방법 논문

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

DOI:

10.3791/55382

⸱

2017년 2월 16일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 3Barbara Davis Center for Childhood Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 4Department of Biomedical Research, National Jewish Health

이 논문에서

요약

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기능 및 표현형 분석 항원 반응성 B 세포를 검출하고 풍부 자성 나노 입자를 이용한 간단하면서도 효과적인 방법을 설명한다.

초록

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B 세포는 특정 항원과 반응하며 일반적으로 림프구의 <0.05%의 빈도로 발생합니다. 수십 년 동안 연구자들은 표현형과 생물학을 연구하기 위해 이러한 희귀 세포를 분리하고 농축하는 방법을 모색해 왔습니다. 이러한 접근법은 필연적으로 B 세포가 항체의 특이성을 대표하는 세포 표면 수용체(cell surface receptor)를 통해 천연 항원을 인식하며, 이 수용체는 결국 분화된 딸에 의해 분비된다는 원칙에 기초합니다. 아마도 이 문제에 대한 가장 분명한 접근 방식은 형광 활성화 세포 분류(FACS)와 함께 형광 접합 항원을 사용하는 것입니다. 그러나 이러한 방법의 유용성은 세포 주파수와 전자 분류를 통한 달성 가능한 분석 및 분리 속도에 의해 제한됩니다. 대규모 시작 세포 집단에서 항원 반응성 B 세포를 고수율 농축하는 결과를 낳는 자성 나노입자를 사용하여 희귀 항원 특이적 B 세포를 농축하는 새로운 방법이 설명됩니다. 이 방법을 사용하면 면역 후 또는 자가면역 발달 중과 같이 생체 내 항원 만남 전과 후에 항원 반응 세포의 표현형 및 생물학을 개선할 수 있습니다.

서론

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제한 희석하여 항체 - 분비 세포의 전구체 빈도 분석은 특정 항원에 대한 반응성 B 세포는 통상적으로 접종 상태 및 항원 상에 존재하는 항원의 크기 / 수에 따라, 통상의 레퍼토리 0.05 % 내지 0.005의 주파수에서 발생하는 것을 제안했다. 이러한 세포의 낮은 주파수는 어려운 등 외국 항원, 또는자가 면역의 개발 기간 동안 다음과 같은 예방 접종 또는 노출과 같은 면역 반응의 개발 기간 동안 자신의 상태 변화를 연구했다. 이전 연구자가 항원 - 코팅 된 적혈구 리셋 항원 코팅 된 플레이트 또는 열 흡착제로부터 레인 징 기술을 사용하여 항원 - 반응성 B 세포의 분리 맡은 1, 2, 3, 4, 5, 6 정렬 셀을 형광 - 활성화. Thoug이러한 기술은 항원 - 반응성 B 세포를 식별 분리에 성공했다 (H)는, 그 결과 수율, 순도 및 확장 성면에서 다양하다. 최근에 우리는 모두 감지하고 자기 나노 입자를 사용하여 희귀 한 B 림프구의 소집단을 풍부하게 할 수있는 새로운 방법을 개발했다. 이 방법은 큰 시작 인구에서 상대적으로 높은 수율과 순도 농축 수, 항원에 대한 반응의 분석과 호환됩니다. 현탁액 중의 세포의 집단에서 농축함으로써, 상기 방법은 항원 - 코팅 된 플레이트 또는 열 및 제한 처리량의 구조와 관련된 제약을 제거한다. 농축 된 세포가 항원과 형광 리포터와 관련된 남아 보낸 마지막으로, 이들은 더 FACS 분류에 의해 정제 할 수있다. 여기에 설명 된 바와 같이 우리는 다양한 autoi와 과목에서이 전 말초 혈액 파상풍 톡소이드 반응성 B 세포의 연구와 인체의 다음과 같은 예방 접종에 대한 접근뿐만 아니라,자가 항원 반응 B 세포를 사용했다제 1 형 당뇨병, 그레이브스 병, 하시모토 병 (7)을 포함 mmune 장애. 상기 방법은 마우스 및 인간에서 동일하게 작동하며, 다양한 조직 (제조에서 원고)에서 항원 - 반응성 B 세포 분석과 호환된다.

기본적인 형태로, 말초 혈 단핵 세포를 제 표현형 분석에 필요한 표면 항원 셀하는 항체와 함께 비오틴 항원과 함께 배양된다. 이 라벨링 단계는 세척 및 고정을 한 세포를 결합 오티 닐화 항원 (도 1)의 검출 원적외선 형광 색소에 결합 된 스트렙 타비 딘을 첨가하여된다. 이전 연구와 유사한 방식으로 항원 특이 적 B 세포를 확인했지만하여 항원 직접 형광 색소 8, 9, 10, 11에 접합. 이 가치이지만방법은 스트렙 타비 딘과 함께 오티 닐화 항원의 사용은 항원 12, 13, 14 작을 때 특히 큰 신호 증폭 (결합 및 비 결합 따라서 세포보다 분화)을 가능하게한다. 추가적인 고려는 스트렙 타비 딘 대신 스트렙 아비딘이 탈글 라이코 실화 때문에, 비특이적 결합을 감소의 사용이다. 또한, 우리는 때문에, 양자 수율 (밝기)의 광 안정성, 그리고 작은 크기 (~ 1.3 kD의)에 형광 색소까지 붉은 형광 염료를 사용합니다. 그들은 잠재적으로 많은 항원 에피토프를 포함하기 때문에 단백질 등의 피코 에리 트린과 같은 형광 색소 (~ 250 kD의)와 알로 (~ 105 kD의) (15)는 최적되지 않습니다. 이러한 원적외선 형광 염료 단일 에피토프로 구성된 작은 유기 형광 염료의 사용은 분리 된 세포 집단의 복잡성을 감소시킨다.

세포가되면 바이오틴-Antigen과 멀리 붉은 형광 염료 스트렙 타비 딘 흡착는, 그들은 안티 - 원적외선 형광 염료 복합 자성 나노 입자를 사용하여 농축된다. 단일 나노 입자는 대부분의 유동 세포 계측기에 의해 검출되지 않고, 따라서 정렬 하류 FACS 분석 (16)에 의해 정제하기 전에 제거 할 필요가 없다. 항원 특이 적 B 세포의 자기 선택은 시간 및 플로우 사이토 미터를 사용하여 희귀 이벤트를 분류 비용을 제거 관심 집단을 풍부.

우리는 이전과 칠일 파상풍 톡소이드 부스터 예방 접종 후 대상에서 파상풍 톡소이드 - 특정 B 세포의 농축 대표 결과를 보여 아래. 우리 생체 자극 급성 다음 항원 특이 적 B 세포 농축이 방법의 기능을 설명하기 위해 예로서, 특정 프로그램을 선택했다. 유동 세포 계측법에 결합하면,이 방법은 농후하고 분화 항원 특이 나이브 메모리 할 수 ​​있고,plasmablast B 세포와는 연구자가 시간이 지남에 따라 빈도의 변화를 수행 할 수 있습니다. 또, 예를 들면 세포가 농축 다음 항체를 분비하는 능력을 유지하는 것을 보여주는 ELISPOT 분석, 다른 가능한 하류 분석을 포함한다. 이 방법의 또 다른 응용 프로그램은 호스트에 풍부한 세포의 입양 전송을 포함 할 수있다. 우리는 이전에 세포를 분리 및 전송 다음 항원 특이 적 T 세포에 항원 제시 세포로 역할을 할 수있는 능력을 유지 보였다 (데이터는 보이지 않음). 따라서, 함께 항원 특이 적 면역 반응의 이해를 알리는 방법으로 결합 될 수있는 가능한 하류 분석법 수있다. 우리는 전체 수율, 순도, 세포의 특이성을 결정하고, 배 농축을하는 컨트롤을 포함하는 방법을 설명했다.

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프로토콜

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인간 PBMC를 1. 분리

  1. 헤파린 혈액 수집 튜브를 사용하여 혈액의 30 ~ 50 ml를 수집.
    주 : 사용 된 혈액의 양이 관심 항원 특이 적 B 세포의 혈액에서 특정 실험 질문 빈도에 의존한다. 헤파린 혈액은 즉시 처리 또는 처리 다음날, 실온에서 밤새 부드럽게 흔들 수있다. 처리 지연 농축 효율에 거의 영향을 미치지과 생존을 최소의 손실과 관련된다.
  2. 전혈 1 믹스 : 1 무균 실온 마그네슘과 칼슘없는 인산 완충 식염수 (PBS)로.
  3. 50 mL의 멸균 원추형 튜브에 실온 밀도 구배 용액 10 ㎖를 추가한다. 4 ℃에서 어둠 속에서 개방 밀도 구배 병을 저장하지만, 사용 전 실온이.
  4. 가능하면 느린 설정으로 피펫 총을 설정 및 / 또는 천천히에 아주 작은, 그러나 일관성, 트리거 압력을가두 가지를 혼합하지 않도록주의, 밀도 구배의 상단에 희석 된 혈액의 30 ~ 35 ml의 레이어.
    참고 : 희석 된 혈액을 추가하는 것은 일관성있는 꾸준한 흐름을 보장 도움이 될 것입니다 동안 50 ㎖의 가장자리에 피펫의 팁을 배치는 원뿔.
  5. 브레이크와 20 ° C에서 30 분 동안 400 XG에 원심 분리기이 꺼져.
  6. 아래의 단핵 세포층을 방해하지 않도록주의, 혈장과 혈소판을 포함하는 상위 계층을 제거합니다.
  7. 멸균 피펫을 사용하여 단핵 세포 층 (버피 코트)를 수집하고 별도 멸균 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 배치했다.
  8. 50 ㎖의 부피로 세포 현탁액을 PBS를 추가한다. 브레이크와 20 ° C에서 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
  9. 상층 액을 제거하고 PBS 10ml에 펠렛 세포를 재현 탁. 세포를 카운트하고, 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 생존을 결정합니다.
  10. 추가 처리를 위해 준비 될 때까지 10 7 세포 / ㎖와 얼음에 장소를 Resuspend 세포.

세포의 2. 염색

  1. 각 형광 보상 / 해당하는 경우, 필요 FMO 제어 1-2 × 10 6 세포를 제거합니다. 브레이크와 4 ° C에서 10 분 동안 400 XG에 세포를 원심 분리기 나머지.
  2. 3-6 X 107 세포 / ml의 무균 여과 차가운 FACS 완충액 (PBS + 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) + 0.01 %의 아 지드 화 나트륨)에 재현 탁 된 세포 (1.5 mL의 원심 분리 튜브에서 제거). FACS 버퍼가 찬 것을 확인하고 염색 과정을 통해 얼음에 보관하십시오.
    1. 분석을 최적화 할 때 사분로 세포 인구 (AD)를 나눕니다. 농축 / 염색의 특이성을 결정하는데 관심을 이용 분획 B 및 C의 항원 특이 적 B 세포를 풍부 분획 A를 사용하여 항원 특이 적 세포의 빈도 수를 결정하고, 사용 분획 D (2.5 이하 2.6 참조) 농축되지 않은 인구는 수익률의 계산을 가능하게하고 배 농축을합니다.
  3. 인간 FcγR 차단 다시 추가얼음 분수 AD에 에이전트는 Fc 수용체에 대한 항체의 결합을 방지합니다.
    주 : 적절한 조건에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.
  4. 교차 자성 나노 입자에 결합 된 항 멀리 붉은 형광 염료 항체와 반응 형광 색소를 포함하지 않도록주의, 어둠 속에서 얼음에 30 분 동안 분수의 AD 관심의 표면 항원을 세포에 형광 색소 - 복합 항체를 추가합니다.
    참고 :이 근적외선 형광 염료, Cy5에, Cy5.5 및 Cy7 항체 복합체를 포함한다. 추가 된 생존의 얼룩은 고정액의 사용과 호환되어야합니다. 하나 ELISPOT에 의해, 예를 들어, FACS를 이용하여 세포를 분석하고 있지만, 항체 분비 주파수를 결정하고자하지 않는 경우, 항체 표면 염색은 불필요하다.
  5. 상기 분석의 특이성을 시험 얼음에 30 분 동안 표지 된 항원의 충분한 양 분획 B를 배양 등 그 친 화성을 가진 수용체의 대부분은 적어도10 -6 M이 차단됩니다.
    주 : 일반적으로 좋은 출발 농도는 항원의 양의 50 내지 100 배 과량 (예 50-100 μM) 2.6 이하로 충분하다고 판단된다. 비 표지 항원 따라서 풍부한 세포 특이성의 확인을 가능하게하기 단계 2.6에 첨가되는 비오틴 항원에 결합하는이 높은 친화력 모든 B 세포를 차단한다. 이 단계는 상기 단계 2.4과 함께 완료 될 수있다.
  6. 30 분 동안 얼음 분수 A, B, 및 D 품어에 바이오틴 항원을 추가합니다.
    주 : 비 오티 닐화 항원의 농도는 충분한 검출 및 비특이적 와키 세포로부터 세포를 결합 분리를 보장하기 위해 필요한 최적 량을 결정하기 위해 적정한다. 일반적으로 시험에 좋은 시작 농도는 1-5 μM이다.
    참고 : 분획 A와 D의 경우,이 단계는 상기 단계 2.4와 동시에 수행 될 수있다. 분수 B의 경우,이 단계는 betw 단계 2.5 (세탁 후 수행해야EEN 단계)는 불필요하다.
  7. 그러한 streptavidin- 원적외선 형광 염료 및 자성 비드 프로토콜 다른 시약으로 B 세포의 결합을 측정하기 위해 분획 C에서 비 오티 닐화 항원을 생략합니다.
  8. 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에 차가운 FACS의 5 × 10 7 세포 당 버퍼와 원심 분리의 1 ml의 세포 현탁액에 의해 두 번 세포를 씻으십시오.
  9. 최종 세척 후, 5 × 10 7 세포 당 1 ml의 2 % 포름 알데히드에 집중 세포 현탁액을 희석하고 5 분 동안 얼음에 어둠 속에서 앉아 보자.
    주 :이 시점에서 세포의 고정은 비 오티 닐화 항원이 절차의 나머지를 위해 BCR 바인딩 유지되도록. 생존 세포 - 예컨대 ELISPOTs 또는 대체 전송에서와 같이 하류 분석을 위해, 정착 단계를 생략.
  10. 4 ℃에서 5 분 동안 400 XG에 두 번 차가운 FACS의 5 × 10 7 세포 당 버퍼와 원심 분리기 1 ml의 세포를 씻으십시오. 1 용액에 재현 탁 차가운 FACS는 5 × 10 당 버퍼7 세포.
  11. 1-2 μg의 스트렙 타비 딘 - 멀리 붉은 형광 염료 / ㎖ 추가 어둠 속에서 20 분 동안 얼음에 품어. 각 애플리케이션에 대한 스트렙 타비 딘의 양을 적정한다.
  12. 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에 1 ml의 차가운 FACS의 5 × 10 7 세포 당 버퍼와 원심 분리기로 두 번 세포를 씻으십시오. 는 자성 비드를 이용하여 농축을 일으키지 않음으로 분획 D 제제는이 시점에서 종료된다.
    주 :이 표본은 샘플의 주파수 및 항원 특이 적 B 세포의 수를 결정하는 데 사용된다. 이는 농축에 의해 달성 농축 배 수율을 결정하는 데 사용됩니다.

3. 자기 나노 입자 기반 심화

  1. 40 μm의 필터를 통해 차가운 분리 버퍼 (PBS + 0.5 % BSA + 2mM의 EDTA) 5 × 10 7 세포 당 패스 1 ㎖의 샘플 AC에서 재현 탁 세포는 열을 방해 할 수있는 덩어리를 제거합니다.
  2. 안티 Cy5에 / 안티 멀리 붉은 형광 염료 나노 입자를 추가합니다. FO최적의 결과를 R, 나노 입자의 농도를 각각 사용 적정되어야하지만 좋은 출발점이 5 × 107 세포 / ㎖ 당 50 μl의 현탁액이다. 10 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 회전합니다.
  3. 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에 1 ml의 차가운 분리 버퍼로 두 번 씻으십시오. 5 × 107 세포 당 냉 분리 완충액 1 ㎖에 재현 탁 된 세포.

LS 또는 LD 열을 사용하여 4. 자기 심화

  1. 자기 분리기의 자기장에 세 LS 또는 LD 열을 놓고 열을 적시하는 분리 버퍼의 3 ㎖를 추가 (열 유형이 가장 적합한 결정하기 위해 제품 설명을 참조). 3 ml의 컬럼을 통과하여 수집 한 후 폐기 할 수 있습니다.
    주의 : 자성 나노 입자 표지 된 세포의 분리는 시판되는 자기 분리 장치의 어느 하나에 이용하여 달성 될 수 있지만, 기관은 TE에서 LS 컬럼의 사용에 가장 성공했다수율, 순도 및 농축 효율의 실효.
  2. 열 아래에 부정적인 선택 세포 표지 세 15 ML 원뿔 튜브 "분수 A / (B) / (C) 음"을 놓습니다. 각각의 컬럼에 자성 입자를 표지 세포를 추가하고 전체 볼륨이 통과 할 수 있습니다.
  3. 위에 차가운 분리 버퍼의 3 ㎖를 추가하고이 컬럼을 통과하여 2 ㎖로 반복 할 수 있습니다. 음으로 선택된 세포를 수집하고 얼음에 따로 설정합니다.
  4. 자기장에서 열을 제거하고 긍정적으로 선택한 셀에 대해 "분수 A / (B) / (C) 긍정적"표시 15 ML 원뿔 튜브의 상단에 배치합니다.
  5. 제공된 플런저를 사용하여 자기장에 결합 된 세포를 수집하는 컬럼을 통해이 체적을 뛰어 즉시 분리 완충액 약 6 ㎖의 상단에 열을 채우고.
  6. 순도를 높이기 위해 적극적으로 선택된 셀은 상기 proce을 반복하는 초 청정 컬럼을 사용하여 농축 될 수있다틀리면.
  7. 4 ° C에서 10 분 동안 400 XG에 음과 양으로 선택 분수를 모두 스핀 원하는 최종 부피에서 일시 중지합니다. 이러한 FACS, ELISPOT 또는 입양 전송 등 다운 스트림 분석을 진행합니다.

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결과

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순도, 수율 분석 및 배 농축 유동 세포 계측법을 사용하여

필연적으로 streptavidin- 멀리 붉은 형광 염료를 결합하지 않은하지만 매트릭스에 갇혀있다 오염 세포를 포함하는 전술 한 바와 같이 풍부한 인구. 이러한 불순물은 FACS 정렬하여 풍부한 인구에서 제거 할 수 있습니다. 풍부한 인구의 순도를 평가하기 위해, 살아있는 세포에 게이트 앞으로 기반 및 측면 분산 및 / 또는 라이브 / 죽은 얼룩과 멀리 붉은 형광 염료 + 세포 주파수를 분석 할 수 있습니다. 후자의 게이트 내의 비율이 순도를 나타낸다. 이러한 세포의 특이성 항원 친화 추가 분석 클로닝 및 발현 된 면역 글로불린 유전자 서열의 재조합 항체 생산을 분석 하였다 단셀 FACS 정렬을 필요로한다.

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토론

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여기에서 우리는 고립과 인간의 말초 혈액에서 항원 결합 B 세포의 농축을 달성하기 위해 새로운 방법을 설명합니다. 상기 방법은 생쥐 비장 및 림프절과 같은 다른 조직을 용이하게 적용 가능하며, 세포의 표현형 및 기능 (준비 원고)의 후 농축 분석과 호환된다.

사용자는이 절차의 성공에 영향을 미칠 수있는 변수의 수를 인식해야한다. 경험에서 죽은 세포가 아닌 특정 증가 배경을 선도, 자기 구슬에 충실하고 같은 스트렙 타비 딘 - 원적외선 형광 염료 형광 염료를, "차지"하는 경향이있다. 이 절차를 시작하기 전에 가능한 한 샘플에서 많은 죽은 세포를 제거하는 것이 중요합니다. 분석에서 게이트 밖으로 사균 라이브 / 죽은 차별 활성화 얼룩의 사용은 유용 할 수 있지만, 사균의 존재가 셀에 주파수를 분비하는 항체 분석법 해석을 손상 할 수 있고입양 전송 다음 함수.

또, 추가 된 비 오티 닐화 항원에주의 적정 항원 ...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 JDRF (1-2008-994, 27-2012-450)와 미국 국립보건원(R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, F30OD021477)의 보조금으로 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
관심 항원변수 변수최소 100 μ g를 쉽게 비오틴화하고; 단백질을 사용하는 경우 ELISA에서 검증한 단백질을 사용하십시오. 캐리어여야 합니다  단백질 무함유.
라벨링용 비오틴; 예: EZ 링크 Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific21335비오틴은 다양한 길이의 스페이서를 포함하는 것과 같은 다양한 제형으로 제공되므로 사용되는 유형은
Streptavidin-Alexa Fluor 647InvitrogenS21374다른 공급업체에서 얻을 수 있는
Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 MicrobeadsMiltenyi Biotech130-091-395
LS 컬럼Miltenyi Biotech130-042-401
MACS 수동 분리기Miltenyi Biotech가변
포름알데히드PBS로 2%로 희석; 다운스트림 분석에
칼슘과 마그네슘이 없는 살아있는 세포 PBS가 필요한 경우 선택 사항
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
헤파린 수집 튜브
FACS 완충액(PBS + 1% BSA + 0.01% 아지드화나트륨)
분리 완충액(PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA)
50ml 원뿔형 튜브
15ml 원뿔형 튜브
1.5 ml Eppendorf 튜브
표면 마커 반응성 항체, Fc 블록, 생/사 판별 염색, 필요한
ELISPOT 소모품
가 연구자에 의해 결정되어야 합니다.의 전혈경우

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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