에 관심사의 단백질에 항 체와 immunostained 또는 실버 얼룩, 대상이 되며 다음 현미경으로 분석. 메서드는 수정 여성 쥐2에 대 한 설명 되었습니다 비록 둘 다 남성과 여성 쥐에 대 한 유사. 그것은 overmince seminiferous tubules를 하지 중요 합니다. 핵 해야 합니다 또한 잘 확산 될 immunostaining homologs 다음 있도록 하 고 관련된 단백질 현미경으로 명확 하 게 볼 수 있습니다. 표면 확산 핵 불과 몇 시간에 어느 immunostained 즉시 준비 하거나 3 주 전에 해빙 및 immunostaining의 최대-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 그러나, 어떤 단백질에 대 한 최적의 결과 가져옵니다 가장 immunostaining 즉시 또는 표면 확산 핵 준비 2 주 이내에 수행 되는 경우. 슬라이드, 관심사의 단백질에 항 체를 사용 하 여 표준 프로토콜 immunostained 수 뒤에 2 차 항 체에 형광 활용된 단백질 또는 염료, 부 화 후 형광 현미경8군데. 출생 후 하루 15-21에서 6-10 슬라이드를 야생 타입 testes의 쌍 당 충분 한 조직 그리고 더 오래 된 쥐 (성인 포함) 더 많은 슬라이드를 얻을 것입니다. 그러나, 강포한 유형 쥐 6 주 동안 얻을 것입니다 또한 immunostaining 다음 슬라이드에 더 포스트 meiotic 세포 (예: spermatids). 또한, 의향의 모든 substages 내가 관찰할 수 있습니다 청소년과 성인 쥐에서. 출생 후 일 15 10 남성에서 고환 많은 leptotene 및 zygotene 셀을 얻을 것입니다. 쥐 출생 후 하루 14 ~ 15 보다 오래 된 pachytene 및 diplotene 핵을 더 얻을 것입니다.
여기 우리가 설명 하 고 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵 준비의 널리 사용 방법을 보여 줍니다.
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프로토콜
쥐를 포함 하는 모든 방법을 활용 높은 윤리 및 복지 표준, 그리고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 Drexel 대학 대학의과 대학에 의해 승인 했다.
1입니다. 솔루션 및 필요한 악기의 준비
- 초순 실험실 급료 물, pH 8.2-8.4 (표 1) 50 mL에 소형 추출 버퍼 (히)를 준비 합니다. 신선한 때마다, 얼음, 유지 하 고 확산; 준비의 2 시간 이내 사용 솔루션 이것은 줄이고 각각 DTT와 PMSF의 활동을 억제 하는 효소를 최적화 해야 합니다. 히의 10 mL를 사용 하 여 마우스 testes의 각 쌍에 대 한.
- 학년 물 초순 실험실의 10 mL에 자당의 0.342 g를 추가 하 여 100 mM 자당 솔루션 (신선한 각 시간)을 준비 합니다. 8.2에 pH를 조정
- 통 솔루션 준비 (1 %paraformaldehyde (PFA), 0.15% 트라이 톤 X-100, pH 9.2 1 N HCl 또는 1 N NaOH로 조정) 신선한 월별와 스토어 실내 온도에 그것은 빛 으로부터 보호. 작업 사진으로 사용 하기 위해 1 X PBS에서 4%로 16% 상용 PFA 시작 재고 희석 하 고 후-20 ° c.에 4 %aliquots 저장
- 통 솔루션을 준비 하려면 추가 4 %PFA 솔루션의 10 mL와 10%의 600 µ L 트라이 톤 X-100 1 X PBS의 30 mL를 섞어 잘, 그리고 9.2 1 N HCl 또는 1 N NaOH로 pH를 조정. (더 이상 4 주)에 대 한 실 온에서 알루미늄 호 일에 싸여 50 mL 원뿔 튜브에 통 솔루션을 저장 합니다.
- 포토 플로 200 세척 솔루션 (해당 되는 동안 슬라이드 마지막 30 분 건조) 준비: 0.4% 포토 플로 200/PBS (320 µ L 포토 플로 200의 1 X PBS의 80 ml에서) 및 0.4% 포토 플로 200/dH2O (160 µ L 포토 플로 200 초순 실험실 급료 물 40 mL에). 가득한 솔루션의 40 mL 50 mL Coplin jar를 사용 하 여 한 번에 10 개 이하의 슬라이드를 씻어.
- 다음 악기를 준비: 1 켤레 (피부 incise)을 수술가 위, 좋은 팁 (incise 복)을 수술가 위의 1 개 쌍 (각 고환 개 해 부)를 바로 좋은 팁 겸, 2 쌍 1 똑 바른 가장자리 면도기 블레이드 (각 고환 incise), 2 쌍의 곡선 (각 고환 고정을 짜 seminiferous tubules) 팁 집게, 50 mL Coplin 항아리, 테 플 론 인쇄 3 링 슬라이드, 크기 11 블레이드, 습도 챔버, 100 x 15 mm 페 트리 접시, 좋은 팁 영구 마커 또는 연필, 1 메스와 플랫폼 회전 통입니다.
- 충전된 장소 프리미엄 통 솔루션 사용까지 가득 50 mL Coplin jar에 똑바로 두르고 끝 유리 슬라이드 precleaned.
참고: 연필 슬라이드 에탄올, 형광 제자리에서 교 잡 등을 요구 하는 절차에서 이후에 사용 하는 경우 기본 설정입니다.
- 충전된 장소 프리미엄 통 솔루션 사용까지 가득 50 mL Coplin jar에 똑바로 두르고 끝 유리 슬라이드 precleaned.
2. spermatocyte 핵 확산
- 기관 지침 (또는 CO2 질 없이 예: 자 궁 경부 전위)에 따라 남성 마우스 안락사
- 사용 P10-P20 남성 spermatogenesis;의 물결 meiotic 세포 평가 하 우리는 일상적으로 사용 P15-의향 I. 성인 testes 제공의 모든 substages에서 세포를 얻기 위해 P17 남성 의향에서 세포 나도, 하지만 그들은 또한 spermatids와 같은 더 postmeiotic 셀을 얻을 것입니다.
- 수확 및 무게 testes (짝된 무게 기록); 그런 다음 그들을 축축한 유지를 추운 히 몇 방울을 포함 하는 배양 접시에 배치 합니다.
- 고환 접시의 바닥에 대 한 곡선된 팁 집게로 누른 직선 가장자리 면도기 블레이드는 고환의 캡슐을 통해 작은 수직 중간 절 개를 사용 하 여. 여전히 한 집게와 접시의 바닥에는 고환 잡고, 곡선된 팁 집게 또는 직선 모서리 면도날의 두 번째 집합을 사용 하 여 부드럽게는 고환에서 seminiferous tubules를 짠 다.
- 찬 히, 캡슐의 튜브에 않도록 하기 위해 돌의 10 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에는 tubules를 놓습니다. 두 번째 고환이이 단계를 반복 합니다.
- 포함 하는 고환의 크기에 따라 30-60 분 동안 얼음에 히 원뿔 튜브에 decapsulated seminiferous tubules를 품 어. 한 쌍의 고환 무게 30 mg에서 seminiferous tubules를 품 어 이하로 30 분, 60 분에 대 한 30-45 분, 그리고 큰 고환에 대 한 31 ~ 50 밀리 그램을 무게 testes의 쌍에서 tubules. 하나의 고환에 대 한 시간을 변경 하지 않습니다.
참고: 최적의 부 화에 실험, 사용, 시 약 및 분석 되는 쥐의 경험에 따라 달라질 수 있습니다. - Seminiferous tubules 히에 잠복기는, 하는 동안 마커 또는 연필 마우스 precleaned 슬라이드의 서리로 덥은 끝 번호, 슬라이드 번호 및 날짜를 사용 합니다. 다음 통 솔루션이 포함 된 Coplin jar에 미리 청소 슬라이드를 놓습니다.
- 부 화, 다음 깨끗 한 Petri 접시와 약 3 m m 직경 수 풀에 별도 tubules tubules와 히를 붓는 다. 각 덩어리 생성 2 슬라이드 하 고 굴복 하는 슬라이드 수 고환의 크기에 따라 다릅니다.
참고: 우리는 야생 타입 subfertile Chtf18에서 6 슬라이드에서 8 슬라이드 얻을-P16 testes (있는) meiotic mitotic 세균 세포8의 감소 숫자로 인해 작은 null. 한 성인 고환 100 밀리 그램 이상의 무게 16 슬라이드를 예상 될 것 이다. - 테 플 론의 한 반지로 100mm 자당 솔루션의 장소 23 µ L 인쇄, 3 슬라이드 링 반지 seminiferous tubules의 한 덩어리를 추가. 다음을 사용 하 여 곡선 팁 겸 덩어리를 잡고, 부드럽게 솔루션 흐린 될 때까지 크기 11 면도날으로 tubules를 말하다.
참고:이 조각난된 염색체에 발생 overmince 하지 않습니다. Note 조각난된 염색체 돌연변이 표현 형을 나타내는 수도 수 있습니다. - 이물질 제거, 자당 솔루션의 또 다른 23 µ L을 추가 하 고는 micropipette를 사용 하 여 부드럽게 플라스틱 혼합물을 위아래로 몇 번 하는 정지에서 세포를 분리 하는 데 도움이.
- 포함 된 통 솔루션 Coplin jar에 몸을 담글 슬라이드를 제거 하 고 그 하나의 관대 한 방울 슬라이드의 하단 모서리에서 수집 그래서 항아리에 슬라이드를 기울기.
- 피펫으로 20 µ L 프리미엄 통 물방울에 테 플 론 인쇄 3 링 슬라이드의 반지에서 자당 세포 현 탁 액의 젖 빛 유리 슬라이드, 그리고 피펫으로 위아래로 2-서 스 펜 션 3 번.
참고: 통 방울 되어야 합니다 볼륨에 충분히 큰 그래서 그것에 자당 세포 현 탁 액의 20 μ의 추가 허용 범위 전체 슬라이드에 걸쳐 혼합물 (2.11 아래 참조) 전염 됩니다.
- 피펫으로 20 µ L 프리미엄 통 물방울에 테 플 론 인쇄 3 링 슬라이드의 반지에서 자당 세포 현 탁 액의 젖 빛 유리 슬라이드, 그리고 피펫으로 위아래로 2-서 스 펜 션 3 번.
- 천천히 기울기 확산 슬라이드의 길이 따라 세포 현 탁 액을 방울 반대 측면에 슬라이드. 다음 슬라이드를 천천히 기울기 다시 완전히 커버 슬라이드의 너비를 따라 세포 현 탁 액을 확산. 슬라이드 보다 더 한 번 그렇지 않으면 셀 서로 겹칠 것의 동일한 지역에 정지를 확산 하지 마십시오.
- 즉시 슬라이드 습도 챔버에 평평 하 게 놓고 반복 단계 2.8 2.11 seminiferous tubules의 모든 대단히 짧은 시간까지 슬라이드를 만들기 위해 사용 되었습니다. 그것은 찢 어과 셀 중복을 피하기 위해 건조 과정에서 습도 챔버를 이동 하지 해야 합니다.
- 그들은 천천히 하 고 완전히 건조 되도록 2.5 h에 대 한 실 온에서 덮여 습도 챔버에 품 어를 슬라이드 수 있습니다. 높은 습도 및이 단계에서 느린 건조는 chromatin의 적절 한 확산 되도록 중요 하다. 그리고 챔버의 커버를 제거 슬라이드 추가 30 분 완전히 건조를 허용 합니다.
- 슬라이드 (다시 뒤로 또는 지그재그 패턴) 0.4% 포토 플로 200/1 X PBS 솔루션 포함 Coplin jar에 고는 슬라이드를 두 번, 5 분을 세척, 부드럽게는 Coplin agitating, 통을 회전 하는 플랫폼에 항아리. 각 세척에 대 한 신선한 솔루션을 사용 하 고는 세척의 각각에 대해 별도 항아리에 다른 마우스에서 슬라이드를 계속.
- 교 반 하면서 한 번 포함 하는 5 분 동안 0.4% 포토 플로 200/dH2O 솔루션 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.
- 제거 슬라이드는 Coplin jar (마지막 세척), 신중 하 게 하 게 가장자리와 과잉 액체를 제거 하는 슬라이드의 바닥 닦아 하 고 건조 각도, 거의 직 립 위치에 슬라이드를 배치. 이 기술에 능숙 한 실험 자 수 처리 하 고 하루에 4 또는 5 쥐에서 표면 확산 핵을 준비.
- 일단 건조 (15-20 분), 즉시 면역 형광 염색 법 또는-80 ° c 최대 3 주에 대 한 빛에서 보호 된 단단히 닫은 슬라이드 상자에서 저장소에 대 한 슬라이드를 처리 (; 평가 대상 단백질에 따라 최적의 결과 얻을 수 있습니다 경우 스테인드 같은 일 또는 2 주 이내).
- -80 ° C에 저장 하는 경우 다음에 실내 온도와 서 얼룩이 지기 전에 5 분 동안 1 Coplin jar에 X PBS 또는 블록 세척 슬라이드 수 있습니다.
참고: 많은 다른 면역 형광 얼룩 프로토콜; 좋은 결과 제공할 것입니다. immunostaining 프로토콜8버코위츠 외.를 참조 하십시오.
- -80 ° C에 저장 하는 경우 다음에 실내 온도와 서 얼룩이 지기 전에 5 분 동안 1 Coplin jar에 X PBS 또는 블록 세척 슬라이드 수 있습니다.
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결과
많은 수의 표면 그대로 homologs를 포함 하는 핵 확산을 제공 하는이 방법의 능력 세 가지 주요 요인에 따라 달라 집니다: 1) 소형 버퍼 (즉 히)를 적절 하 게에서 seminiferous tubules의 적절 한 보육 시간 부 어 spermatocyte 버스트에서 분해 하지 않는 핵 히, 2 부 화 연장) micropipetting 함께, clumped는 핵 3 분리 중단을 얻기 위해 셀의 자당 방울) 한 번에 한 방향으로 슬라이드 코팅 각 정착 제를 기울이기 그리고 아니라 앞 뒤로입니다. 일단 준비, 표면 확산 핵 immunostained 관심사의 단백질에 붙일 레이블된 항 체와 수 고와 현미경 검사 법 (대표적인 예는 그림 1 과 그림 2에 표시 됩니다 다음 몇 군데. 그림 1 (A), 핵 포함 균등...
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토론
잘 확산, 좋은 품질 spermatocyte 핵의 높은 번호를 얻을,이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 히, 적절 한 seminiferous tubules의 닦지 seminiferous tubules의 적절 한 보육 시간을 포함 하 고 기술을 고용 통 코팅된 슬라이드에 자당 세포 현 탁 액 분산. 우리는 testes comparably 세 Chtf18에서 45 분, HEB에서 성인 기에 출생 후 하루 15에서에서 배열 하는 야생 타입 남성의 고환에서 seminiferous tubules를 품 어-null 생쥐는 인 큐베이 팅만 30 분 testes 절반 크기 포함 하기 때문에 상당히 적은 생식 세포8. 우리의 경험에서는, Chtf18의 부 화-대 제대로 해결된 homologs의 결과로 세포의 무결성을 손상 하는 30 분 이상 testes를 null. Seminiferous tubules만 흐린 자당 세포 현 탁 액을 얻기 위해 다진은 고 각 슬라이드 (2...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자 애비 해리스의 기술 지원을 인정 한다. 그들은 또한 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵 준비의 프로토콜을 최적화 하는 데 도움에 대 한 폴라 코헨과 김 웨이 인정 합니다. 저자는 또한 중요 한 독서의 카 렌 쉰들러에 의해 원고를 주셔서 감사합니다.
이 작품은 NIH R01 GM106262 K.M.B.에 의해 지원 되었다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% 파라포름알데히드(포름알데히드 수용액) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | 16% 용액을 1X PBS로 4% 작업 재고로 희석하고 -20°C에서 부분 표본을 동결합니다. C |
| 테플론 프린트 3링 슬라이드 | 전자 현미경 과학 | 63418-11 | |
| 프리미엄 충전되지 않은 서리 끝 유리 슬라이드 | 여러 상업 브랜드 | 있습니다. 슬라이드를 에틸 또는 이소프로필 알코올로 청소하고 사용 전에 물기를 떨어뜨려 건조시킵니다; 슬라이드의 후속 사용에 따라 영구 마커 또는 연필로 서리 끝의 슬라이드를 라벨합니다 | |
| 수술용 가위 (날카롭고 뭉툭한 끝) | 고급 과학 도구 | 14001-12 | 유사한 유형의 다른 브랜드가 작동합니다. |
| 미세 팁 수술용 가위(날카로운 팁)Fine | Science Tools | 14058-11 | 유사한 유형의 다른 브랜드가 작동합니다 |
| . 직선 미세 팁 집게 | Fine Science Tools | 11050-10 | 유사한 유형의 다른 브랜드가 작동합니다 |
| . 곡선형 중간 팁 집게 | Fisher | 16100110 | 유사한 유형의 다른 브랜드가 작동합니다. |
| 메스 손잡이 | Fine Science Tools | 10003-12 | 유사한 유형의 다른 브랜드가 작동합니다 |
| 마우스 anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | 1:300에 사용 |
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참고문헌
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