방법 논문

마이크로 유체 장치를 사용하면 단일 신진 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는

DOI:

10.3791/55412

⸱

2017년 3월 30일

 ,  ,  ,  , 
1The State Key Laboratory for Artificial Microstructures and Mesoscopic Physics, School of Physics, Peking University, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences at Center for Quantitative Biology, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University

이 논문에서

요약

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이 문서에서는 마이크로 유체 칩의 생산과 수명 및 단일 효모 세포의 세포 표현형을 측정하는 미세 유체 실험의 설정에 최적화 된 프로토콜을 제공한다.

초록

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싹트는 효모 Saccharomyces cerevisiae는 노화 연구에서 중요한 모델 유기체입니다. 유전학 연구는 여러 종에 걸쳐 수명에 보존된 효과를 가진 많은 유전자를 밝혀냈습니다. 그러나 노화와 죽음의 분자적 원인은 여전히 파악하기 어렵습니다. 효모 노화의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 체계적인 이해를 얻기 위해서는 수명을 측정하고 단일 세포에서 다양한 세포 및 분자 표현형을 정량화할 수 있는 고처리량 방법이 필요합니다. 이전에는 신생아 딸 세포를 씻어내는 동시에 수명 동안 싹이 트는 효모 모세포를 추적하는 미세유체 장치를 개발했습니다. 이 기사에서는 미세유체 칩을 준비하고 미세유체 실험을 설정하는 방법을 제시합니다. 여러 채널을 사용하여 서로 다른 조건 또는 다른 효모 균주에서 세포를 동시에 추적할 수 있습니다. 일반적인 설정은 채널당 수백 개의 세포를 추적할 수 있으며 세포의 수명 전반에 걸쳐 고해상도 현미경 이미징을 가능하게 합니다. 우리의 방법은 또한 단일 세포의 수명, 분자 마커, 세포 형태 및 세포주기 역학에 대한 상세한 특성화를 가능하게 합니다. 또한 당사의 미세유체 장치는 다운스트림 이미지 분석으로 식별할 수 있는 상당한 양의 신선한 모세포를 포착할 수 있어 더 높은 정확도로 수명을 측정할 수 있습니다.

서론

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효모 신진 것은 노화 연구에서 강력한 모델 생물이다. 그러나 효모에서 기존의 수명 분석뿐만 아니라 노동 집약적뿐만 아니라 낮은 처리량 1, 2 인 미세 절제에 의존한다. 그들은 나이 또한, 기존의 미세 절제 방식은 하나의 어머니 세포에서 다양한 세포 및 분자 기능의 상세보기를 제공하지 않습니다. 미세 유체 장치의 개발은 효모 수명을 측정 할뿐만 아니라, 마더 셀 3, 4, 5, 6, 7, 8의 수명에 걸쳐 분자 마커 및 다양한 세포 표현형을 수행하는 자동화 된 방법을 사용할 수있다. 효모 세포는 미세 유동 장치에로드 된 후, 이들은 자동 시간 바퀴를 사용하여 현미경으로 추적 될 수있다전자 영상. 프로세싱 툴을 묘화의 도움으로, 다양한 세포 및 분자 표현형은 3 추출 할 수있다....

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프로토콜

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1. 실리콘 웨이퍼 금형 제작

참고 : 포토 마스크 AutoCAD 소프트웨어 설계 및 상업 회사에 의해 제조된다. 이 디자인은 다른 패턴 (세 층을 포함 보충 파일 1 ). 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 층의 높이가 각각 약 4 ㎛의 10㎛, 및 50㎛의이다. 실리콘 웨이퍼 몰드 소프트 리소그래피 9, 10을 이용하여 포토 마스크에서 만들어졌다.

  1. 10 분 수증기를 증발시켜 200 ℃에서 실리콘 웨이퍼를 구워. 스핀 코팅 네가티브 포토 레지스트 SU-8을 실리콘 웨이퍼 상.
    참고 : 스핀 코트 SU-8 3005 (30)의 첫 번째 레이어를 생성하기 위해 5,000 rpm에서, SU-8 2010 년 3,000 rpm에서 30 초는 두 번째 레이어를 생성하기 위해, 그리고 SU-8 3025 2000 rpm에서 30 초는을 생성하는 셋째 층.
  2. t 전에 코팅 된 웨이퍼를 소프트 베이크패턴 전사를 그. 정렬하고, 마스크 얼 라이너를 사용하는 "직접 접촉"모드....

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결과

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실험 후, 균체 많은 세포와 분자 표현형의 수명은 녹화 시간 경과 화상으로부터 추출 할 수있다. 각 셀로부터 추출 될 수있는 다른 다양한 기능이 있기 때문에, 분석의 제 1 단계는, 위치 및 셀 경계 추적되고 각종 이벤트의 타이밍을 포함하는 세포 및 이벤트를 주석 등이다 신진 이벤트와 같은. 이러한 주석은 쉽게 미래에 다양한 기능을 세포의 동일한 세트로 복귀하고 분석 할 수 있도록합니다. 이러한 ImageJ에 (11) 및 연관된 플러그인으로, 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여, 표현형의리스트는 셀의 기록 통계를 이용하여 이미지 데이터로부터 추출 될 수있다.

상기 미세 유체 소자로 측정 표현형의 몇몇 예이다. 효모의 수명 표현형각각의 포획 된 모세포에 의해 생성 된 싹의 수를 카운트하고 카플란 - 마이어 추정기로 추정하.......

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토론

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PDMS의 장치는 갓해야합니다. 그렇지 않으면, 장치에 관을 삽입함으로써 발생되는 기포를 제거하는 것이 어려울 것이다. 단계 3.4 세포를 집중하여 셀 로딩 효율을 개선하는 것이 중요하다. 실험의 처리량을 증가시키기 위해 동일한 PDMS 칩 4~6 모듈을 독립적으로 작동하는 펌프는 전형적으로 동시에 4~6 다른 실험 (상이한 균주 또는 미디어 조성물)을 수행하는 데 사용하기 위해 연결된다.

(미세 절제를 사용하여) 종래 효모 복제 성 노화 시험에 비해, 여기에서 제시된 방법은 마이크로 유체 이하 힘들고 시간 소모적이다. 또한, 상기 미세 유동 장치는 세포 크기, 세포주기 역학, 세포 형태, 다양한 분자량 마커를 포함하는 다양한 셀룰러 또는 분자 파라미터의 상세한 정량을 허용한다. 이 마이크로 유체 방법은 유지하여 고해상도 현미경으로 추적 장기 세포를 달성딸 세포로 PDMS 마이크로 패드에서 어머니 세포는 자동으로 플러시됩니다.

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 NIH Grant AG043080와 중국 국립 자연 과학 재단(NSFC), No. 11434001의 지원을 받았습니다. 원고를 교정해 준 루카스 발트버거(Lucas Waldburger)에게 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3 ''< 111> 실리콘 웨이퍼Addison Engineering
SU-8 2000 및 3000 시리즈MicroChem
Sylgard® reg; 184 실리콘 엘라스토머 키트ellsworth2065622Sylgard ® 실리콘 엘라스토머 베이스 및 경화제
포함 페트리 접시VWR391-1502
Harris Uni-core™ 펀치 (I.D. 0.75 mm)Sigma-Aldrich
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® 커버 글라스Thermo Fisher Scientific102440
3M 스카치 테이프ULINES-10223
VWR® 면도날VWR55411-050
순수 에탄올, KoptecVWR64-17-5
후시-더스터&트레이드;VWR16650-027
5 mL BD 주사기 (Luer-Lock™ 팁)Becton, Dickinson and Company309646
PTFE 표준 벽 튜빙 (100 ft, AWG 크기: 22, 공칭 ID: 0.028)Component Supply CompanySWTT-22
바늘 구색Component Supply CompanyNEKIT-1
DesiccatorHACH2238300
Lab OvenFisher Scientific13246516GAQ
40X 및 60X 대물렌즈가 있는 Nikon TE2000 현미경 40XNikon
Zeiss Axio Observer Z1Zeiss
주사기 펌프LongerpumpTS-1B
29002513 및 60X 대물렌즈가 있는

참고문헌

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  1. Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
  2. Polymenis, M., Kennedy, B. K. Cell biology: High-tech yeast ageing. Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).
  3. Xie, Z., et al.

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재인쇄 및 허가

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Microfluidic DeviceYeast LifespanBudding YeastCell LoadingMicroscope ImagingPDMS ChipFlow RateYeast SampleImage AnalysisCellular Phenotypes

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