대뇌 혈류와의 광 산란 특성을 동시에 평가 생체 다중 스펙트럼 확산 반사 이미징을 이용한 쥐 뇌

Summary

뇌 혈류 역학 및 생체 내 쥐의 뇌 조직의 산란 특성의 동시 평가는 종래의 멀티 스펙트럼 확산 반사율 촬상 시스템을 이용하여 설명된다.

Abstract

생체 내 쥐 뇌 조직의 대뇌 혈류역학 및 광 산란 특성의 동시 평가는 기존의 다중 스펙트럼 확산 반사 이미징 시스템을 사용하여 입증됩니다. 이 시스템은 광대역 백색 광원, 협대역 간섭 필터 세트가 있는 전동 필터 휠, 광 가이드, 수집 렌즈, 비디오 줌 렌즈 및 단색 CCD(Charged-Coupled Device) 카메라로 구성됩니다. 타원형 두개골 창은 이소플루란 마취 하에 쥐의 두개골 뼈에 만들어져 피질 표면의 생체 내 다중 스펙트럼 확산 반사 이미지를 캡처합니다. 가스 혼합 장치를 사용하여 흡기 산소의 분율을 조절하면 정상 산소, 고산소 및 무산소증과 같은 다양한 호흡 상태를 유도할 수 있습니다. 그런 다음 9개 파장(500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 및 760nm)에서 측정된 다중 스펙트럼 확산 반사 이미지에 대한 몬테카를로 시뮬레이션 기반 다중 회귀 분석을 수행하여 생체 내 쥐 뇌의 혈역학 및 광 산란 특성의 2차원 지도를 시각화합니다.

Introduction

멀티 스펙트럼 확산 반사율 영상은 피질 조직에서 고유의 광 신호 (손실이 최소화)의 공간지도를 획득하기위한 가장 일반적인 방법이다. 형태 학적 변화에 의해 유발 된 광 산란 특성의 광 흡수 변화 의한 피질 혈류 역학에 대한 산란 성질, 감소 또는 미토콘드리아 내의 사이토 크롬의 산화에 따라 흡수 편차 및 변형 : 손실이 최소화 주로 세 현상에 기인하는 생체의 뇌에서 관찰 ^1.

근적외선 (NIR) 분광 범위 (VIS)에 보이는 빛을 효과적으로 흡수 및 생체 조직에 의해 산란된다. 생체의 뇌의 확산 반사율 스펙트럼은 흡수 및 산란 스펙트럼을 특징으로한다. 감소 된 스 캐터링 계수는 단조로운 산란 스펙트럼 전시에 VIS 투 NIR 파장 범위의 결과 뇌 _조직들 'μ긴 파장에서 더 작은 크기를 보내고. 감소 된 산란 스펙트럼 계수 _{μ는 S} '(λ)는 _s의 μ로서 멱 함수 ^{(2), (3)의} 형태로 근사 할 수있는'(λ)는 λ × ^-b =. 산란 파워는 조직 B ^{(2, 3) 살아있는} 생물에서 산란의 크기에 관련된다. 조직 및 대뇌 피질의 생체 조직의 생존을 감소 형태 학적 변화는 생물학적 산란 ^{4, 5, 6, 7, 8, 9의} 크기에 영향을 미칠 수있다.

멀티 스펙트럼 확산 반사율 촬상 용 광학 시스템을 용이 백열 리로 구성 될 수있다GHT 원본, 간단한 광학 구성 요소 및 단색 충전 결합 소자 (CCD). 따라서, 다양한 알고리즘과 멀티 스펙트럼 확산 반사율 촬상 광학 시스템은 피질 혈류 역학 및 / 또는 티슈 형태 ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18을} 평가하기 위해 사용되었다.

본 문서에 기재된 방법은 혈류 역학과 종래의 멀티 스펙트럼 확산 반사율 이미징 시스템을 사용하여 생체 내에서 래트 뇌 조직의 산란 특성 모두를 시각화하는데 사용된다. 대안 기술을 통해이 방법의 장점은 대뇌 혈류 역학과 대뇌 피질의 조직 모두의 시공간적 변화를 평가 할 수있는 기능입니다형태뿐만 아니라 다양한 뇌 기능 장애의 동물 모델에의 적용. 따라서, 방법은 외상성 뇌 손상, 간질 발작, 뇌졸중, 허혈의 조사에 적합합니다.

Protocol

동물 관리, 준비, 실험 프로토콜은 도쿄 농공 대학의 동물 연구위원회에 의해 승인되었다. 이 방법의 경우, 래트는 음식과 물을 사용할 수의와, 제어 된 환경 (24 ° C, 12 시간 광 / 암주기)에 수용된다.

광파 멀티 스펙트럼 확산 반사율 이미징 시스템의 1. 건설

1. 산의 중심 파장 협 아홉 광학 간섭 필터 500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, 및 전동 필터 휠의 필터 구멍 760 내지.
2. 광대역 백색 광원, 협 대역 간섭 필터들의 상기 세트, 광 가이드, 포집 렌즈, 비디오 줌 렌즈, 및 모노크롬 CCD 카메라와 전동 필터 휠을 사용하여 멀티 스펙트럼 영상 획득 시스템을 구축. 도 2에 도시 된 광학 구성 요소의 배치는 차에 대해 참조 할 수있다건설 절차입니다.
   참고 : 조명 각도는 시료 표면에 대해 약 45 °입니다.
3. 할로겐 램프 광원을 켜서 간섭 필터, 광 가이드 및 수집 렌즈를 통해 시료 표면을 비 춥니 다.
4. CCD 카메라의 운영 소프트웨어를 엽니 다.

2. 동물 준비

참고 :이 프로토콜에서 쥐는 미래의 실험에 사용되지 않았으며 그것은 multispectral 이미지의 측정 직후 희생되었다.

1. 유도 챔버의 입구 포트를 마취 기계의 출구 포트에 튜브로 연결하십시오. 유도 챔버의 출구 포트를 두 번째 튜브가있는 마취 기계의 흡입 포트에 연결하십시오.
2. 쥐를 유도 챔버에 넣고 5.0 % 이소 플루 란으로 마취를 유도하십시오. 쥐가 발가락 핀치에 반응하지 않도록 깊이 마취를 유지하십시오. 엘마취 기계의 회전식 손잡이를 사용하여 2.0 % isoflurane까지 세척하십시오.
3. stereotaxic 프레임에 쥐 머리를 수정. stereotaxic 프레임에 마 취용 마우스 피스를 연결합니다.
4. 마우스 피스의 입구 포트를 마취 기계의 출구 포트에 튜브로 연결하십시오. 마우스 피스의 출구 포트를 마취 기계의 흡입구에 튜브로 연결하십시오.
5. 피부 표면이 나타날 때까지 헤어 클리퍼를 사용하여 절개 부위를 넘어 머리 부위를 면도하십시오.
6. 외과 용 메스 ( 그림 1 (a) )를 사용하여 머리의 중간 선을 따라 약 20mm 길이로 세로 절개를하고 피하 결합 조직 ( 그림 1 (b) )을 노출 시키십시오.
7. 날카로운 curette 또는 협공을 사용하여 피하 결합 조직을 제거하고 두개골 뼈 ( 그림 1 (c) )를 노출하기 위해 머리의 양쪽으로 당겨.
8. 두개골 sutur 안에 두개골 뼈에 타원 도랑을 파다.es (coronal suture, sagittal suture, lambdoid 봉합사)를 사용 하였다 ( 그림 1 (d) ).
9. 고속 드릴을 사용하여 도랑 속의 두개골 뼈를 천천히 그리고 균일하게 굴착하십시오.
10. 뇌 혈관이 나타난 후 뼈의 두께와 강도를 추정하기 위해 협공의 끝으로 얇아진 두개골의 표면을 가볍게 누릅니다. 만약 얇아진 두개골 부위가 쉽게 눌려지면, 고속 드릴로 두개골 뼈의 축소를 종료하십시오.
11. 족집게 또는 작은 외과 용 가위를 사용하여 얇은 두개골 조각의 타원형 경계선을 자릅니다.
12. 협지를 사용하여 뇌 표면에서 얇은 두개골을 천천히 부드럽게 제거하십시오.
13. 생리 식염수로 두개골 창을 부드럽게 목욕하고 약 0.1mm 두께의 투명 유리판으로 덮습니다.

3. 영감을받은 산소의 분율 조절

참고 : 호흡기 상태기 영감 산소의 분율 (FIO _2)를 조절하여 변경할 수있다.

1. 튜브를 사용하여, 다른 Y 형 튜브 커넥터 (커넥터 (2))의 제 포트에 Y 형 튜브 커넥터 (커넥터 (1))의 첫 번째 포트를 연결한다.
2. 튜브 커넥터 (1)의 두 번째 포트에 마우스 피스의 입구를 연결한다.
3. 튜브를 사용하여, 산소 농도를 모니터 장치에 튜브 커넥터 (1)의 제 3 포트를 연결한다.
4. 튜브를 통해 마취 기계의 출구 포트 튜브 커넥터 (2)의 두 번째 포트를 연결한다.
5. 튜브를 사용하는 가스 혼합물을 장치의 출구 포트 튜브 커넥터 (2)의 제 3 포트를 연결한다.
6. 5 %의 튜브를 사용하여 _CO2 가스 실린더 - 고압 95 % O ₂ 가스 혼합 장치의 하나 개의 입구 포트를 연결한다.
7. 튜브를 사용하여 5 % CO ₂ 가스 실린더 - 고압 95 % N ₂ 가스 혼합물을 장치의 다른 입구 포트를 연결한다.
8. 오 가스 유량을 변경가스 혼합물을 장치에 로터리 노브를 사용하여 F의 O ₂ N _2.
9. 확인 및 산소 농도를 모니터 장치를 사용하여 _{2 FIO을} 조절한다.

멀티 스펙트럼 확산 반사율 이미지 4. 취득

1. 참조 이미지의 취득
   참고 : 같은 광원, 광학 섬유 등이 실험에 사용 된 광학 부품, 및 감지기는 자신의 스펙트럼 특성을 가지고있다. 따라서, 이들 구성 요소를 통과하는 빛의 강도가 참조 화상으로서 기록한다. 참조 화상은 광원으로부터의 광으로 조명하는 표준 화이트 확산기로 찍은 이미지이다.
   1. 수평으로 무대에 표준 흰색 확산을 넣습니다.
   2. 배럴의 줌 링을 돌려 흰색 확산 판의 표면에 카메라 렌즈를 초점을 맞 춥니 다.
   3. 로부터 적절한 값을 선택하여 카메라의 적분 시간을 조정드롭 다운 통합 시간의리스트를 카메라의 운영 소프트웨어에서 광의 최대량이 최대 카운트의 약 75 % 인 신호를 생성하도록. 화소 값의 히스토그램을 보면서 신호 강도 레벨이 최대 카운트의 약 75 %가 될 때까지 적분 시간을 조정한다.
   4. 파일에 이미지를 저장하려면 파일 메뉴에서 "저장"명령을 선택합니다.
   5. 필터 휠을 돌려 필터 위치를 변경합니다.
   6. 상술 한 방법에 따라, 다른 파장의 이미지를 저장한다. 파일 이름은 시료와 사용 파장 (예를 들어, W500, W520, W540 ... W760)를 식별해야합니다.
2. 샘플 이미지의 취득
   참고 : 구 파장에 노출 된 쥐의 뇌의 확산 반사 된 빛의 세기의 이미지 캡처와 같은 인수 조건을 사용하여 개인 컴퓨터의 하드 드라이브에 저장됩니다.
   1. 조심스럽게 연구를 배치카메라가 쥐의 뇌의 표면에 초점을 맞출 수 있도록 무대에서 천천히 무대 레벨을 조절합니다.
   2. 파일에 이미지를 저장하려면 파일 메뉴에서 "저장"명령을 선택합니다.
   3. 필터 휠을 돌려 필터 위치를 변경합니다.
   4. 상술 한 방법에 따라, 다른 파장의 이미지를 저장한다. 파일 이름은 샘플과 파장 (예를 들어, R500, R520, R540 ... R760)를 식별해야합니다.
3. 어두운 이미지의 취득
   주 : CCD 카메라는 전기 신호에 따라 광 세기를 생성 할 수있다. 그러나, 광이 검출기에 입력하지 않더라도 때문에 전기 회로와 검출기의 잡음에 약간의 출력이있다; 이 어두운 전류 잡음이라고합니다. 정확하게 광의 분광 강도를 측정하기 위해, 암전류 성분이 어두운 화상으로서 기록하고 측정 된 신호로부터 감산한다. 어두운 화상은 화상 포획이다N 개의 광로로 막았다.
   1. 할로겐 램프 광원을 끕니다.
   2. 차폐 판을 이용하여 CCD 카메라 시스템의 광 경로를 차단.
   3. 파일에 이미지를 저장하려면 파일 메뉴에서 "저장"명령을 선택합니다. 파일 이름은 샘플 (예를 들어, 다크)를 식별해야합니다.

5. 헤모글로빈 콘텐츠 및 빛 산란 매개 변수를 시각화

참고 : 다중 스펙트럼 확산 반사율 이미지의 집합은 개인용 컴퓨터의 하드 드라이브에 저장하고 오프라인으로 분석된다. 아홉 개 파장들 (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, 및 760 ㎚)에서 멀티 스펙트럼 확산 반사율 영상의 몬테카를로 시뮬레이션 ^(19)를 이용한 다중 회귀 분석은 다음 두 차원 시각화 수행 산소화 헤모글로빈 농도, 탈산 소화 헤모글로빈 농도, 총 헤모글로빈 농도 지역 뇌 산소 포화도, 및 배설물의지도전원을 tering. 자세한 알고리즘은 문헌 ^{17, 18} 년에 출판되었다.

1. 참조 화상과 각 파장에서의 샘플 화상 모두로부터 어두운 화상을 뺀다.
2. 각 파장 λ에서 기준 화상에 의한 샘플 화상을 정규화한다. 확산 반사율 화상 R로서 표준화 이미지를 처리한다.
3. 각 파장 λ에서의 확산 반사율 화상 R의 역수의 대수를 취함으로써 흡광도 (또는 광학 밀도) 영상 A를 계산한다 :
   (1)
4. y 평면 뇌 표면 얻어진 구조 정보를 표시하고, Z는시킴으로써 행한다 스펙트럼 정보를 표시 -은 X가 파장의 순서에서 흡광도 이미지를 적층하여 입체 매트릭스를 생성한다.
5. 체육각각의 XY 좌표를 흡광도 스펙트럼 A (λ)에 대한 다중 회귀 분석을 rform.
6. 단계 5.5 독립 변수와 종속 변수 _HBO (λ) ε 산소화 헤모글로빈의 몰 흡광 계수 스펙트럼 및 탈산 소화 헤모글로빈 ε의 _HBR (λ)로 흡광도 스펙트럼 A (λ)를 사용하여 _(HBO ε의 값을 문서 (λ) 및 ε _HBR (λ)의) 표 1에 제공된다.
7. 세 회귀의 2 차원지도 (화상)을 확인하는 것은 _{HBO하는 HBR} 및 _{0 계수.}
8. 순서에 _{HBO하는 HBR,} 및 _0, 회귀 계수의 이미지를 적층하여 입체 매트릭스를 생성 어디 Y 평면 뇌 표면의 Z시킴으로써 행한다 대해 얻어진 구조 정보를 나타낸다는 회귀 계수를 나타낸다.
9. 산소화 헤모글로빈 농도 C _HBO, 탈산 소화 헤모글로빈 농도 C의 _HBR, 각각 XY에서 _{HBO하는 HBR 및 0} 계수 그가 β 값 (다음의 실험식을 이용하여 좌표 회귀 세트로부터 산란 전원 (B)을 계산 _{HBO, I,} β _{HBR, I} 및 β _{0, I는} (i = 0,1,2,3)는 표 2에 제공된다) :
   (2)
   (삼)
   (4)
10. 산소화 헤모글로빈 농도 C _HBO, 탈산 소화 헤모글로빈 농도 C _HBR 및 산란 전원 (B)의 2 차원지도 (화상)을 확인한다.
11. 각 X에서 C 및 C _{HBO HBr을 합산하여} 총 헤모글로빈 농도 C의 _HBT의 2 차원지도를 계산 - y 좌표.
12. Y 좌표 - 각각 X에서 총 헤모글로빈 농도 C의 _HBT하여 산소화 헤모글로빈 농도 C _{HBO 나누어} 지역 뇌 산소 포화도 RSO _2의 2 차원지도를 계산한다.

Results

생체 래트 뇌로부터 취득한 확산 반사율의 대표적인 분광 화상 500, 520, 540, 560, 570에서도 3 이미지 표시되었으며 580 명확 대뇌 피질에서 혈관의 밀도 네트워크 시각화 nm의. 혈관 (600), (730)에서 이미지에 주변 조직 관찰, 및 760 nm의 사이의 콘트라스트의 저하는 이상과 NIR 파장의 광에 의한 헤모글로빈의 낮은 흡수를 반영한다.

도 4는 산소화 헤모글로빈 농도, 탈산 소화 헤모글로빈 농도, 총 헤모글로빈 농도 지역 뇌 산소 포화도, 산란 전력 노출 된 래트 뇌 나타내는 추정 된 이미지를 나타낸다. 도 3은 혈액 VES 총 헤모글로빈 농도 단파장에서 확산 반사율 이미지에서 예상대로SEL 영역은 주변 조직 영역보다 높다....

Discussion

이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 두개골 창을 만들 수있는 얇아 두개골 지역의 제거이다; 이 예기치 않은 출혈을 방지하기 위해주의 깊게 수행해야합니다. 이 단계는 높은 정밀도로 반사 이미지를 확산 다중 분광 높은 품질을 얻는 것이 중요하다. 실체 현미경의 사용은 수술 가능한 경우에 권장됩니다. 젤라틴 스폰지의 작은 조각 지혈하는 데 유용합니다.

이 문서에서 설명하는 광학 시스템은 광원의 정면에 위치한 간섭 필터를 통해 단색광을 통과한다. 이것은 비디오 카메라 렌즈, CCD 카메라의 앞에 필터 휠을 배치하여 변형 될 수있다. 그러나,이 경우, 두께가 다른 간섭 필터가 사용되는 경우, 초점면은 가변적 일 수 있으며, 이는 화질의 저하를 야기한다. 기록 전극이 삽입되는 경우는 두개 창 유리판을 제거 할 필요가있다이러한 로컬 전기 필드 전위의 측정과 같은 전기 생리학 측정 용 피질 조직으로. 이 경우, 이미징 시스템은 대뇌 피질의 표면으로부터 원하지 않는 경면 반사를 검출 할 수있...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
150-W 할로겐 램프 광원	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan	LA-150SAE
Light guide	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan	LGC1-5L1000
수집 렌즈	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan	SH-F16
간섭 필터 l@ 500 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#65088
간섭 필터 l@ 520 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#65093
간섭 필터 l@ 540 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#65096
간섭 필터 l@ 560 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#67766
간섭 필터 l@ 570 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#67767
간섭 필터 l@ 580 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#65646
간섭 필터 l@ 600 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#65102
간섭 필터 l@ 730 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#65115
간섭 필터 l@ 760 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#67777
전동 필터 휠	Andover Corporation, NH, 미국	FW-MOT-12.5
8비트 단색 CCD 카메라	THE IMAGINGSOURCE, 독일	DMK21BU618. H
비디오 줌 렌즈	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	VZMTM300i
Spectralon white standard with 99% diffuse reflectance	Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA	SRS-99-020