여기에 서술 된 것은 환자 - 유도 된 이종 이식 (PDX) 마우스에서 사이토 카인 - 형질 감염된 간질 세포주의 매주 복강 내 주사를 통해 외인성 사이토킨을 생산하는 방법이다. 이 방법은 PDX의 유용성을 넓히고 다양한 PDX 모델에서 일시적 또는 지속적인 외인성 사이토 카인 전달 옵션을 제공합니다.
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방법 논문
Cytokine-induced stromal cell line 주입에 의한 환자 유래 이종 이식편에서의 외인성 사이토 카인의 발현
이 논문에서
요약
초록
환자 유래 이종 이식 (PDX) 마우스는 사람 세포를 면역 결핍 마우스에 이식하여 생산됩니다. 이 모델은 정상 및 악성 조혈의 기전을 연구하는 데 중요한 도구이며 많은 악성 종양에 대한 효과적인 화학 요법을 식별하는 데있어 가장 중요한 표준입니다. PDX 모델은 많은 마우스 사이토 카인이 사람의 세포에도 작용하기 때문에 가능합니다. 그러나 이것은 인간 세포에서 정상 및 악성 조혈을 연구하는 데 중요한 여러 가지를 포함하여 모든 사이토 카인의 경우에는 해당되지 않습니다. 인간 사이토 카인 (형질 전환 및 knock-in 모델)을 생산하기 위해 마우스를 조작하는 기술은 모델의 유용성이 입증되기 전에 상당한 비용을 필요로합니다. 다른 기술은 노동 집약적이며 (재조합 시토 킨이나 렌티 바이러스의 주사), 어떤 경우에는 고도의 전문 기술 (DNA의 유체 역학적 주사)이 필요합니다. 이 보고서는 외인성 cy를 갖는 PDX 마우스를 생성하는 간단한 방법을 설명합니다tokine (TSLP, thymic stromal lymphopoietin) 을 매주 복강 내 주사하여 사이토 카인을 과발현시켰다. 이 방법의 사용은 마우스에서 순환하는 인간 사이토 카인의 생리 학적 수준을 달성하는 연속적인 사이토 카인 생산의 생체 내 공급원을 제공한다. 인간 사이토 카인의 혈장 수준은 주입 된 간질 세포의 수에 따라 다양 할 수 있으며, 사이토 카인 생산은 실험의 어느 시점에서 시작될 수있다. 이 방법은 또한 유사하게 생성되지만 대조군 벡터로 형질 도입 된 간질의 복강 내 주사를 통한 사이토 카인 - 음성 대조군 마우스를 포함한다. 우리는 TSLP를 발현하는 PDX로부터 수확 된 백혈병 세포가 대조군 PDX와 비교하여 원래 환자 샘플과 유사한 유전자 발현 패턴을 나타냄을 이전에 입증했다. 이 방법으로 생성 된 cytokine 생성 및 cytokine 음성 PDX 마우스를 함께 사용하면 우리가 성공적으로 연구 한 모델 시스템이 제공됩니다.정상 및 악성 조혈에서 TSLP의 역할.
서론
환자 유래 이종 이식편 (PDX)은 '원주민'포유류 환경에서 정상 및 악성 조혈 세포의 생산을 연구하기위한 강력한 생체 내 모델입니다. 대부분 PDX는 사람의 세포를 면역 결핍 마우스에 주사하거나 이식하여 생산됩니다. 정상적인 인간 조혈 줄기 세포를 이용한 PDX의 생성은 정상적인 사람의 혈액과 면역 세포의 생체 내 연구를 가능하게합니다. 백혈병이나 다른 암세포에서 생산 된 PDX는 종양 발생 기전을 연구하고 인간 개체군에 존재하는 유전 적 경관과 돌연변이의 범위에서 효과적인 치료법을 확인하는 것을 가능하게합니다. 결과적으로 PDX는 효과적인 치료 방법을 밝히기위한 병리학 생물 의학 연구의 현재 표준이자 암 진행 메커니즘을 이해하는 데 중요한 도구입니다. PDX 모델은 특정 질병으로 인한 건강 불균형 질환에 대한 연구를 지원하는 필수 도구입니다. 유전 병변, 또는 환자의 유전 적 변이가 종양 발생 및 치료 결과에 실질적으로 기여할 수있는 임의의 질환을 포함한다.
마우스 - 인간 PDX 모델은 많은 마우스 사이토 카인이 인간 세포의 사이토 카인 수용체를 쥐 내부에있는 동안 활성화 시키는데있어서 인간 유사체를 적절히 모방하기 때문에 가능하다. 예를 들어, 인터루킨 -7 (IL-7)은 인....
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프로토콜
연구는 Loma Linda University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 및 기관 검토위원회 (IRB) 승인 프로토콜 및 모든 연방 지침에 따라 수행되었습니다.
주의 : PDX 및 인체 조직은 혈액 매개 병원균의 전염을 방지하기 위해 안전 절차에 따라 처리해야합니다.
1. Cytokine-Transduced Stromal Cells의 배양과 확장
참고 : 간질이 passaged 때마다, ELISA 분석 을 통해 사이토 카인 수준의 미래 부량을 위해 -80 ° C에서 문화 뜨는 (1 ML의 나누어지는) 및 저장을 수확.
- 재료 표에 설명 된대로 R10 배지 및 냉동 배지를 준비합니다.
- 10 , 11을 생성하거나 제어 간질 (빈 벡터로 형질 도입) 및 사이토 카인 생성 (TSLP +) 간질을 얻습니다.사용하기 전까지 액체 질소 (LN 2 )에 보관하십시오 12 에서 설명한 바와 같이 간질 세포를....
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결과
모델 개요가 그림 1 에 나와 있습니다. 일단 사이토 카인 - 생성 (TSLP + 간질) 및 대조 간질이 수득되면, 이들은 배양 물에서 확대된다. 생쥐에 stroma 주사하기 전에 간질 세포 상등액은 간질에 의해 생산되는 사이토 카인의 활성을 확인하는 데 사용되는 사이토킨 생산 ( 그림 2 )과 인산 흐름 cytometry (프로토콜 # 3)를 확인하기 위해 ELISA에 의해 평가됩니다. 상등액은 세포가 통과 될 때 합류 간질 세포 배양 (대조 간질 및 TSLP + 간질)에서 수집됩니다. ELISA는 초기, 중간 및 후기 단계에서 상등액에서 TSLP의 농도를 적어도 한 번은 모니터하는 데 사용됩니다. 대조 스트로마로부터의 대표적인 데이터가 도 2a 에 도시되어 있다 . TSLP 발현을 보여주는 간질 세포 배양 물 (및 .......
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토론
이 원고는 PDX를 조작하여 외인성 인간 사이토 카인을 발현하는 간단하고 신속하며 상대적으로 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 여기에 설명 된 전략은 인간 사이토 카인, TSLP를 표현하기 위해 형질 도입 된 간질 세포주의 주간 복강 주사에 기초합니다. 여기에 설명 된 방법을 수행하기 전에, 높은 수준의 관심있는 사이토킨 (TSLP)을 발현하도록 조작 된 간질 및 유사하게 조작 된 간질이 생성되었다. 여기에 제시된 프로토콜에서 간질은 배양에서 확장되고 시간이 지남에 따라 (또는 대조 간질의 경우에는 사이토 카인 생산이없는 경우) 안정하고 높은 수준의 사이토 카인 생산을 제공하는 능력에 대해 스크리닝된다. 스트로마 생성 사이토 카인의 활성을 확인하기위한 분석을 수행하고 생체 인체 TSLP (및 인간 TSLP가없는 대조 마우스)를 사용하여 PDX를 생산하기 위해 간질 세포 주입을위한 실험적 타임 라인을 개발했다. 인간 TSLP의 혈장 수준을 모니터링하는 절차 및사이토 카인 반응성 세포 집단에 대한 그의 생체 내 기.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, 현대 Hope on Wheels 장학생 Hope Grant, Loma Linda University School of Medicine의 병리학 및 인체 해부학과, 기초 과학과, 건강 격차 및 분자 의학 센터의 지원을 받았으며 Loma Linda University(KJP)의 공동 및 중개 연구를 촉진하기 위한 보조금의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
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재료
"에서 Corning 25-900-Cl, ,
ThermoFisher 25-053 TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P-7949
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 습식 실험실 시약 | |||
| T-25 Nunc 세포 배양 처리 EasYFlasks, 7 mL 용량, 25cm² 배양 영역 | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL 용량, 75 cm² 배양 영역 & 통풍 캡 | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 Falcon 조직 배양 처리 플라스크, 600 mL 용량, 150 cm² 문화 지역 & 통풍 캡 | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 mL 혈청학 피펫 | Falcon | 357551 | |
| 15 mL 폴리프로필렌 원뿔형 튜브 | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브 | Falcon | 352054 | |
| 50 mL 폴리프로필렌 원뿔형 튜브 | Falcon | 352098 | |
| 2.0 mL 극저온 바이알, 외부 스레드 | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| 1 mL 피펫 팁 | Fisher | 2707509 | |
| 200 μ L 피펫 팁 | 덴빌 사이언티픽 | P3020-CPS | |
| 10 μ L 피펫 팁 | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| 멸균 일회용 필터 유닛, SFCA 멤브레인, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| 둘베코' 칼리슘과 마그네슘이 없는 S 인산염 완충 식염수(PBS), 1× | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| Human TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3% 아세트산과 메틸렌 블루 | 스템셀 기술 | 7060 | |
| Trypan Blue | HBSS | ||
| "Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA | |||
| R10" 세포 배양 배지, 총 부피의 % (565 mL 제작) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 88.5% (500 mL) | 미디어테크 | 10-040-CV | |
| FBS, 9.9%(56mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-글루타민, 0.99% (5.6 mL) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| 페니실린-스트렙토마이신, 0.50% (2.8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-메르캅토에탄올, 0.10%(560 &마이크로; 엘) | MP | 190242 | |
| <강>" R20" 세포 배양 배지, 총 부피의 % (195 mL 제작) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 76.84% (150 mL) | 위 | 참조 | |
| FBS, 20.49%(40mL) | 위 참조 | ||
| 2mM L-글루타민, 1.02%(2mL) | 위 | 참조 | |
| 1 mM Na 피루브산염, 1.02% (2 mL) | 위 | 참조 | |
| 페니실린-스트렙토마이신, 0.51 % (1 mL) | 위 | 참조 | |
| 2-메르캅토에탄올, 0.10%(0.1m), 0.10% (200 &마이크로; L) | 위 | 참조 | |
| <강한>" 냉동 매체", 총 부피의 % | - | - | Lab Recipe |
| " R10" 중간, 45% | "R10" 레시피 | - | |
| FBS 참조, 20% | 위 | 35-011-CV | |
| DMSO 참조, 10% | Corning | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-트레할로스 이수화물, 5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| Name | Company | Catolog Number | 코멘트 |
| Biologics | |||
| "HS-27", HS-27A, 인간 기질주 | ATCC | CRL-2496 | |
| ", "CALL-4", MHH-CALL-4, 세포주, 인간 B 세포 전구체 백혈병, | DSMZ, | ACC 337 | |
| " NSG 마우스" 끄덕이다. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, 남성 또는 여성, 6세 – 8주 | JAX 마우스 | # 005557 | |
| MUTZ-5 세포주, 인간 B 세포 전구체 백혈병 | DSMZ | ACC 490 | |
| 재조합 인간 TSLP 단백질 | R& D 시스템 | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Flow cytomery antibodies (clone)* | |||
| Anti-mouse CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (다른 이름은 IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (하이30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" 고정 생존력 염료 eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
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| Ig λ 경쇄 FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, 마우스 anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Name | Company | Catolog 번호 | 코멘트 |
| >기타 재료 및 장비& | |||
| 동물 이식 가능한 나노 트랜스폰더와 캐뉼라 | 트로반; | ID-100B(1.25) | |
| EMLA 리도카인 마취 크림 (동물 관리 시설을 통해 처방하여 얻음) | 처방 | ||
| 처방 BD ½ cc LO-DOSE U-100 인슐린 주사기 28G½ | BD# | 329461 | |
| BD 마이크로테이너 튜브와 K2EDTA | BD | #365974 | |
| 원심분리기 | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| FisherBrand 모세관 (Heparinized) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| 혈구계 | Fisher | 02-671-6 | |
| MACS퀀트 분석기 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| 마우스 파이 케이지 | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| 마우스 꼬리 조명기 Restrainer | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| 피스톨 그립 임플란터 | 트로반 | IM-300(1.25) | |
| &마이크로; 퀀트 | Bio-Tek Instruments Inc. (바이오 텍 인스트루먼트) | MQX200 | |
| FlowJo 유세포 분석 소프트웨어 | FlowJo, LLC | 버전 10 | |
| *달리 명시되지 않는 한 모든 항체는 항인간적입니다. |
참고문헌
- Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
- Parrish, Y. K., et al.
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재인쇄 및 허가
