Method Article

향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

DOI:

10.3791/55406

⸱

May 1st, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

결합 전구체 동위 원소 라벨 및 동중 태그 (cPILOT)은 동중 태그의 샘플 다중화 기능을 향상 정량 프로테오믹스 전략이다. 이 프로토콜은 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 조직에 cPILOT의 응용 프로그램을 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

질병의 이해와 바이오 마커의 발견을위한 많은 생물학적 샘플을 분석하는 요구가 증가하고있다. 여러 샘플의 동시 측정이 확산되고 크게 실험 비용과 시간을 단축 한 수 정량 프로테오믹스 (proteomics) 전략. 우리 연구실은 기존의 동위 원소 표지 또는 등압 태그 방식의 샘플 멀티플렉싱을 향상 동위 원소 라벨 및 동중 태그 (cPILOT) 결합 전구체라는 기술을 개발했다. 글로벌 cPILOT은 세포, 조직, 체액, 또는 전체 유기체로부터 유래 된 샘플에 적용하고 다른 샘플 조건에 걸쳐 상대적 단백질 존재비에 대한 정보를 제공 할 수있다. cPILOT는 낮은 pH 완충액 조건을 이용하여) (1)에 의해 작동 선택적 dimethylate 펩티드 N 말단 2)) 재료 / 시약의 표를 참조 (시판 등압 시약 리신 잔기의 차 아민 라벨을 높은 pH 완충액 조건을 사용한다. 의 정도가능한 샘플 다중화 사용 전구체 레이블의 수 및 등압 태그 시약에 의존한다. 여기서는 한 번의 분석 마우스 조직에서 12 개 샘플을 분석하는 여섯 플렉스 등압 시약과 함께 광 무거운 디메틸 화를 사용하여 12 플렉스 분석을 제시한다. 향상된 다중 적은 실험 편견과 오류, 더 중요한 것은 실험 시간과 비용을 줄일 수 많은 샘플 조건 (생물 복제, 병기, 약물 치료, 유전자형, 또는 세로 시간 포인트)에서 비교를 허용하는 도움이됩니다. 본 연구에서는 글로벌 cPILOT 방법은 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 뇌, 심장, 생물 복제에서 간 조직을 분석하는 데 사용됩니다. 글로벌 cPILOT 다른 생물학적 과정을 연구에 적용되고, 20 개 이상의 샘플을 샘플 다중화를 증가하도록 구성 될 수있다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질 체학은 종종 더 나은 질병 과정을 이해하는 데 많은 샘플, 효소 반응 속도론, 번역 후 수정, 환경 자극에 대한 반응, 치료 치료, 바이오 마커 발견, 약물 메커니즘에 대한 응답의 분석을 포함한다. 정량 방법은 시료 전체 단백질 수준에서의 상대적인 차이를 측정하고 라벨없는 일 수 있거나, 동위 원소 표지 (대사, 화학적, 또는 효소)를 포함하는 이용 될 수있다. 그들은 많은 시료를 동시에 분석 할 수있게하고 다른 세포, 조직, 체액, 또는 유기체 전체 샘플에 적합하기 때문에 안정 동위체 표식 방법은 인기가 증가했다. 동위 원소 표지 방법 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 증가 실험 처리량획득 시간, 비용, 및 실험 오차를 줄일 수있다. 이러한 방법은 펩티드의 단백질 피크의 상대 존재비를 측정하는 전구체 질량 스펙트럼을 사용한다. 대조적으로, 태그 등압 시약

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

윤리 선언문 : 마우스는 독립적 인 비영리 생명 의학 연구 기관에서 구입 한 피츠버그 대학의 실험 동물 자원의 부문에 보관되었다. 모든 동물 프로토콜은 피츠버그 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

화학 태그 1. 단백질 추출 및 펩타이드 생성

  1. 조직, 세포, 또는 체액에서 단백질을 추출합니다.
    1. 기계적 균질기를 사용하여 8 M 우레아 (500 μL)를 인산 완충 식염수 조직 (예 : 뇌, 심장, 간) (1X PBS) 60-90 mg의 균질화. 필요한 경우, 프로테아제 억제제 또는 인산 버퍼에 추가 될 수있다. 이 프로젝트에서, 그들은 사용되지 않았다. 균질 대해 다음 파라미터를 사용하여 행렬 A 비드, 4m / 초, 20 초를 용균. 심장 조직을 균질화의 최대 9 사이클을 필요로 할 수있다.
      참고 : 프로테아제 또는 포스 파타 아제 억제제 필요한 경우, S가 버퍼에 추가 될 수있다. 그들은이 연구에 사용되지 않았다.
      1. 용균 튜브에서 조직 균질 액을 제거하고 마이크로 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 8 M 우레아의 PBS 100-500 μL와 튜브 용균 헹구고 조직 파쇄 액과 세정액을 결합한....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT은 N 말단 및 리신 잔기에 라벨 펩티드를 화학적으로하는 아민 계 화학 제를 사용하여 시료 다중화 기능을 향상시킨다. 그림 2는 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 뇌, 심장, 간 조직의 12 플렉스 cPILOT 분석에서 얻어진 대표 MS의 데이터를 보여줍니다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 알츠하이머 병 및 야생형 생쥐 두 생물 복제이 12 플렉스 분석에 포함되어 있습니다. 도 2a는, 펩티드에 도입 된 하나의 다이 메틸 그룹을 나타내는 4 m / z 간격에 의해 분리되는 이중 하전 피크 쌍을 나타낸다. 광이 한 쌍의 무거운 dimethylated 피크 모두 CID 독립적으로 절연 및 파편이다. dimethylated 펩티드의 각각에 대한 MS / MS 데이터를도 2b 및 C에 .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT는 12 개 이상의 독특한 샘플의 동시 측정을 허용한다. 펩티드의 N 말단 리신 잔기 모두 성공적인 태깅을 보장하기 위해, 반응의 각 세트에 대한 정확한 산도를 갖는 펩티드 및 라벨링 먼저 디메틸 화 반응을 수행하는 데 필수적이다. N- 말단에 선택적 디메틸 화는 (± 0.2) ~ 2.5의 pH를 갖는 의해 수행된다. 이것은 라이신의 아미노기의 PKA의 차이 및 N 말단을 이용함으로써 달성된다. pH가 2.5에서 라이신이 비활성 상태 (PKA ~ 10.5); pH가 약간 (즉, pH를 5-7) 산성 또는 염기성 인 경우, 상기 N 말단 및 리신 잔기 모두 dimethylated한다. 등압 태그는 낮은 pH에서 먼저 수행되는 경우뿐만 아니라, 상기 N 말단은 등압 라벨 리신 잔기 dimethylated 될 것이다. 이것은 B-이온 선택해야하는 것처럼 MS (3)에 대해 선택되는 작은 조각 될 수있다. 디메틸의 상대적 비용ATION 반응은 상업 동중 시약에 비해 저렴합니다. 하나는 1.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 더 경쟁 관심이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 RASR에 피츠버그 시동 자금의 대학과 NIH, NIGMS R01 부여 (GM 117191-01)를 인정합니다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
물 - MS 등급Fisher ScientificW6-44 L 수량이 필요하지 않습니다
아세토니트릴 - MS 등급Fisher ScientificA955-44 L 수량이 필요하지 않습니다
세트산J.T. Baker9508-01
수산화암모늄 용액 (28 - 30%)Sigma Aldrich320145-500ML
포름산 암모늄Acros 유기물208-753-9
포름산플루카 분석94318-250ML-F
BCA 단백질 분석 키트Pierce Thermo Fisher Scientific23227
UreaBiorad161-0731
TrisBiorad161-0716
Dithiothreiotol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
요오도아세트아미드 (IAMAcros Organics144-48-9
L-CysteineSigma Aldrich, 화학168149-25G
소 췌장에서 L-1-토실아미도-2 페닐에틸 콜로메틸 케톤(TPCK) 처리된 트립Sigma Aldrich, 생명 과학T1426-100MG
포름알데히드(CH2O) 용액; H2O에서 36.5 - 38%Sigma Aldrich, 생명 과학F8775-25ML
포름알데히드(13CD2O) 용액; D2O에서 20wt%, 98 원자 % D, 99 원자 % 13CSigma Aldrich, 화학596388-1G
시아노보로하이드리드나트륨; 시약 등급, 95%Sigma Aldrich156159-10G
시아노보로하이드리드나트륨; 96 원자 % D, 98% CPSigma Aldrich, 화학190020-1G
SCX(Strong Cation Exchange) 스핀 팁 시료 준비 키트Protea BioSciencesSP-155-24KIT
TEAB(Triethyl ammonium bicarbonate) 완충액Sigma Aldrich, Life ScienceT7408-100ML
등압 태깅 키트(TMT 6 plex) - 6 반응(1 x 0.8 mg)Thermo Fisher Scientific90061
하이드록실아민 하이드로클로라이드Sigma Aldrich, 화학255580-100G
표준 와류 믹서Fisher Scientific2215365모든 믹서를 사용할 수 있습니다
Oasis HLB 1cc(10mg) 추출 카트리지Waters186000383C18 카트리지
Visiprep SPE 진공 매니폴드, DL(일회용 라이너), 24포트 모델Sigma Aldrich5726512포트 모델도 충분합니다
Speed-vacThermo ScientificSPD1010모든 브랜드의 speed vac이면 충분합니다
수조 챔버Thermo Scientific2825/2826모든 브랜드의   온도가 조절된 수조 챔버로 충분합니다.
기계적 균질화기(i.e. FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosamplerSciex-이 모델은 더 이상 사용할 수 없습니다. 오토샘플러가 있는 모든 나노 LC로 충분합니다.
LTQ Orbitrap Velos 질량분석기Thermo Scientific-이 모델은 더 이상 사용할 수 없습니다. 다른 고분해능 기기(<예: Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion 또는 Orbitrap Fusion Lumos)>em)을 사용할 수 있습니다.
단백질 소프트웨어 (예: Proteome Discoverer)Thermo ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH 
분석 저울Mettler ToledoAL54
교반 플레이트VWR12365-382모든 브랜드의 교반 플레이트가 충분합니다
pH 측정기 (Tris 호환 가능)Fisher Scientific (Accumet)13-620-183모든 브랜드의 pH 측정기가 충분합니다
pH 10 버퍼Fisher Scientific06-664-261pH 버퍼 10의 모든 브랜드가 충분한
pH 7입니다. 완충Fisher Scientific06-664-260모든 브랜드의 pH 완충액 7이면 충분합니다
1.5 mL 에펜도르프 튜브, 500 pkFisher Scientific05-408-129모든 브랜드의 1.5 mL 에펜도르프 튜브는 충분합니다
0.6 mL 에펜도르프 튜브, 500 pkFisher Scientific04-408-1200.6 mL 에펜도르프 튜브의 모든 브랜드는
충분합니다 0.65 &마이크로; m Ultrafree MC DV 원심 필터 장치EMD MilliporeUFC30DV00
2 mL 마이크로 원심분리기 튜브, 72 장치Thermo Scientific69720
C18 포장재 (5  &마이크로; m, 100 Å)브루커PM5/61100/000이 아이템은 더 이상 브루커에서 구매할 수 없습니다. 나열된 사양의 대체 포장재는 충분한
C18 포장재(5  &마이크로; m, 200 Å)브루커PM5/61200/000이 아이템은 더 이상 브루커에서 구매할 수 없습니다. 나열된 사양의 대체 포장재로 충분합니다.
아신 , , . . 액

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

cPILOTIsobaric TaggingDimethylation LabelingSample MultiplexingProteomics AnalysisTissue HomogenizationStrong Cation ExchangeMass SpectrometryAlzheimer Disease ModelBiological Replicates

Related Articles