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방법 논문

Cytokine-induced stromal cell line 주입에 의한 환자 유래 이종 이식편에서의 외인성 사이토 카인의 발현

8.9K 조회수

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DOI:

10.3791/55384

⸱

2017년 5월 10일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Human Anatomy, Loma Linda University, 2Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 3Department of Medicine, Loma Linda University

이 논문에서

요약

여기에 서술 된 것은 환자 - 유도 된 이종 이식 (PDX) 마우스에서 사이토 카인 - 형질 감염된 간질 세포주의 매주 복강 내 주사를 통해 외인성 사이토킨을 생산하는 방법이다. 이 방법은 PDX의 유용성을 넓히고 다양한 PDX 모델에서 일시적 또는 지속적인 외인성 사이토 카인 전달 옵션을 제공합니다.

초록

환자 유래 이종 이식 (PDX) 마우스는 사람 세포를 면역 결핍 마우스에 이식하여 생산됩니다. 이 모델은 정상 및 악성 조혈의 기전을 연구하는 데 중요한 도구이며 많은 악성 종양에 대한 효과적인 화학 요법을 식별하는 데있어 가장 중요한 표준입니다. PDX 모델은 많은 마우스 사이토 카인이 사람의 세포에도 작용하기 때문에 가능합니다. 그러나 이것은 인간 세포에서 정상 및 악성 조혈을 연구하는 데 중요한 여러 가지를 포함하여 모든 사이토 카인의 경우에는 해당되지 않습니다. 인간 사이토 카인 (형질 전환 및 knock-in 모델)을 생산하기 위해 마우스를 조작하는 기술은 모델의 유용성이 입증되기 전에 상당한 비용을 필요로합니다. 다른 기술은 노동 집약적이며 (재조합 시토 킨이나 렌티 바이러스의 주사), 어떤 경우에는 고도의 전문 기술 (DNA의 유체 역학적 주사)이 필요합니다. 이 보고서는 외인성 cy를 갖는 PDX 마우스를 생성하는 간단한 방법을 설명합니다tokine (TSLP, thymic stromal lymphopoietin) 을 매주 복강 내 주사하여 사이토 카인을 과발현시켰다. 이 방법의 사용은 마우스에서 순환하는 인간 사이토 카인의 생리 학적 수준을 달성하는 연속적인 사이토 카인 생산의 생체 내 공급원을 제공한다. 인간 사이토 카인의 혈장 수준은 주입 된 간질 세포의 수에 따라 다양 할 수 있으며, 사이토 카인 생산은 실험의 어느 시점에서 시작될 수있다. 이 방법은 또한 유사하게 생성되지만 대조군 벡터로 형질 도입 된 간질의 복강 내 주사를 통한 사이토 카인 - 음성 대조군 마우스를 포함한다. 우리는 TSLP를 발현하는 PDX로부터 수확 된 백혈병 세포가 대조군 PDX와 비교하여 원래 환자 샘플과 유사한 유전자 발현 패턴을 나타냄을 이전에 입증했다. 이 방법으로 생성 된 cytokine 생성 및 cytokine 음성 PDX 마우스를 함께 사용하면 우리가 성공적으로 연구 한 모델 시스템이 제공됩니다.정상 및 악성 조혈에서 TSLP의 역할.

서론

환자 유래 이종 이식편 (PDX)은 '원주민'포유류 환경에서 정상 및 악성 조혈 세포의 생산을 연구하기위한 강력한 생체 내 모델입니다. 대부분 PDX는 사람의 세포를 면역 결핍 마우스에 주사하거나 이식하여 생산됩니다. 정상적인 인간 조혈 줄기 세포를 이용한 PDX의 생성은 정상적인 사람의 혈액과 면역 세포의 생체 내 연구를 가능하게합니다. 백혈병이나 다른 암세포에서 생산 된 PDX는 종양 발생 기전을 연구하고 인간 개체군에 존재하는 유전 적 경관과 돌연변이의 범위에서 효과적인 치료법을 확인하는 것을 가능하게합니다. 결과적으로 PDX는 효과적인 치료 방법을 밝히기위한 병리학 생물 의학 연구의 현재 표준이자 암 진행 메커니즘을 이해하는 데 중요한 도구입니다. PDX 모델은 특정 질병으로 인한 건강 불균형 질환에 대한 연구를 지원하는 필수 도구입니다. 유전 병변, 또는 환자의 유전 적 변이가 종양 발생 및 치료 결과에 실질적으로 기여할 수있는 임의의 질환을 포함한다.

마우스 - 인간 PDX 모델은 많은 마우스 사이토 카인이 인간 세포의 사이토 카인 수용체를 쥐 내부에있는 동안 활성화 시키는데있어서 인간 유사체를 적절히 모방하기 때문에 가능하다. 예를 들어, 인터루킨 -7 (IL-7)은 인간 B 세포 발달에 중대한 신호를 제공합니다. 2 마우스 IL-7은 마우스 사이토 카인이 인간 B 세포 전구체에서 신호 전달 경로를 자극한다는 점에서 인간 IL-7과 충분한 상 동성을 갖는다. 그러나 다른 cytokine (IL-3, 과립구 - macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), 줄기 세포 인자 (SCF)) 중에서 thymic stromal lymphopoietin (TSLP) ,정상 및 악성 인간 조혈 모세포의 생산에있어서 중요하다. 마우스 및 인간 사이토 카인이 낮은 상 동성을 나타내는 경우, 마우스 사이토 카인은 인간 세포상의 각각의 수용체를 활성화시키지 않는다. 이러한 장애를 극복하기 위해, 많은 전략이 사용되어왔다 PDX 생쥐에서 인간 사이토 카인의 발현을 조작하는 방법으로 재조합 인간 사이토 카인의 주입, DNA의 유체 역학적 주사, 렌티 바이러스 발현, 형질 전환 발현 및 knockin 유전자 교체가 포함된다 .7 이 보고서는 간질 매개 를 통해 인간 사이토 카인을 생산하는 PDX 사이토 카인 전달 ( 그림 1 ).

여기에 설명 된 방법에서 PDX 마우스는 인간 사이토 카인, TSLP를 발현 시키거나 사이토 카인 음성 대조군으로 기능하도록 조작됩니다. TSLP를 발현하는 PDX는 인간 TSLP의 높은 수준을 발현하도록 형질 도입 된 간질 세포를 매주 복강 내 주사함으로써 달성된다.사이토 카인 - 음성 PDX "대조군"마우스도 유사하게 조작된다; 대조 기질은 대조군 벡터로 형질 도입된다. 이 방법은 TSLP + 간질을 주사 한 PDX 마우스에서 인간 TSLP의 정상적인 생리 학적 수준을 달성합니다. 사이토 카인 - 음성 간질을받는 PDX 마우스에서 검출 가능한 TSLP는 관찰되지 않았다. 우리는 연구에서 인간 간질 세포주 HS-27A를 선택했다. 왜냐하면 배양에서 견고하게 성장하고, 공 배양에서 분리 된 전구 세포의 증식을 지원하지 않는 매우 낮은 수준의 사이토 카인 생산을 보여주기 때문이다. 인간 TSLP 발현을 위해 기질은 이전에 기술 된 백본에서 유래 된 선진적인자가 - 비활성화 벡터 lentiviral vector로 형질 도입되었으며 cPPT / cts 요소와 woodguck hepatitis post-transcriptional regulatory element (WPRE)를 포함하여 도입 유전자 발현을 증가시켰다. 인간 TSLP 유전자는 신장 인자 -1의 조절하에이 벡터에 구축되었다(EF-1) 알파 프로모터를 이용하여 견고하고 구성 적이며 장기적인 발현을 달성 할 수 있습니다.

이 human-cytokine enhanced PDX 모델의 공학은 4 가지 주요 단계로 구성됩니다. 첫째, 형질 전환 된 기질은 체외에서 증식되고 안정되고 높은 수준의 사이토 카인 생산을 위해 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)에 의해 평가된다. 둘째, 형질 감염된 간질 세포에 의해 생성 된 인간 사이토 카인의 활성 (및 대조 간질로부터의 사이토킨 활성의 결핍)이 인 - 흐름 세포 계측법을 사용하여 검증된다. 관심있는 사이토 카인 (이 경우, TSLP)에 반응하는 것으로 알려진 세포주를 간질 세포 상등액과 함께 배양하고 사이토 카인 - 유도 된 인산화를 분석 하였다. 셋째, 마우스에게 형질 도입 된 인간 간질을 주사 한 다음 마우스 혈장을 주 1 회 기준으로 인간 사이토 카인의 수준을 ELISA로 평가한다. 넷째, 인간의 조혈 세포를 이식하고, 인간 사이토 카인의 생체 내 기능적 효과를 알려진 표적에서 평가한다 ( 예. 세포 집단).

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그림 1 : 마우스에서 외인성 인간 사이토 카인을 생산하도록 설계된 PDX 모델. ( 1A ) 디자인 실험 및 형질 도입 된 인간 간질 세포 획득 ( 1B ) 인간 세포 (조혈 줄기 세포, 백혈병 세포 등 )를 얻어 PDX (환자 유래 이종 이식) 마우스를 만듭니다. ( 2A ) 조작 된 간질을 주입하고 ( 2B ) 인간의 세포를 실험 계획에 따라 면역 결핍 마우스에 이식합니다. ( 3A - B ) 간질 상층 액 및 마우스 혈장의 사이토 카인 농도를 ELISA로 모니터링하십시오. ( 4 ) 인간 세포를 수확하고 PDX에 존재하는 인간 사이토 카인의 생체 내 기능적 효과를 평가한다. 여기를 클릭하십시오.이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

간질 세포 를 통한 인간 사이토 카인의 전달은 PDX 마우스에서 인간 사이토 카인 을 전달 / 생산하는 다른 방법과 비교할 때 장점 및 단점을 제공한다. 재조합 인간 사이토 카인의 주입과 비교하여, 간질 매개 전달은 일반적으로 덜 비싸다 (간질 세포 배양 비용은 재조합 시토 킨 비용보다 적음). 노동 집약도 적다 (1 주일에 1 회 주사 대 주당 복수 주사). 간질이 지속적으로 외인성 사이토 카인을 생성하기 때문에 짧은 사이토 카인 반감기의 문제 또한 완화된다. DNA의 유체 역학적 주사를 통한 사이토 카인의 전달 은 간질 을 통한 전달보다 비용이 적게 든다. 그러나, 그것은 일시적이며 간질 매개 전달에 필요한 간단한 주간 복강 주사보다 기술적 인 기술이 필요할 수 있습니다. 마우스에서의 렌티 바이러스 유전자 발현은 더 적은 트랩을 제공 할 수있다사이토 카인 전달의 새로운 방법; 그러나 우리 손에 생리적 인 TSLP 수치는 달성되지 않았습니다. 또한이 방법은 노동 집약적이며 렌티 바이러스 벡터를 지속적으로 생산해야합니다. 트랜스 제닉 또는 노크 - 인 (knock-in) 마우스는 사이토 카인의 장기간 안정한 발현을 제공하며, 조직 특이 적 발현을 위해 조작 될 수있어 이점이 될 수있다. 반면에, PDX 마우스에 필요한 면역 결핍 마우스 배경에서의 인간 사이토 카인 유전자의 형질 전환 발현은 모델의 가치가 확립되기 전에 막대한 자원의 투자를 필요로한다. 또한, 형질 전환 모델은 일반적으로 사이토 카인 개시의시기 또는 생체 내 사이토 카인 생산의 수준을 변화시키는 옵션을 허용하지 않는다. 이들은 간질 세포 주입의 시작 시점 또는 주입 된 간질 세포의 투여 량을 단순히 변경함으로써 간질 매개 전달에 의해 달성 될 수있다.

간질 세포 매개 cytokine delivery meth여기에 자세하게 설명 된 것은 정상 인간 B 세포 발달 4 및 6 및 고위험 B 세포 급성 림프 구성 백혈병에서 TSLP의 역할을 평가하기위한 PDX를 개발하는 데 사용되었습니다. 이 방법은 TSLP 이외의 인간 사이토 카인으로 유사한 모델을 생성하는데 사용하기위한 대안적인 사이토 카인 전달 방법을 제공한다. 이 모델은 또한 시토 킨 트랜스 제닉 또는 사이토 카인 노크 - 인 PDX 모델의 가치가 상당한 시간과 돈 투자에 합당한지를 결정하는 데 도움이되는 예비 데이터를 생성하는데 유용 할 수있다.

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프로토콜

연구는 Loma Linda University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 및 기관 검토위원회 (IRB) 승인 프로토콜 및 모든 연방 지침에 따라 수행되었습니다.

주의 : PDX 및 인체 조직은 혈액 매개 병원균의 전염을 방지하기 위해 안전 절차에 따라 처리해야합니다.

1. Cytokine-Transduced Stromal Cells의 배양과 확장

참고 : 간질이 passaged 때마다, ELISA 분석 을 통해 사이토 카인 수준의 미래 부량을 위해 -80 ° C에서 문화 뜨는 (1 ML의 나누어지는) 및 저장을 수확.

  1. 재료 표에 설명 된대로 R10 배지 및 냉동 배지를 준비합니다.
  2. 10 , 11을 생성하거나 제어 간질 (빈 벡터로 형질 도입) 및 사이토 카인 생성 (TSLP +) 간질을 얻습니다.사용하기 전까지 액체 질소 (LN 2 )에 보관하십시오 12 에서 설명한 바와 같이 간질 세포를 해동하고 별도의 T-25 세포 배양 플라스크에 5 mL의 R10 배지에 넣고 37 ℃의 배양기에서 5 % CO 2. 이것은 해빙 후 "통로 # 1"입니다.
  3. 간질이 합류 (24-48 H)되면, 1 × 트립신 EDTA (0.25 %)를 사용하여 트립신 처리하고 T-150 배양 플라스크에서 재 도금하여 세포를 통과시킨다. 이것은 포스트 해빙 "통로 # 2"입니다.
  4. 간질이 T - 150 flasks (3 ~ 4 일 후)에서 confluency를 얻을 때, trypsinizing하여 세포를 통과. 실험적인 필요를 위해이 세포 현탁액을 사용하십시오.
    1. 여러 개의 플라스크로 세포 확장
      1. 3 개의 T - 150 flasks 사이에 수확 세포를 합류하고 합류까지 문화. 간질 확장이 필요한 경우이 단계를 반복하십시오. T-150 플라스크에서의 합류시의 전형적인 인간 간질 (HS-27A) 세포 수는 ~ 5 x 106이다.
    2. 셀대저택
      1. 수확 한 세포 현탁액을 원추형 튜브에 옮기고 500xg에서 5 분간 원심 분리하고 상청액을 따라 내고 얼기 매체에 세포를 resuspend. LN에 동결 보관하고 바이알 당 1.5 x 10 6 세포.
    3. 생쥐에 periotoneal stroma 주사를 위해, 단계 4.1로 진행합니다.

2. 형질 감염된 간질에서 in vitro cytokine 생산을 모니터하는 ELISA 분석

  1. 해당 시토 킨을 검출하기 위해 상업적으로 이용 가능한 ELISA 분석 키트를 구입하십시오.
  2. 조기, 중기 및 후기에 수확 된 대조군 및 사이토 카인 - 생성 (TSLP +) 기질의 간질 세포 상등액 해동 ( 그림 2 ).
  3. 제조자의 지시에 따라 ELISA 키트를 사용하여 상등액 샘플의 TSLP 농도를 결정합니다. 13 세포 배양 중 사이토 카인 생산의 안정성을 모니터하기 위해이 직렬 데이터를 컴파일하십시오 e ( 도 2A-B ).
    1. 감소 된 또는 차선의 사이토 카인 발현뿐만 아니라 보관중인 모든 해당 바이알과 함께 사이토 카인 생성 간질을 확인하고 폐기하십시오 ( 그림 2A-B ).
    2. 안정되고 높은 수준의 사이토 카인 농도를 나타내는 사이토 카인 생성 스트로마를 확인하고 유지하십시오. 이러한 해동을 실험에 사용하십시오.
  4. ELISA 키트를 사용하여 안정한 사이토킨 생산을 보장하거나 대조 기질의 경우 사이토 카인 생산의 부재를 보장하기 위해 세포 배양 기간 내내 (초기, 중기 및 후기 해동 구절 중 적어도 1 회) 간질을 일상적으로 모니터링합니다 .

3. Stroma가 생산하는 Cytokine의 활성을 평가하기위한 Phospho-flow Cytometry Assays

참고 : 개별 실험을위한 간질 생성 cytokine의 관련 생체 활성을 확인하기 위해 첫 번째 실험 전에 조작 된 간질에서 뜨는을 평가합니다.ef "> 6 일단 조작 된 간질이 검증되면, 새로운 벡터로 생산 된 간질이 도입되지 않으면 추가 검사가 필요하지 않습니다.

  1. MUTZ5 및 / 또는 MHH-CALL4 백혈병 세포주 (TSLP 반응성), 14 재조합 인간 사이토 카인 및 적절한 하류 인산화 표적을 검출하기위한 인산염 세포 계측법 검사에 사용하도록 승인 된 항체를 구입하십시오.
  2. Thaw는 대조군과 cytokine-expressing stroma로부터 수확 된 상층 액을 녹입니다.
  3. 96 잘 조직 배양 접시에 잘 0.2 X 10 6 세포 의 농도 에서 R20 매체 (재료의 표 참조)에서 백혈병 세포 라인 을 판다 . triplicate assays를 허용하기 위해 조건 당 3 개의 웰. 37 ° C에서 2 시간 동안 품어 낸다. 이 시간은 이전의 배양 조건에서 일어난 인산화의 손실을 허용한다.
    참고 : 셀 라인 당 12 우물은 단계 3.4에 표시된 각 실험 조건에 대해 triplicate assays를 제공합니다.
    4. <배양 2 시간 후, 각 웰의 세포를 4 mL 튜브를 분리하고 500 xg에서 5 분간 4 ℃에서 원심 분리한다. 상층 액을 버린다.
    1. 1) 음성 대조 배지 만, 2) 포화 농도에서 재조합 시토 킨을 갖는 양성 대조 배지 (15 ng에서 TSLP) (3 회 시험에서 분석을 수행함) 각각의 200 μL에서 세포를 재현 탁하십시오. / mL 등 ), 3) 대조 기질의 간질 상등액 제어, 4) 사이토 카인 생산 간질의 간질 상층 액.
  4. 특정 상업 phospho - 분석 ( 예 : TSLP에 대한 응답으로 MUTZ5 또는 MHH - CALL4에서 phospho - STAT5에 대한 30 분)에 의해 지정된 기간 동안 세포를 품어.
  5. 4 X에서 5 분 500 XG에서 원심 분리기와 뜨는을 가만히 따르다.
  6. 제조 업체의 프로토콜 당 포스 플로우 - 흐름 cytometry 얼룩을 수행하고 흐름 cytometry 데이터를 수집합니다. 15 명
  7. 유동 세포 계측법 데이터를 분석하십시오. 15 명
    1. 포워드 (FSC, 셀 크기를 나타냄) 및 측면 (SSC, 셀 세분성을 나타냄) 광 산란에 기반한 손상되지 않은 셀의 게이트.
    2. 각 샘플에서 손상되지 않은 세포의 평균 형광 강도 (MFI)를 결정합니다. 간질 세포 상청액의 3 배 값에서 얻은 평균 MFI를 양성 및 음성 음성 대조군의 평균 MFI와 비교하십시오.

4. Cytokine-Transduced Stroma의 마우스 주입

참고 : 건강 세포와 적절한 사이토 카인 생산을 보장하기 위해 마우스에 주입하기 전에 해동 후 적어도 3 회의 통로에 대한 HS-27A 기질 배양.

  1. 기질의 준비
    1. 수확 한 간질 세포 현탁액을 원추형 튜브에 옮기고 분주 미터를 10 μL 나누십시오. trypan blue를 사용하여 살아있는 세포 수를 얻으십시오. 남은 천을 원심 분리하십시오.5 분 동안 500 xg에서 현탁시켰다.
    2. pelleted 세포에서 뜨는을 대기음을 부드럽게 마우스 주사 (주사하는 마우스의 수에 따라)에 대한 멸균 인산 버퍼 식염수 (PBS)의 필요한 볼륨에있는 세포를 resuspend.
      참고 마우스 주입을위한 전형적인 간질 세포 농도 : 200 μL PBS에서 마우스 당 0.5 x 10 6 -5 x 106 세포.
    3. 주입 직전까지 간질 세포 현탁액을 4 ° C (또는 얼음 위에서)로 유지합니다. 생쥐 현탁액의 세포 현탁액이 실온 (RT) (~ 25 ° C) 이상인지 확인하십시오.
  2. 간질 세포 주입
    1. 생체 안전 후드를 소독하고 주사제를 준비한 다음 마우스 케이지를 안에 넣으십시오.
    2. 부드럽게 투베르쿨린 주사기에 200 μL를 그리기 전에 반전에 의해 세포 현탁액을 섞는다.
    3. 표준 복강 내 주입 기술을 사용하여, 17마우스를 억제하고 복막 캐비티에 200 μL 세포 현탁액을 관리 할 수 ​​있습니다. 세부 사항은 이전에 Machholz et al. 18

5. 마우스에서 외인성 인간 사이토 카인에 대한 연속 혈액 수집 및 플라즈마 모니터링

  1. 테일 싹둑 을 통한 혈액 수집
    1. biosafety 후드를 소독하고 절차에 대한 마우스 restrainer, 가위 및 기타 도구 / 소모품을 조립.
    2. 마우스를 제지 장치에 놓고 마우스 움직임을 최소화하기 위해 튜브를 고정하십시오.
    3. 꼬리와 외과 용 가위를 이소 프로필 알콜로 소독하십시오. 꼬리에 국소 마취 크림을 바르십시오.
    4. 매우 날카로운 외과 용 가위를 사용하면 마우스의 꼬리 끝 부분에서 0.5 - 1 mm 정도 잘라냅니다. 헤파린 처리 된 모세관을 사용하여 말초 혈액 약 80 μL를 수집합니다.
      참고 : 혈액이이 방법으로 6 회 이상 수집되는 경우mes, 꼬리 제거는 꼬리 제거 양과 관련하여 보수적이어야합니다. 꼬리가 올라감에 따라 직경이 증가하고 출혈이 더 빨라지고 치유가 오래 걸립니다.
  2. 플라즈마 분리
    1. 구형 K 2 EDTA microtainer tube에 전구 주사기 (모세 혈관에서 꺼내기 위해)를 사용하여 혈액을 옮기십시오. 응고를 방지하기 위해 20 회 반전.
      참고 : 일반적으로 꼬리 닙에서 혈액 응고가 빠릅니다. 그러나 출혈이 ~ 2 분 이상 지속될 경우 응고를 돕기 위해 찰과상 펜슬 / 분말을 사용하십시오.
    2. 제조 업체의 지시에 따라 혈액 수집 튜브를 원심 분리기 및 ELISA 분석을 준비 때까지 보관 (-20 ° C)을 위해 분액하십시오.
    3. 마우스 혈액에서 마우스 - 인간 세포 키메라 데이터가 필요한 경우 6.3.1 단계에서 설명한대로 나머지 펠렛을 처리합니다. 그렇지 않으면 혈액 세포 펠렛을 폐기하십시오.
  3. 미세 부피에 대한 변형 된 ELISA마우스 혈장
    참고 : 제조업체의 ELISA 절차를 마우스에서 수집 한 마이크로 볼륨을 수용하기 위해 권장되는 100 μL 샘플 볼륨에서 40 μL 볼륨으로 수정했습니다. 이러한 제한된 양 으로 생체 내 마우스 혈장 샘플을 3 배로 실행하는 것은 불가능합니다. 실험 종료시 ~ 500 μL의 부검 혈액이 심장 펑크를 통해 수집됩니다. 안락사 혈장 100 μL에서 평가 된 사이토 카인 농도를 사용하여 마우스 당 40 μL 의 생체 내 데이터를 확인합니다.
    1. 해동 마우스 플라즈마 샘플을 해동.
    2. 순차적으로 ELISA 표준을 희석하고 웰당 40 μL로 3 중으로 플레이트하십시오.
    3. ELISA 플레이트에 각 마우스 혈장 샘플 40 μL를 추가합니다.
      참고 : 마우스 샘플이 40 μL 미만인 경우 ELISA 버퍼를 사용하여 최대 40 μL를 가져 오십시오. 이 희석액을 기록하고 각 희석 된 시료의 희석 계수를 계산할 때 사용하십시오. 언제ELISA 데이터를 분석하여 희석 된 시료 농도에 시료의 희석 인자를 곱하여 원래 샘플의 실제 사이토 카인 농도를 결정한다.
    4. 제조자의 지시에 따라 완전한 ELISA 분석.

6. 조혈 모세포를 마우스로 이식

  1. 장기 이식을 위해 골수를 치료하기위한 방사선 조사
    참고 : Loma Linda University (LLU)는 Cobalt-60 방사원을 사용합니다. 동물은 20X20cm 필드의 방사 소스에서 80cm, 억제 장치 상단에 Lexan 0.5cm 레이어가있는 파이 제지 장치에 배치됩니다. 가장 최근의 교정 출처 (현재이 출처의 경우 2 ~ 3 분)를 기준으로 225 cGy 용량을 달성 할 수있는 노출 시간이 계산됩니다.
    1. 치사량이 적은 마우스 (면역 결핍 마우스의 경우 225cGy의 총 신체 선량).
    2. 조혈 모세포 이식 ~ 24 시간 후 </ em> 정맥 꼬리 정맥 주사.
  2. 정맥 내 조혈 모세포 이식
    1. CD34 + 조혈 줄기 세포 (HSC) : 1 x 10 5 ~ 5 x 10 5 세포 / 마우스 및 백혈병 세포주 / 환자 샘플 : 1 x 106 ~ 마우스 당 5 x 106 세포.
    2. 이식 직전까지 세포를 4 ° C (얼음 위에서 운송)에 보관하십시오. 세포가 이식 전에 적어도 RT 상태인지 확인하십시오.
    3. 생체 안전 후드를 소독하고 이식을위한 후드 영역을 준비하십시오.
    4. 꼬리 정맥의 확장을 허용하기 위해 적어도 5 분 동안 온난 케이지에 마우스를 놓습니다.
    5. 부드럽게 세포 현탁액을 섞어 200 μL를 투베르쿨린 주사기에 넣으십시오. 바늘을 안전하게 멸균 된 곳에 보관하십시오.
    6. 마우스를 구속 장치에 넣고 이소 프로필 알콜로 꼬리를 소독합니다.
    7. 표준 정맥 주사 기술을 사용하여, 17 인간의 세포 현탁액을 마우스 꼬리 정맥에 주입.
      참고 : 꼬리 정맥 주사는 특히 초보 동물 취급자를 위해 몇 가지 시도가 필요할 수 있습니다. Kovacscics와 Raper의 JoVE 비디오 19 에서는이 동물 기법에 대한 자세한 데모를 제공합니다.
    8. ~ 5 분 동안 마우스의 회복을 모니터하십시오. 주입 중 부작용을 기록하십시오 ( 예 : 유출 세포, 주요 출혈, 과도한 꼬리 외상).
  3. 말초 혈액에서의 인간 세포 키메라 현상 분석
    1. 혈장 분리 후 microtainer tube에 남아있는 혈구 펠렛을 얻습니다 (5.2.3 단계).
    2. 적혈구 (RBC) 용해의 경우, 남아있는 혈액 펠렛을 플라스마 제거량 (혈장 용량을 대체하기 위해)과 동일한 양의 PBS에 재현 탁하고 잘 섞습니다 (와류 / 피펫).
    3. 재현 된 각 혈액 샘플을 라벨이 부착 된 4 mL 튜브에 옮기십시오.1 : 9의 비율로 각 튜브에 RBC 용해 버퍼를 추가하십시오 (재 충진 혈액 100 μL에 대해 900 μL RBC 용해 완충액). RT에서 5 분 동안 품어 둡니다. 원심 분리기 (5 분, 500 xg)와 디 캔트.
    4. 두 번째 RBC 용해 완충 배양 (RT에서 5 분)을 수행하십시오. 전과 같이 원심 분리기와 디 캔트.
    5. ~ 1 ML PBS에 남아있는 세포를 씻으십시오. 전과 같이 원심 분리기와 디 캔트.
    6. 표준 플로우 cytometry 얼룩 (이것은 제조 업체 및 개별 실험 프로토콜에 따라 다릅니다)에 적합한 PBS의 볼륨에 펠렛을 Resuspend. 마우스 세포 (마우스 CD45 +)와 인간 세포 (인간 CD45 +)를 확인하기 위해 유세포 검사에 유효성이 확인 된 면역 표현형 항체를 사용하십시오 6 , 21 또한 관심있는 세포 계통에 특이적인 추가의 인간 백혈구 마커를 포함한다.
      참고 : 각 마우스 샘플에서 작은 양 (5 μL-20 μL)을 취하여 "풀 샘플"을 만들 것을 권장합니다; unstained, 생존력 및 isotype 컨트롤 샘플에 사용합니다. 각 실험 조건에 대해 염색되지 않은 아이소 타입 컨트롤을 갖는 것이 가장 좋습니다.

7. 생체 내 Cytokine 활동의 기능 평가

  1. 마우스 안락사 및 조직 수확
    1. 지정된 실험 시점에서 이산화탄소 질식으로 마우스 를 안락사하십시오.
    2. 심장 찔림 을 통해 혈액 을 수확하고 5.2.1-5.2.2 단계와 같이 혈장을 수집합니다.
      참고 : 다른 조직보다 먼저 혈액을 모으십시오. 왜냐하면 혈액이 사망 직후 응고되기 때문입니다.
    3. 단계 5.2.2에서와 같이 마우스 혈액, 분액 및 저장 혈장을 처리합니다.
      1. 나중에, 제조자의 프로토콜에 따라 ELISA 를 통해 안락사에서 얻은 혈장의 외인성 사이토킨 농도를 평가한다. 생체 내 에서 연속적인 마우스 혈장의 외인성 사이토 카인 농도를 평가하고 비교하십시오.혈액 채취 및 안락사 혈장 샘플 (5.3 절에서 설명).
    4. 나머지 혈액 샘플에 PBS를 추가하여 혈장 용량을 대체하고 6.3.1 및 6.3.2 단계에 설명 된대로 처리합니다. 즉시 flow cytometry assay를 수행하거나 LN 2 저장을위한 동결 배지에서 세포를 재 정지시킵니다.
  2. PDX 생쥐에서 골수 (BM)와 비장을 수확하고 이전에 설명한대로 단일 세포 현탁액을 준비하십시오. 22 개월
  3. hemocytometer를 사용하여 1 : 1 희석 및 셀 카운트 세포에서 메틸렌 블루 (lyses 세포막과 살아있는 세포의 핵을 그대로 남은 RBCs)와 3 % 아세트산을 사용하여 각 PDX 마우스 조직 샘플에 대한 세포 카운트를 얻습니다. 각 동물에 대한 골수 및 비장 샘플의 총 세포 수를 표로 작성하십시오.
  4. 원심 분리 (500 XG, 15 분) 세포 현탁액과 뜨는를 따라 내. 즉시 골수 및 / 또는 비장 세포의 flow-cytometery assay를 수행하거나 LN을위한 동결 배지에 재현 <2 차 저장 장치.
    참고 : 마우스 당 10 개의 BM 분량 (미래의 생화학 분석을위한)과 5 개의 비장 분취 량 (미래의 PDX 이식을위한)을 동결하십시오.
  5. 생체 내 기능적 효과를 확인하기위한 면역 표현형 검사
    1. 대상 cytokine 및 isotype 컨트롤 항체의 두 번째 MM ( 그림 5 및 표)에 반응하는 immunophenotype 조혈 모집단 (들)에 대한 유동 세포 계측법 항체의 하나의 마스터 - 믹스 (MM)를 준비합니다.
    2. 7.4 단계에서 준비한 PDX 조직 분취 액 (37 ° C 비드 욕)을 해동하십시오.
    3. 원뿔 튜브로 전송하여 PBS의 3x 볼륨을 추가하여 해동 세포를 씻으십시오. 원심 분리기 (500 xg, 5 분)와 뜨는 상층 액을 버린다.
    4. 세척 단계를 반복하십시오 (7.5.3).
    5. unstained 컨트롤, 생존력 컨트롤 및 isotype 컨트롤 (6.4.6 단계 참조)에 대한 각 PDX 샘플 ~ 10 μL - 20 μL 세포를 취함으로써 풀링 된 aliquots을 만듭니다. u를 제외한 모든 샘플을 염색하십시오.고정 생존 염료 (죽은 세포 마커)와 함께 nstained 컨트롤, incubate 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 씻으십시오.
    6. 표준 플로 cytometry의 얼룩 프로토콜에 따라 phenotyping - MM과 각 PDX 세포 샘플을 얼룩; isotype-MM으로 풀링 된 아이소 타입 - 컨트롤 샘플 (들)을 유사하게 염색한다. 모든 샘플을 품어 PBS로 씻어 내고 1 % 파라 포름 알데히드로 재현 탁하여 샘플을 고친다.
    7. Flow cytometry 데이터를 수집하고 관심있는 세포 집단 (들)에 적합한 게이팅 전략을 사용하여 데이터를 분석하십시오 ( 그림 5 ). 일반적인 게이팅은 다음과 같습니다.
      1. 파편을 제외한 FSC 및 SSC 게이트를 그려 손상되지 않은 세포를 정의하십시오.
      2. 죽은 세포 마커 (이것은 "총 살아있는 세포")에 대해 음성 인 세포를 게이팅하여 살아있는 세포를 확인하십시오.
      3. "전체 생존 세포"내의 서브 게이트를 사용하여 원하는 면역 표현형을 갖는 세포 주를 정의하십시오 (그림 5 참조).
      4. 구하기유동 세포 계측법 분석에서 전체 생존 세포 수 내의 부분 집합 세포 집단의 빈도. 6 , 21
    8. 총 살아있는 세포 (단계 7.5.6.4에서 얻은) 내에서 B 세포 하위 집합의 주파수를 단계 7.3에서 얻은 조직 당 전체 생존 세포 수로 곱하여 각 조직의 표적 세포 수를 계산합니다 (% B 세포 하위 집합 x " 혈구 계 세포 수 "; 표 1 참조)
    9. 외인성 사이토 카인 의 생체 내 기능 효과를 결정하기 위해 대조 PDX 마우스와 사이토킨 - 발현 (TSLP +) PDX 마우스 사이의 표적 세포 집단의 세포 수를 비교하십시오 ( 표 1 ).

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결과

모델 개요가 그림 1 에 나와 있습니다. 일단 사이토 카인 - 생성 (TSLP + 간질) 및 대조 간질이 수득되면, 이들은 배양 물에서 확대된다. 생쥐에 stroma 주사하기 전에 간질 세포 상등액은 간질에 의해 생산되는 사이토 카인의 활성을 확인하는 데 사용되는 사이토킨 생산 ( 그림 2 )과 인산 흐름 cytometry (프로토콜 # 3)를 확인하기 위해 ELISA에 의해 평가됩니다. 상등액은 세포가 통과 될 때 합류 간질 세포 배양 (대조 간질 및 TSLP + 간질)에서 수집됩니다. ELISA는 초기, 중간 및 후기 단계에서 상등액에서 TSLP의 농도를 적어도 한 번은 모니터하는 데 사용됩니다. 대조 스트로마로부터의 대표적인 데이터가 도 2a 에 도시되어 있다 . TSLP 발현을 보여주는 간질 세포 배양 물 (및 ...

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토론

이 원고는 PDX를 조작하여 외인성 인간 사이토 카인을 발현하는 간단하고 신속하며 상대적으로 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 여기에 설명 된 전략은 인간 사이토 카인, TSLP를 표현하기 위해 형질 도입 된 간질 세포주의 주간 복강 주사에 기초합니다. 여기에 설명 된 방법을 수행하기 전에, 높은 수준의 관심있는 사이토킨 (TSLP)을 발현하도록 조작 된 간질 및 유사하게 조작 된 간질이 생성되었다. 여기에 제시된 프로토콜에서 간질은 배양에서 확장되고 시간이 지남에 따라 (또는 대조 간질의 경우에는 사이토 카인 생산이없는 경우) 안정하고 높은 수준의 사이토 카인 생산을 제공하는 능력에 대해 스크리닝된다. 스트로마 생성 사이토 카인의 활성을 확인하기위한 분석을 수행하고 생체 인체 TSLP (및 인간 TSLP가없는 대조 마우스)를 사용하여 PDX를 생산하기 위해 간질 세포 주입을위한 실험적 타임 라인을 개발했다. 인간 TSLP의 혈장 수준을 모니터링하는 절차 및사이토 카인 반응성 세포 집단에 대한 그의 생체 내 기...

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공개 사항

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감사의 글

이 연구는 NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, 현대 Hope on Wheels 장학생 Hope Grant, Loma Linda University School of Medicine의 병리학 및 인체 해부학과, 기초 과학과, 건강 격차 및 분자 의학 센터의 지원을 받았으며 Loma Linda University(KJP)의 공동 및 중개 연구를 촉진하기 위한 보조금의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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재료

"에서 Corning 25-900-Cl, ,
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
습식 실험실 시약 
T-25 Nunc 세포 배양 처리 EasYFlasks, 7 mL 용량,  25cm² 배양 영역Thermo Scientific / Fisher156367
T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL 용량, 75 cm² 배양 영역 & 통풍 캡Corning Inc. / Fisher353136
T-150 Falcon 조직 배양 처리 플라스크, 600 mL 용량, 150 cm² 문화 지역 & 통풍 캡Corning Inc. / Fisher355001
10 mL 혈청학 피펫Falcon357551
15 mL  폴리프로필렌 원뿔형 튜브Fisher05-539-12
5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브Falcon352054
50 mL 폴리프로필렌 원뿔형 튜브Falcon352098
2.0 mL 극저온 바이알, 외부 스레드Corning Inc. / Fisher4230659
1 mL 피펫 팁Fisher2707509
200 μ L 피펫 팁 덴빌 사이언티픽P3020-CPS
10 μ L 피펫 팁Denville ScientificP-1096-CP
멸균 일회용 필터 유닛, SFCA 멤브레인, Nalgene Rapid-FlowFisher09-740-28D
2 NH2SO4  BioLegend423001
둘베코' 칼리슘과 마그네슘이 없는 S 인산염 완충 식염수(PBS), 1×Corning cellgro/ Mediatech21-031-CV
Human TSLP ELISA Max Deluxe SetBioLegend434204
3% 아세트산과 메틸렌 블루스템셀 기술7060
Trypan Blue HBSS
"Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA
R10" 세포 배양 배지, 총 부피의 % (565 mL 제작)--Lab Recipe
RPMI, 88.5% (500 mL) 미디어테크10-040-CV   
FBS, 9.9%(56mL) Mediatech35-011-CV
L-글루타민, 0.99% (5.6 mL) Mediatech25-005-Cl
페니실린-스트렙토마이신, 0.50% (2.8 mL) Mediatech30-002-Cl
2-메르캅토에탄올, 0.10%(560 &마이크로; 엘) MP190242
<강>" R20" 세포 배양 배지, 총 부피의 % (195 mL 제작)--Lab Recipe
        RPMI, 76.84% (150  mL)위참조
      FBS, 20.49%(40mL)위 참조
        2mM L-글루타민, 1.02%(2mL)위참조
        1 mM Na 피루브산염, 1.02% (2 mL)위참조
        페니실린-스트렙토마이신,  0.51 % (1 mL)위참조
      2-메르캅토에탄올, 0.10%(0.1m),  0.10% (200 &마이크로; L)위참조
<강한>" 냉동 매체", 총 부피의 %--Lab Recipe
" R10" 중간, 45%"R10" 레시피-
FBS 참조, 20%위35-011-CV
DMSO 참조, 10%Corning25-950-CQC
D(-)(+)-트레할로스 이수화물, 5%Fisher ScientificBP2687-100
NameCompanyCatolog Number 코멘트
Biologics 
"HS-27", HS-27A, 인간 기질주ATCCCRL-2496
", "CALL-4", MHH-CALL-4, 세포주, 인간 B 세포 전구체 백혈병,DSMZ,ACC 337
" NSG 마우스" 끄덕이다. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, 남성 또는 여성, 6세 – 8주JAX 마우스 # 005557
MUTZ-5 세포주, 인간 B 세포 전구체 백혈병DSMZACC 490
재조합 인간 TSLP 단백질R& D 시스템1398-TS-010
NameCompanyCatolog NumberComments
Flow cytomery antibodies (clone)*
Anti-mouse CD45 FITC (30F11)Miltenyi Biotec130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (다른 이름은 IL-7Rα)Miltenyi Biotec130-098-094
CD34 APC (8G12)BD Biosciences340667
CD45 PE-Cy7  (하이30)eBioscience25-0459
"FVD" 고정 생존력 염료  eFluor 780 eBioscience65-0865
Ig κ 경쇄 FITC  (G20-193)BD Pharmingen555791
Ig λ 경쇄 FITC (JDC-12)BD Pharmingen561379
IgD PE (IA6-2)BioLegend348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)BD Biosciences551079
pSTAT5 PE,  마우스 anti-STAT5 (pY694)BD PhosphoFlow612567
Name CompanyCatolog 번호코멘트
>기타 재료 및 장비&
동물 이식 가능한 나노 트랜스폰더와 캐뉼라트로반;ID-100B(1.25)
EMLA 리도카인 마취 크림 (동물 관리 시설을 통해 처방하여 얻음)처방
처방 BD ½ cc LO-DOSE U-100 인슐린 주사기 28G½  BD#329461
BD 마이크로테이너 튜브와 K2EDTABD #365974
원심분리기Beckman CoulterAlegra X-15R 
FisherBrand 모세관 (Heparinized)Fisher Scientific22-260-950
혈구계Fisher02-671-6
MACS퀀트 분석기 10Miltenyi Biotec130-096-343
마우스 파이 케이지Braintree Scientific, Inc.MPC-1
마우스 꼬리 조명기 RestrainerBraintree Scientific, Inc.MTI STD
피스톨 그립 임플란터트로반 IM-300(1.25)
&마이크로; 퀀트 Bio-Tek Instruments Inc. (바이오 텍 인스트루먼트)MQX200
FlowJo 유세포 분석 소프트웨어FlowJo, LLC버전 10
*달리 명시되지 않는 한 모든 항체는 항인간적입니다.
ThermoFisher 25-053 TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P-7949

참고문헌

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