Method Article

열 및 레이어에 수지상 형태학 분석

DOI:

10.3791/55410

⸱

March 23rd, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Section on Neuronal Connectivity, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (NIH), 2Mathematical and Statistical Computing Laboratory, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH), 3Biomedical Imaging Research Services Section, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리는 열 및 레이어 초파리 수질 신경 세포의 수지상 라우팅을 분석하는 방법을 보여줍니다. 워크 플로우는 추적 기준 열 배열 수지상 아버를 등록하기위한 3 차원 공간에서 수지상 구조를 분석하기위한 이미지 품질과 연산 툴을 개선하기 위해 이중 - 뷰 영상 법을 포함한다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이러한 플라이 눈 돌출부와 척추 피질과 같은 중추 신경계의 여러 영역에서 시냅스 회로 개발 동물 개발 및 정보 처리 동안 뇌 배선을 용이하게하는 층과 열이 구성되어있다. 특정 레이어 유형 특정 패턴의 정교한 수상 돌기 시냅스 후 뉴런은 적절한 시냅스 터미널 시냅스합니다. 플라이 수질의 neuropil 10 층과 약 750 컬럼으로 구성되어; 각 열은 유형 특정 방식으로 구 심성의 일부 7 종류의 축삭 단자와 일치 수질 뉴런의 38 이상 종류의 수상 돌기에 의해 신경 지배된다. 이 보고서는 이미지의 절차를 자세히 설명하고 수질 뉴런의 수상 돌기를 분석 할 수 있습니다. 워크 플로우는 세 부분으로 포함한다 : (I) 듀얼 뷰 촬상 부는 돌기 고해상도 3D 이미지에 직교하는 방향에서 수집 개의 공 초점 화상 스택을 결합하는 단계; (ⅱ) 수상 돌기는 추적 및 등록 섹션은 수지상를 추적3D의 아버와 기준 열 배열 수지상 트레이스 레지스터; (ⅲ) 수지상 분석 부는 수지상 정자 층 특정 종단 및 평면 투영 방향을 포함하여 열 및 층에 대하여 돌기 패턴을 분석하고, 수지상 분지와 종단의 주파수 추정치를 유도한다. 프로토콜은 매트릭스 실험실 언어의 오픈 소스 MIPAV (의료 영상 처리, 분석 및 시각화) 플랫폼 및 사용자 정의 도구 상자에 내장 된 사용자 정의 플러그인을 사용한다. 함께, 이러한 프로토콜은 세포 유형을 확인하고, 돌연변이 체의 결함을 결정하기 위해, 레이어 및 열들 초파리 수질 뉴런의 수지상 경로를 분석하는 전체 워크 플로우를 제공한다.

Introduction

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개발하는 동안, 복잡하지만 틀에 박힌 분기 패턴에 신경 정교한 수상 돌기들은 시냅스 파트너와 시냅스를 형성한다. 수지상 분기 패턴은 신경 정체성과 기능의 상관 관계. 수지상 복잡성 및 필드 크기는 입력 된 숫자를 관리하면서 수지상 분지 아버의 위치는, 그들이받는 시냅스 입력의 종류를 결정한다. 따라서, 수지상 형태 학적 특성은 시냅스 연결 및 신경 계산을위한 중요한 결정이다. 이러한 비행 광학 로브와 척추 동물의 망막과 같은 복잡한 뇌의 많은 지역에서 시냅스 회로는 정보 처리 (1), (2)를 용이하게하기 위해 열과 층으로 구성되어 있습니다. 이러한 열과 층 조직에서는 뚜렷한 양상 프로젝트 축삭의 시냅스 전 뉴런 특정 층 (소위 계층 특정 타겟팅)에서 종료하고 규칙적인 2 차원 배열을 형성하는 (소위 칼레D 지형도), 시냅스 후 뉴런이 특정 계층에 적절한 크기의 돌기를 확장하면서 정확한 종류와 숫자의 시냅스 입력을받을 수 있습니다. 층 및 컬럼에 타겟팅 축삭 잘 3,4-를 연구 하였지만, 훨씬는 덴 드라이트가 특정 계층에 전달하고 올바른 연접 파트너 ....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

주 : 듀얼 뷰 영상 (섹션 1-3), 수지상 추적 및 등록 (섹션 4-6)와 수지상 분석 (섹션 7-9) (그림 1) : 프로토콜은 세 개의 섹션이 포함되어 있습니다. 코드 및 예제 파일은 재료 / 장비의 표에 나와 있습니다.

1. 듀얼 이미지 획득

참고 :이 단계는 두 개의 직교 (수평 및 정면) 방향에 관심있는 신경 세포의 두 이미지 스택을 취득하도록 설계되었습니다.

  1. 띄엄 띄엄 수질 신경 세포를 표지 포함 플라이 두뇌를 준비합니다 (~ 10 셀 / 뇌 엽) 막 GFP 마커 (mCD8GFP)와 같은 이전 12 설명했다. 전술 한 바와 같이, (골수 신경 세포의 수상 돌기에 대한) 토끼 방지 GFP 및 (광 수용체 축삭의 경우) 마우스 mAb24B10, 일차 항체, 형광 이차 항체 (알렉사 488 안티 - 토끼와 알렉사 568 항 마우스 항체)와 뇌를 얼룩13. 1X PBS에 70 % 글리세롤의 뇌를 취소합니다.
  2. 수평 방향으로 뇌 마운트 (도 2A를, B), 슬라이드의 중심에 antifade 설치 매체의 20 μL 드....

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Results

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여기에 제시된 듀얼 뷰 촬상 절차를 이용하여, 성기 표지 Tm20 뉴런을 포함하는 플라이 뇌 개의 직교 방향에 묘화 하였다. 촬상에 앞서, 뇌 막 닿는 GFP와 감광체 축삭 시각화 적절한 일차 및 이차 항체로 염색 하였다. 이미징 뇌 먼저 가로 방향으로 장착 하였다 (도 2A, B). GFP 표지 Tm20 신경 및 주변 감광 축삭은 공 초점 레이저 주사 현미경 (도 3a)을 사용하여 영상화 하였다. 뇌는 (그림 2A, B)을 다시 정렬하고, 같은 Tm20 신경 세포는 정면 방향 (그림 3B)에서 다시 이미지화했다. 이미징 프로세스 동안 Tm20 뉴런의 위치는 오른쪽 수질 neuropil (RV 구성)의 복부 절반 인 것이 확인되었다. 이들 두 개의 화상은 스택 화상 컨벌루션 소프트웨어 및 REC를 사용 하였다 deconvolved재조합 화상 스택 <.......

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Discussion

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여기, 우리는 어떻게 이미지에와 초파리 수질 뉴런의 수상 돌기 아버 분석을 보여줍니다. 첫번째 섹션 듀얼 뷰 영상은 고해상도 영상 스택에 디컨 볼 루션 두 화상 스택의 조합을 설명한다. 두 번째 섹션, 수지상 추적 및 등록 기준 열 배열에 수질 뉴런의 수상 돌기의 추적 및 등록에 대해 설명합니다. 세 번째 섹션, 수지상 분석, 수지상 패턴을 분석하는 사용자 정의 스크립트의 사용을 설명합니다. 함께 이러한 프로토콜 층 및 컬럼에 대해 돌기 패턴에 대한 정보를 추출하고 수지상 분지 종료하는 주파수를 결정하기 위해 전체 워크 플로우를 제공한다.

여기에 제시된 듀얼 뷰 촬상 방법은 두 개 이상의 이미지 스택 직교 높은 축 resolutio을 달성하기 위해 재결합 수거 된 광 시트 현미경으로 구현 된 멀티 뷰 영상 기술, 개념적으로 유사하다N 17, 18. 그러나,.......

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Disclosures

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저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다, 아동 건강 및 인간 개발 (C.-HL에 부여 HD008913)의 유니스 케네디 슈라이버 국립 연구소, 정보 기술 센터 (PGM, NP, ESM 및 MM).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
Huygens ProfessionalScientific Volume Imaging버전 16.05이미지 디콘볼루션(https://svi.nl). 
이미지 재조합 및 등록(http://mipav.cit.nih.gov/)을 위한MIPAV버전 7.3.0
MIPAV 플러그인: PlugInDrosophila
RetinalRegistration.class		프리웨어
MIPAV 플러그인: PlugInDrosophilaStandard
ColumnRegistration.class		프리웨어
ImarisBitplane돌기 추적 및 이미지 등록 (http://www.bitplane.com)을 위한 참조 포인트 할당; swc
Vaa3D( https://github.com/Vaa3D/release/releases/);
수상돌기의 형태 분석을 위한MatlabMathworksR2014b
Matlab 도구 상자: 수지상 형태 매개변수 분석을 위한 TREES1.14v1.14(http://www.treestoolbox.org/download.html); 프리웨어
Matlab 도구 상자: Dendritic_Tree_Toolboxv1.0형태 측정 매개 변수 (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration)를 계산합니다. 프리웨어
NameCompany카탈로그 번호Comments
Sample files
SWC file definitionhttp://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
이미지 조합 및 정합https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
참조 포인트 예제 https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=
1471880596000&api=v2
NameCompany카탈로그 번호Comments
Computer system
MS Windows Windows 7 x64 또는 Macintosh OS X 10.7 이상3GHz 64비트 쿼드 코어 프로세서, 16G RAM(최소)
옵션: Quadro4000  (또는 그 이상) 수상돌기의 입체 시각화를 위한그래픽 카드 Nvidia
옵션: NVIDIA 3D vision2Nvidiahttp://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
옵션: NVIDIA 3D vision2http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html<
strong>NameCompany>카탈로그 번호코멘트
용 strong>시약
24B10 항체The Developmental Studies Hybridoma Bank24B10
GFP Tag 항체Thermofisher ScientificG10362
Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488Thermofisher ScientificA11034
Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568Thermofisher ScientificA21124
VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 미디엄벡터 연구소H-1000
마운팅  점토 FisherS04179
70% 글리세롤이 1x PBS
커버 안경에 포함되어 있음, 고성능, D = 0.17  mm자이스474030-9000-000
상용 소프트웨어; 프리웨어 신경 파일 시각화를 위한 상용 소프트웨어프리웨어(http://www.mathworks.com); 상용 소프트웨어을 위한 코드 및 샘플 파일 .용 120Hz LCD 디스플레이

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaas, J. H. Topographic maps are fundamental to sensory processing. Brain Res Bull. 44 (2), 107-112 (1997).
  2. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66 (1), 15-36 (2010).
  3. Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H.....

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Dendritic Morphology AnalysisConfocal Image StacksDual View ImagingDendrite Tracing RegistrationLayer Specific TerminationPlanar Projection DirectionDendritic Branching FrequenciesMIPAV PlatformMATLAB ToolboxesDrosophila Medulla Neurons

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