방법 논문

면역 조직 화학 및 전자 현미경을 사전은 임베딩에 대한 비 인간 영장류 뇌 조직의 준비

DOI:

10.3791/55397

⸱

2017년 4월 3일

 , 
1Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec, Department of Psychiatry and Neuroscience, Université Laval, 2Centre de recherche du CHU Sainte-Justine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리는 쉽게, 낮은 비용을 제공하고, 시간 효율적인 프로토콜은 화학적으로 투과 전자 현미경에 대한 면역 조직 화학 염색을 미리 내장과 호환되는 장기 보존을 허용, 아크롤레인 정착액와 영장류 뇌 조직을 고정 할 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

빛 현미경 수준에서 모든 기술의 진보에도 불구하고, 전자 현미경은 시냅스 연락처 등의 신경 세포의 미세 구조 및 형태 학적 세부 사항을 검토하고 특성화 신경 과학에서 유일한 도구 남아있다. 전자 현미경에 대한 뇌 조직의 잘 보존 엄격한 극저온 고정 방법에 의해 얻을 수 있지만, 이러한 기술은 오히려 비용이 많이 드는 및 확인 된 신경 시스템의 연결을 이해하는 것이 중요하다 immunolabeling의 사용을 제한 할 수 있습니다. 동결 교체 방법 immunolabeling 함께 극저온 고정 조합을 허용하도록 개발되었다. 그러나 이러한 방법 론적 접근 방법의 재현성은 일반적으로 비용이 많이 드는 냉동 장치에 의존합니다. 또한,이 기술로 신뢰할 수있는 결과를 달성하는 것은 매우 시간이 많이 걸리는과 기술 - 도전이다. 따라서, 특히 아크롤레인과 정착액 전통적인 화학적 고정 뇌, 전자를 결합하는 동시에 효율적인 저비용 방법 유지면역 조직 화학 염색과 현미경. 여기서는 영장류 뇌 조직의 보존을 초래하고 면역 및 투과 전자 현미경 검사를 미리 매립 호환 화학 아크롤레인을 고정하여 안정적인 실험 프로토콜을 제공한다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

공 초점 및 두 광자 현미경을 포함한 광학 현미경은, 2, 다른 것들 한 가운데, 생체 신경 과정에서 공부를위한 효율적인 도구가 될 입증되었습니다. 빛 현미경 (LM) 레벨의 전형적인 공간 분해능은 극 자외선과 연 X 선 현미경 등의 다른 광원을 사용하여 약 200 nm의 최근의 기술적 진보하지만, 특히 거의 10 nm의 공간 해상도 (3)이 해상도를 증가 4, 5. 화상의 다른 기술적 진보는 조직 학적으로 자기 공명 영상을 조합하여 생체 내에서 수초 만 전자 현미경 (EM) 레벨 6, 7에서 전통적으로 측정 하였다 파라미터의 두께를 측정하는 신규 방법을 제공하는 것을 포함한다. AlthouGH LM 수준에서 이러한 진보는 시냅스 접촉 생계 프로세스, 구조 상세도 및 특성을 연구하기위한 훌륭한 도구를 제공하며, 0.5 nm의 도달 할 수있는 해상도를 제공 EM으로 달성 될 수있다. 그러나, EM 수준에서 관찰은 cytoarchitecture을 유지하기 위해, 화학 고정 제 및 탈수 프로세스, 어떤 방법으로 죽은 변경 될 표본을 필요로한다. 따라서, 높은 해상도에서 생물학적 시료를 조사하기 때문에, 방사선, 전자선 손상 낮은 반면, 막 구조의 편차, 또는 8, 9, 10을 매립 다음 탈수 에폭시 발생 아티팩트에도 존재하기 어려울 수있다.

구조 분석을 위해 그 나라의 형태로 표본을 보존하는 것은 "유리화 섹션의 곳을 알아내는 EM"을 사용하거나 CEMOVIS하는 단면 처리 방법에 의해 달성 될 수급속 동결 유리체 얼음 샘플을 삽입하고, 저온 (11), (12)에서 EM 아래 부분을 검사하는 것을 포함한다. 그들은 여전히 견고하고 완벽하게 수화 동안이 절차는 따라서 탈수로 인한 아티팩트를 제거하는 것은 13을 처리, 샘플의 시험이 가능합니다. 그러나이 방법은 상당한 추가 비용을 발생 매우 낮은 온도에서 이러한 관찰을 허용하기 위해, 극저온 ultramicrotomy에 대한 추가 장치뿐만 아니라 표준 EM에 추가 장치를 포함한다. 또한 CEMOVIS 접근 항체는 일반적으로 RT에서 배양 할 필요가 있기 때문에, 기술 immunolabeling의 사용을 배제한다. 또는, 극저온 화학 보호 담궜다 및 일 동안 극저온 고정 시험편을 서서히 해동하는 동안 동결 대체 접근법을 사용하여 면역 절차 미세 분석을 조합 할 수있다엉 같은 Lowicryls 같은 전문 수지에 포함. 포스트가 임베딩 immunolabeling하는 그러한 물질 (12) 상에 수행 될 수있다. 그러나 동결 대체 및 극저온 고정 기술은 시간이 소요됩니다. 그들은 추가 장비의 설치를 필요로 여전히 낮은 온도 (14), (15)의 사용에도 불구하고, 유기 용매와 cytoarchitecture을 변경할 수 있습니다 화학 고정액에 노출 될 샘플을 필요로한다. 따라서, 특히 아크롤레인과 LM 및 EM 수준, 뇌 조직의 화학 고정, 모두에서 모든 기술의 진보에도 불구하고, EM (16) 면역 조직 화학을 결합하는 낮은 비용 및 시간 효율적인 방법 남아있다.

지난 수십 년 동안 많은 시도는 최고의 조직 보존을 제공 알데히드의 혼합물을 발견 하였다. 1960 년대 이전, EM을 위해 허용되는 결과를 제공하는 유일한 화학 고정액은 오스뮴 테트 록 사이드이었다. 그러나, 산화 오스뮴은 뇌 등의 장기를 해결하기 위해 혈관 시스템을 통해 사용을 배제, 매우 독성이 비싸다. 아크롤레인 셀룰러 구조 (17)의 EM 관찰에 적합한 동물 조직 보존에 대한 신뢰성있는 방법으로서, 1950 년대 후반에 도입 하였다. 이는 더 깊은 조직을 관통하여 고정 침지 사용하고 조직 (17)의 최소 수축와 세포질 성분의 양호한 보존을 허용 다른 알데히드보다 빠르게 반응한다. 효소 및 다른 단백질 18 고분자 화합물을 살아있는보다 정확한 위치 파악을 가능하게하여, 신선한 조직에 사용되는 경우 이러한 특징은 고정 아크롤레인을 다른 알데히드에 비해 명확한 이점을 제공한다. 사실, 그것은 효율적으로 열차 단으로, 양서류 및 설치류 등 많은 종의 EM 수준의 시각화를위한 고정의 쉽고, 효율적이고 저비용의 방법으로 세월을 통해 검증되었습니다ZES 펩티드 및 단백질, 항원 성을 유지하고 16, 18, 19, 20, 21 정착액 다른 알데히드 병용 비교적 그대로 미세 구조를 제공한다. 설치류에서 아크롤레인 고정을위한 프로토콜은 그 이후 표준화 및 EM (16), (22)에 대한 이중 immunolabeling을 구현하기 위해, 특히 피켈 그룹에 의해 광범위하게 사용하고 있습니다. 몇 그룹은 인간이 아닌 영장류의 뇌 조직 23 아크롤레인 고정을 사용했다. 그러나, 우리의 지식을 효율적으로 EM (24) immunolabeling와 호환되는 인간이 아닌 영장류에서 아크롤레인과 화학 고정을 설명하는 하나의 출판 프로토콜이있다.

이 글에서, 우리는 효율적으로 화학적으로 비 콧노래를 해결하는 쉽고 안정적인 방법을 제공immunolabeling 송신 EM 시험을 미리 매립 함께 잠재적 장기 보존을 가능하게 아크롤레인와 영장류 뇌.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

윤리 문 : 동물과 관련된 모든 프로토콜은 Comité 드 보호 데스 Animaux 드 난 대학 라발에 의해 승인되었고, 실험 동물의 관리 및 사용 (에드 2.)에 동물 관리 안내서에 캐나다 의회에 따라 만들어졌다. 여기에 설명 된 프로토콜은 약 800g의 성인 동물에 최적화되었다. 고정액의 볼륨은 동물의 크기에 따라 조정되어야한다.

Transcardiac 관류를위한 솔루션 1. 준비

  1. 다음 단계에있어서, 50 mM의 나트륨, 인산 완충 용액 (PBS) 용액 1 L를 준비한다. 관류 전에 대부분 24 시간에서 솔루션을 준비하고 사용할 때까지 4 ° C에서 보관하십시오.
    1. 1 L의 비커에, 증류수 800 mL로 측정한다. 무수 이염 기성 인산 나트륨 5.87 g을 추가 (NA 2 HPO 4) 수화물 염기성 인산 나트륨 1.20 g (의 NaH 2 PO 4 · H 2 O), 9 g염화나트륨 (NaCl을). 용해 저어.
    2. 서서히 5 N NaOH를 첨가하여 7.4로 pH를 조정한다. 1 L.의 총 부피에 도달하기 위해 증류수를 추가
      주의 : NaOH를가 부식성 화합물이다. 적절한 개인 보호 장비 착용 (PPE;. 실험복, 장갑, 보호 안경 등).
  2. 다음 단계에있어서, 4 % 파라 포름 알데히드의 2 L를 준비한다. 이 용액을 수술 전에 최대 24 시간을 제조하고 사용할 때까지 4 ℃에서 보관한다.
    1. 2 L의 비이커에 증류수 1.5 L을 측정한다. 무수 이염 기성 인산 나트륨 23.48 g (NA 2 HPO 4) 염기 수화물 인산 나트륨 4.80 g 추가 (의 NaH 2 PO 4 · H 2 O). 용해 저어. 2 L.의 총 부피에 도달하기 위해 증류수를 추가
    2. 55 ° C - 온도가 약 45에 도달 할 때까지 통기 후드 아래의 용액을 가열한다. 60 ° C 이상으로 가열하지 마십시오.
    3. 점차적 PFA 용액 80 g을 넣고 완전히 용해 될 때까지 교반 하였다 (약 30 - 60 분)를. 60 ° C 이하를 유지하기 위해 온도를 모니터링하십시오.
      주의 : PFA는 분말 형태로 매우 휘발성이다. 그것은 눈이나 피부에 접촉하면 매우 독성이며, 흡입 또는 섭취의 경우에는 위험합니다. PPE를 착용하고, 배기 후드 아래에주의하여 사용합니다.
    4. 39 ° C 필터로 용액을 냉각. 4 ℃에서 보관하십시오.
  3. 다음 단계에있어서, 0.1 M 인산 완충액 (PB)에 3 % 아크롤레인 1 L를 준비한다. PB에 솔루션은 이전 관류에 최대 24 시간을 준비해야합니다.
    주의 : 아크롤레인을 흡입하고 즉각적인 손상을 일으킬 수있는 경우에 매우 독성이있다. 피부를 통해 흡수하는 경우에도 부식성 및 독성이 높은 것입니다. 그것은 발암 물질과 돌연변이입니다. 적절한 개인 보호구를 착용하고, 배기 후드 사용합니다.
    1. 증류수 800 mL로 측정한다. 무수 이염 기성 인산 나트륨 8.66 g을 추가 (NA 2 HPO 4) 염기 수화물 인산 나트륨 5.38 g (의 NaH 2 PO 4 · H 2 O). 모든 염이 용해 될 때까지 저어. 4 ℃에서 용액을 유지 총 용적 1 ℓ에 도달 증류수를 추가한다.
    2. 수술하기 전에, 1 L의 유리 용기에 PB 용액 900 mL로 전송하고 배기 후드 아크롤레인 97 % 용액 30.94 mL를 첨가. 1 L과 혼란의 총 부피에 도달하기 위해 PB 솔루션을 추가합니다. 솔루션을 필터링하고 4 ℃에서 보관하십시오.

2. Transcardiac 관류 및 뇌 해부

  1. 전체 수술 절차를 수행하는 동안 얼음에 솔루션을 유지합니다. (50 mM의 PBS) 및 공기 호스에 남아 있지 않을 때까지 펌프의 회전에 사용되는 제 용액에 튜브를 배치하여 펌프를 준비한다. 짧은 꼬리 원숭이의 (rongeur)로 들어 21 G 바늘을 사용하여 유출 물을 약 80 ㎖ / 분으로 설정.
  2. 혼합의 근육 내 주사하여 동물을 마취케타민 (20 ㎎ / ㎏), 자일 라진 (4 ㎎ / ㎏) 및 아세 프로 마진 (/ kg, 0.5 mg)을 진짜야. 이소 플루 란 (3 %) 마취하에 동물을 유지한다.
  3. 통기 테이블에 동물의 사지를 연결합니다.
  4. 메스로, 겨드랑이에 피부를 제거합니다. 복부 근육을 잘라. 주의 깊게 중요한 장기를 피하고 옆으로 갈비뼈를 잘라 대형 수술 가위를 사용합니다.
  5. 수술 용 가위로 다이어프램을 절감하고 심장을 노출 흉곽을 올린다. 다이어프램이 차단되면 심장 분 이내에 박동 정지하기 때문에, 신속하게 진행합니다.
  6. 메스 블레이드와 심낭를 제거하고 좌심실에 바늘을 삽입합니다. 메스로 조심스럽게 우심방에 작은 절개를합니다. 신속 72 ㎖ / 분으로 펌프를 시작 위치에 바늘을 잡아. 가능하면 심장보다 낮은 수준에 머리를하기 위해 동물을 기울입니다.
    참고 : 바늘을 삽입 할 때 심실 중격을 관통하지 않도록주의하십시오.
    1. RINS폐까지 PBS의 약 300 mL를 전자 혈액은 흰색이며, 어떤 피가 우심방에서 온다.
  7. 신속하게 펌프를 정지 3 % 아크롤레인 솔루션에 호스 / 튜브를 전송하고 다시 펌프를 시작합니다. 심장 박동이 중단되면 서서히 80 mL / 분으로 펌핑 속도를 증가시킨다. 아크롤레인 용액 ​​약 500 ㎖을 관류.
  8. 신속하게 펌프를 정지 4 % PFA 솔루션에 호스를 전송하고 다시 펌프를 시작합니다. 이 단계는 PFA의 약 1 L가 필요하다.
    참고 : 앞다리가 경직하고 목이 뻣뻣한 때 고정이 완료됩니다.
  9. 머리를 잘라 조심스럽게 두개골의 두뇌를 해부하다. 수술 악기 뇌를 손상하지 않도록주의하십시오. 뇌는 담색 (혈액의 흔적) 및 강성 (도 1a) 없을 때 관류 최적이다.
  10. 4 ℃에서 1 시간 동안 4 % PFA에 그대로 머리를 담가.
  11. 직렬 냉각에 vibratome (39 °의 C)에 뇌를 잘라50 개 μm의 두께 단면에 원하는 평면 PBS (0.1 M) (도 1b)에서이를 수집한다.
    참고 :이 단계는 원하는 프로토콜에 따라 여러 가지 방법으로 수행 할 수있다. 반구 절단하거나 유지 전체에 vibratome 전에 분리 될 수있다. 뇌가에 vibratome 플랫폼에 대한 너무 큰 경우에는 작은 블록으로 절단 할 수있다. 이 단계 후에, 부 40 %의 PB (50 mM)을 30 % 글리세롤, 30 % 에틸렌 글리콜로 이루어진 부동액에서 -30 ° C에서 장기간 저장 될 수있다.

3. 면역을 사전 내장 (그림 1C)

  1. 다음 TBS 버퍼의 4 L 원액 (TBS, 50 mm의 pH를 7.6)을 준비한다.
    1. , 4 L의 비커에, 증류수 2L 측정 트리 히드 록시 아미노 메탄에 24.23 g의 추가 (탐은, C 4 H 11 NO 3), 및 교반 용해한다.
    2. 1 N 염산 148 mL로 약 7.6 pH를 조정한다. 산은 CAUTI 첨가되어야에 7.6 이하의 pH가 소진되지 않도록. 총량이 있어야 4 L.
      주의 : 염산은 부식성이 높은 것입니다. 적절한 개인 보호구를 착용 할 것.
  2. 관심있는 영역을 포함한다 (단계 2.11)에서 선택 섹션 EM의 면역 조직 화학을 위해 처리된다.
  3. 부동액 용액을 씻어 RT에서 5 분 동안 PBS에서 부동성 섹션 배 (0.1 M, pH를 7.4) 세척 하였다.
  4. PBS에 희석을 NaBH 4의 0.5 % 용액을 제조 하였다.
    1. 을 NaBH 4 0.05 g을 달아 PBS 10ml에 희석. 덮지 마시오. 사용 직전이 솔루션을 준비합니다.
  5. RT에서 30 분 동안 갓 제조에 NaBH 4 용액의 섹션을 인큐베이션. 부드럽게 록. 덮지 마시오.
  6. RT에서 10 분 동안 PBS에서 세척 (3X)는, 반응 가스 중에까지 격렬하게 요동하는 유지된다.
  7. 적절한 2 % 정상 혈청 PBS에 희석하고 0.5 % 냉 어류 젤라틴 EM에 대한 블로킹 용액을 제조 하였다.
    참고 : 수량 말아야위하여 계산 d는 다음 세 단계를 위해 충분한다. 이차 항체를 수용하는 동물 종에서 만든 혈청을 사용합니다. 이러한 방법은 상당히 조직의 품질을 타협 항원 검색 방법 또는 트리톤 소량 첨가의 사용을 피하고 (항체의 침투를 증가시키기 위해).
  8. RT에서 1 시간 동안 블로킹 용액 섹션을 인큐베이션. 부드럽게 록.
  9. 블로킹 용액으로 희석하여 차 항체 용액을 제조 하였다.
    주 : 차 항체의 농도는 일반적 LM의 면역과 동일하지만, 일부 차 항체 아크롤레인 작동하지 않을 것처럼 미리 상이한 항체 농도 도통 검사를 고려한다. (- 2 %, 0.1) 및 (rongeur)로 4 % PFA에 대한 유사한 결과를 얻을 경우에 따라서, 이는 글루 타르 알데히드의 혼합물을 사용하는 것이 가능하다. 배양 시간 및 온도뿐만 아니라 최적화.
  10. 차 항체 용액 섹션을 인큐베이션하룻밤 부드러운 락과 RT에서. 이전에 테스트를 배양 시간과 온도를 사용합니다.
  11. 부드러운 락과 RT에서 5 분 동안 PBS에 섹션 배를 씻으십시오.
  12. 블로킹 용액으로 희석 한 비오틴 차 항체 용액 1,000 : 1을 준비한다.
    주 : 차 항체는 일차 항체를 생성하는 데 사용되는 호스트 종에 대해 제기해야합니다.
  13. RT에서 1.5 시간 동안 차 항체 용액 섹션을 인큐베이션. 부드럽게 록.
  14. 적어도 60 분 전에 차 항체 배양의 마지막에, 아비딘 - 비오틴 - 퍼 옥시 다제 (ABC) 용액을 제조 하였다.
    1. 용액 A와 B의 8.80 μL / mL로 측정하고,이를 PBS에서 희석 보정 피펫을 사용한다.
    2. 아비딘 및 비오틴 분자 사이의 결합 전체 있도록 RT에서 최소 60 분 동안 온화하게 흔들.
  15. 이차 항체 용액에서 배양 한 후, RT에서 10 분 동안 PBS에서 3 회 세척 하였다.
  16. 그래서 ABC에 섹션을 품어RT에서 1 시간 동안 기술인 것. 부드럽게 록.
  17. 부드럽게 흔들 함께 RT에서 10 분 동안 TBS 한번 PBS에 두 번 세척 하였다.
  18. TBS로 희석 0.005 %의 H 2 O 2, 0.05 % 3,3'- 디아 미노 벤지딘 (DAB)의 새로운 용액을 제조 하였다.
    1. DAB 12.5 mg의 무게 차가운 TBS의 25 ㎖에 희석. 빛으로부터 보호합니다.
      주의 : 흡입하면 DAB 분말은 매우 휘발성 유해하다. 그것은 발암 및 기형이다. 희석 할 때 따라서, 임신 또는 수유 여성은 심지어,이 제품을 조작 할 수 없습니다. 조작시 N95 마스크를 사용하여 PPE를 착용하십시오.
    2. 용액을 여과하고, 사용 직전 30 % H 2 O 2 4.5 μL를 추가한다.
  19. RT에서 3 분 내지 7에 대한 DAB 용액 섹션을 인큐베이션. 부드럽게 록.
    주 : 갈색 침전물을 배경 염색의 높은 수준을 피하기 위해 너무 어둡게해서는 안됩니다. 배양 시간은 적절하게 최적화되어야한다.
  20. 빠르게 두 번 세척하여 반응을 중지차가운 TBS에서, 다음 회 RT 추운 TBS에서 10 분 동안 온화 락 PB로 2 회 10 분으로 하였다.
    참고 : PB (그리고 PBS)의 사용은 오스뮴 및 형태의 결정과 반응하는 것처럼, 염화나트륨의 흔적을 제거하기 위해 매우 중요합니다.

전자 현미경 관찰 4. Osmification 및 포함

  1. PB로 희석하고, 1 % 오스뮴 테트 록 사이드의 용액 (OSO 4)을 준비한다. 빛으로부터 보호합니다.
    주의 : 오스뮴은 매우 독성이 있으며 피부, 눈, 입과 접촉하지 말아야하고 흡입하지 않아야합니다. 섭취 한 경우는 사망에이를 수 있습니다. 그것은 단지 배기 후드 및 적절한 PPE와 함께 사용되어야한다.
  2. (교반)없이 배기 후드 RT에서 30 분 동안 용액에 OSO 4 섹션을 인큐베이션하고 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 커버. 완전히 OSO 4 용액을 첨가하기 전에 부분을 평평하게.
    참고 :이 부분은 매우 어둡고 리하게GID이 단계 다음주의 조작해야합니다.
  3. osmification 중에 발수 에폭시 수지를 준비한다.
    1. 큰 플라스틱 컵에 에폭시 수지 혼합물 (에폭시 수지 20 g, 경화제 20 g, 0.6 g 촉진제 및 가소제 0.4 g)의 각 성분의 적절한 양을 추가한다. 균일 한 갈색 얻을 때까지 나무 막대기 또는 플라스틱 피펫으로 저어.
      참고 : 각 구성 요소의 정확한 비율을 사용하는 것이 중요합니다.
    2. 적절한 크기의 알루미늄 컵에 동량로 이동 구간의 수에 따라 처리한다. 이 휴식을 허용합니다.
  4. osmificated 섹션 저속 락과 RT에서 10 분 동안 PB에 3 배 씻으십시오.
  5. 2 분마다 등급의 에탄올을 다음과 같은 일련의 섹션 탈수 35 % 에탄올에서 2 회; 1 시간 (50)에서 각각 70, 80, 90, 및 95 % 에탄올; 100 % 에탄올에 3 배.
  6. dehydrati을 완료하는 데 유리 병에 섹션을 이동프로필렌 옥사이드 2 분간 섹션 3 회 배양함으로써 프로세스에.
    주의 : 프로필렌 옥사이드는 높은 휘발성 및 독성 유기 용매이다. 그것은 접촉시 또는 흡입 또는 섭취하면 눈이나 피부에 심각한 손상을 일으킬 수 있습니다. 그것은 2 급 발암 물질로 분류되고있다. 그것은 단지 배기 후드 및 PPE와 함께 사용되어야한다. 그것은 또한 매우 인화성이 멀리 열원에서 보관해야합니다.
    주 : 프로필렌 산화물, 유기 용매 및 수지와 호환 때문에이 단계를 수행하기 전에, 섹션 신중 유리 바이알에 전달되어야한다. 이 시점에서, 섹션은 매우 약하기 때문에주의를 조작해야합니다. 섹션 4.5 대안 단계 전에 유리 바이알에 전달 될 수있다.
  7. 주의 깊게 전송 섹션 알루미늄 컵에 하나씩, 그리고 가능한 한 많은 공기와 접촉을 피하십시오. 균일 포함 미리 혼합 발수 에폭시 수지의 부분을 상기 통기에서 밤새 배양 그들을RT에서 g 후드.
    참고 :이 단계에서, 섹션은 완전히 탈수 매우 약하기 때문에주의를 조작해야합니다.
  8. 미네랄 오일을 사용 기름칠 플라스틱 커버 슬립 함께 그리스 코팅 된 유리 슬라이드를 준비한다.
  9. 대부분에서 12-15 분 동안 60 ° C에서 알루미늄 컵을 배양하여 수지를 연화. 조심스럽게 유리 슬라이드의 기름을 바른 쪽의 부분을 평평하게. 기름칠 커버 슬립을 놓고 조심스럽게 남아있는 공기를 밀어 넣습니다.
  10. 48 시간 동안 60 ℃에서 인큐베이션 슬라이드.
    참고 : 수지가 너무 열심히 될 것으로, 48 시간의 배양 시간을 초과하지하는 것이 중요합니다.
  11. 플라스틱 커버 슬립을 제거합니다.

전송 전자 현미경을 사용하여 초박막 단면 및 관측 5. 샘플 준비

  1. 관심 영역을 찾기 위해 쌍안경을 사용하여 메스 약 1mm 2의 작은 사각형 조각을 잘라.
  2. 수지 블록의 끝 파일과 숨어 접착제adrangular 편 그 위에 (도 1C). 접착제는 적어도 1 시간 동안 또는 밤새 절편 종래 동안 건조 할 수있다.
  3. 을 Ultramicrotome를 사용하여, 두께 80㎛의 부분 (도 1D)에 사각형 조각을 잘라.
    1. 서서히 부드러운면을 가진 사다리꼴을 형성하는 수지 블록의 각각의 측면을 절단하는 날카로운 면도날을 이용하여 수직 위치에서 갑판을 Ultramicrotome의 수지 블록을 놓고.
    2. 수평 위치 갑판 넣고 사다리꼴의 긴 측이 하방으로 향하게 될 때까지 블록을 회전한다.
    3. 사각 조각의 표면을 트리밍 다이아몬드 트리밍 도구 나 유리 칼을 사용합니다. 을 Ultramicrotome은 / s 1mm에서 300 개 μm의 두께 부분을 잘라 설정한다. 수직 일 방형 부재 평행 약 1 °의 매우 작은 수평 각도를 표시하는 칼을 조정한다.
      참고 :이 각도가 거의 B의 표면에 평행 한 사용자가 조직에 접근 할 수 있습니다immunolabeled 요소가 발견 될 가능성이있는 곳, 잠급니다. 다이아몬드 트리밍 도구를 사용하여 이러한 매개 변수를 사용하는 경우, 수지는 반짝이 흰색 색상을 표시합니다. 조직이 절단 될 때, 그것은 자주색 또는 녹색 색상으로 변경됩니다.
    4. 크실렌 스쳐 용지를 흡수하는 부재로 인계 부분을 부드럽게, 80 개 μm의 두께 부분을 잘라 증류수로 채워진 보트를 구비 한 초 45 ° 다이아몬드 나이프를 사용하여 formvar 피복 니켈 슬롯 격자 또는 직렬 섹션을 수집 베어 150 메쉬 구리 그리드 (도 1E).
  4. 그리드 스토리지 상자에 격자를 놓습니다.
  5. 납 시트르산 그리드 얼룩.
    1. 여과 한 리드 시트 레이트 스톡 용액의 용액을 여과하고, 증류수 : 5 ml 주사기 및 1을 제조하기 위해 0.2 ㎛의 주사기 필터를 사용한다. 빛으로부터 보호.
      참고 : 리드 구연산의 원액 고체 depos의 형성을 방지하기 위해 매월 신선한해야한다그. 주식 레시피의 재료 데이터 시트를 참조하십시오. 그리드 많은 계열 염색해야하는 경우가 유백색지면 또한, 희석 용액을 변경.
    2. 상기 용액과 접촉하는 부분에, 희석 된 용액에 한 방울을 각 격자 놓는다. 3 분 동안 인큐베이션.
    3. 그리드를 개최 작은 핀셋을 사용하여 철저하게 증류수를 포함하는 두 개의 비커에 씻어.
    4. 부드럽게 흡수 종이를 사용하여 여분의 물을 제거합니다. 그리드 상자에 그리드를 저장합니다. (도 1 층 TEM) 투과 전자 현미경으로 섹션을 검사하기 전에 30 분을 기다립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 섹션에서는 화학적으로 3 %의 아크롤레인의 혼합물을 4 % PFA로 고정 면역 염색 영장류 뇌 조직, 송신 EM 수준에서 관찰 다음 얻어진 대표적인 결과를 제시한다. 비교적 그대로 수초 이중 막 (도 2A)의 깔끔한 시각화로 나타낸 바와 같이 우리는 미세 구조의 양호한 보존을 달성했다. 미세 환경에서의 연결 요소와 더불어 시냅스 접촉이 용이하게 (도 2b)에 의해 식별 될 수있다. 디아 미노 벤지딘 (DAB)로 표지 면역 침전의 연결 요소들은 채워진 세포질 또는 axoplasm하여 EM 레벨로 인식된다. 세포막 및 세포 소기관의 외부 표면은 일반적으로 전자 밀도 침전물 (도 3)가 줄 지어있다.

이 특정 실험에서, 우리는 항체의 AGA를 사용외부 (Play 에디션) ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 문서에서는, 비 - 인간 영장류 및 EM 샘플 시험에 적합한 사전 매립의 면역 조직 화학 (rongeur)로하는 ​​신뢰성 프로토콜을 제시한다. 같은 CEMOVIS 전형적인 냉동-EM은, 뇌의 미세 구조의 좋은 보존을 제공하지만, 그것은 또한 면역 조직 화학 (12)의 사용을 제한합니다. 극저온 대체 및 Tokuyaso 기술을 포함한 다른 기술, 면역 조직 화학을 매립 후 허용하지만, 이러한 기술로 인해 과정에서 필요한 추가 장치 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리는 12, 14, 15 스킬에 도전 할 수있다. 또한, 효율적 크라이 정 방법을 사용하기 위해, 시료 (29 기압에서 28 ~ 10㎛ 냉동 고압을 사용하는 경우, 두께 2...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 자연 과학 및 (MP에 NSERC, 401848-2011) 캐나다의 공학 연구위원회에 의해 지원되었다. MP는 퐁 드 공들인 퀘벡 - 상테 (FRQ-S)에서 경력 상을 받았다. LE는 FRQ-S (FRQ-S 29,441 14D) 박사로부터 수신자의 교제이었다. 우리는 기술 지원을 마리 Josée Wallman 감사합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
이염 기성 무수 인산 나트륨 (Na2< / sub>HPO4< / sub>)Fisher scientificS374-500
일 염기성 일 수화물 인산 나트륨 (NaH2< / sub>PO4&# 183; H2O)EM ScienceSX0710-1
염화나트륨 (NaCl)Fisher scientificS271-3
하이드록시메틸 아미노메탄 (THAM)Fisher scientificT370-500
HCl EMDHX0603-31 N 희석. 제품이 부식성이 있습니다. 적절한 보호 장치와 함께 사용하십시오.
NaOHEMDSX0590-15 N 희석. 제품이 부식성이 있습니다. 적절한 보호 장치와 함께 사용하십시오.
파라포름알데히드(PFA)시그마P61484% 희석. 제품은 분말 형태로 휘발성이 높고 독성이 강합니다. 적절한 보호 장치가 있는 환기 후드 아래에서 주의해서 사용하십시오.
아크롤레인(90%)시그마1102213% 희석. 제품은 독성이 강합니다. 적절한 보호 장치가 있는 환기 후드 아래에서 사용하십시오.
부검 환기 테이블MopecCE400
전자 관류 펌프콜 파머masterflex L/S 7523-90
바늘 (관류)테루모 NN-1838R18 G 11/2
바늘테루모 NN-2713R21 G 1/2
케타민20 mg/kg
자일라진4 mg/kg
아세프로마진0.5 mg/kg
메스
칼깃털                    랜스201011                    J9913No.22 수술 및 No. 11 EM
외과 가위
Rongeurs
VibratomeLeicaVT 1200S장치가 허용하는 경우 매번 사용하기 전에 블레이드를 보정
Vibratome 면도날질레트GIN 642107
글리세롤피셔 사이언티픽G33-430 % 희석
에틸렌 글리콜Fisher scientificE178-430% 희석
수소화붕소나트륨(NaBH4)SigmaS-9125
Normal horse serum (NHS)Jackson immunoResearch Laboratories008-000-1212% 희석
냉어류 젤라틴Aurion900.0330.5% 희석. 원제품은 1차 항체 40%,
SERTSanta Cruz biotechnologySC-14581/500 희석
1차 항체, ChATChemicon (Millipore)AB144P1/25 희석
1차 항체, THImmunoStar229411/1,000 희석
Biotinylated 2차 항체, 염소Vector laboratoriesBA-95001/1,000에 집중되어 있습니다. 희석
Biotinylated 2 차 항체, 마우스Vector laboratoriesBA-20001/1,000 희석
Vectastain 엘리트 ABC 키트Vector laboratoriesPK61008.8 µ L/mL A 및 B 각
3,3'-디아미노벤지딘(DAB)SigmaD56370.05% 희석. 제품은 분말 형태로 휘발성이 높고 독성이 있습니다. 싱크대에 쓰레기를 버리지 마세요.
과산화물 (H2O2) 30%Fisher scientificH-3230.005% 희석
사산화오스뮴(OsO4)전자 현미경 과학2% 19152
4% 19150
원래 용액은 2 또는 4%일 수 있습니다. 최종 1% 희석을 계산하는 데 어떤 것이 사용되는지 주의하십시오. 제품은 빛에 매우 민감합니다. 오스뮴은 독성이 매우 높습니다. 적절한 보호 장치가 있는 환기 후드 아래에서만 사용하십시오.
Durcupan 발수 에폭시 수지SigmaA: M 에폭시 수지 (44611)
B: 경화제 964 (44612)
C: 가속기 960 (DY 060) (44613)
D: 가소제 (44614) 		58 °에 48 h를 중합하십시오; C 쓰레기를 버리기 전에.
Alumium 컵전자 현미경 과학70048-01
에탄올상업용 알코올1019C적절한 농도의 증류수에 희석
프로필렌 산화물전자 현미경 과학20401유기 용매. 휘발성이 높고 독성이 있습니다. 환기 후드 아래에서 사용하십시오.
비코팅된 중간 유리 슬라이드뇌 연구소3875-FR그리스 표면에는 미네랄 오일이 있습니다.
플라스틱 필름 (Aclar 임베딩 필름)전자 현미경 과학50425-25그리스 표면에는 미네랄 오일이 있습니다
초소형Leica UC7EM UC7
다이아몬드 트리밍 도구 (ultratrim)Diatome UT 1081유리 칼을 선택적으로 사용할 수 있습니다
. 울트라 45도; Diatome 다이아몬드 나이프Diatome MC13437 보트가 장착되어
XylenesFisher scientificX5SK-4
150메시 구리 그리드 전자현미경 과학G150-cu
그리드 박스전자 현미경 과학71138최대 100개의 그리드를 저장할 수 있습니다
구연산나트륨Anachemia81983
질산납SigmaL-62581.33  질산납 g 및 1.76  42 에 희석된 구연산나트륨 g; 미리 끓이고 냉각된 증류수 mL 8  1  mL N NaOH는 질산납에서 시트르산납으로의 전환이 완료된 후에 추가됩니다. pH는 약 12여야 합니다. 용액을 밀폐 플라스틱 병에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오.
주사기terumo SS-05L5 mL
주사기 필터Corning4312220.2 µ m
흡수지 (bibulous paper)전자 현미경 과학70086-1
파라 필름실험실 필름PM-999
미네랄 오일시그마M5904
날 하십시오 . 은 있습니다

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005(2015).
  2. Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
  3. Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
  4. Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
  5. Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
  6. Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
  7. Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
  8. Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
  9. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
  10. Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
  11. Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
  12. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
  13. Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
  14. Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
  15. Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
  16. Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
  17. Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
  18. Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
  19. King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
  20. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
  21. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
  22. Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
  23. Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
  24. Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
  25. Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
  26. Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
  27. Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
  28. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
  29. Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
  30. Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
  31. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
  32. Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
  33. Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
  34. Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
  35. Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
  36. Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
  37. Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
  38. Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
  39. Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
  40. Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).
  41. Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
  42. van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
  43. Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
  44. Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
  45. Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008(2016).
  46. Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
  47. Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

Acrolein FixationTissue SectioningAntibody IncubationDAB StainingOsmium TetroxideEpoxy Resin EmbeddingUltramicrotomy

관련 논문