여기서는 토닉과 효소 결합 된 미세 배열 (MEA)를 사용하여 생체 내 세포 외 글루타메이트 phasic 변화를 측정하는 공간적 및 시간적 정확한 방법에 대한 설치 소프트웨어 탐색 및 데이터 분석을 기술한다.
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방법 논문
효소 기반의 바이오 센서를 사용하면 알츠하이머 병 마우스 모델에서 토닉과 Phasic이 품목을 측정하는
이 논문에서
요약
초록
신경 전달 물질 중단은 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 우울증, 불안의 기초가되는 병리의 역할을 주로 중추 신경계 (CNS) 질환의 주요 구성 요소입니다. 전통적으로, 미세 투석은이 질환에서 발생하는 신경 전달 물질의 변화를 검사하는 가장 일반적인 (찬양) 기술하고있다. 미세 투석은 조직의 넓은 영역에 걸쳐 천천히 1-20분 변화를 측정 할 수있는 능력을 가지고 있기 때문에, 그것은 잠재적으로 뇌와 느린 샘플링 기능 내에서 고유 연결을 파괴, 침입의 단점이있다. 비교적 새로운 기술은 미세 전극 배열 (MEA)가 그들이 발생하는 공간적 및 시간적 정확한 접근하게 이산 뇌 영역 내의 특정한 신경 전달 물질의 변화를 측정하기위한 많은 장점을 갖는다. 또한, MEA의를 사용하여 생체 내에서 신경 전달 물질의 변화의 측정을 허용 최소 침습적이다. 저희 연구실에서는, 우리는 헥타르알츠하이머 병의 병리와 관련된 신경 전달 물질 인 글루타메이트의 변화에 특별히 관심을했습니다. 따라서, 여기에 설명 된 방법은 알츠하이머 병의 유전자 변형 마우스 모델에서의 글루타메이트의 잠재적 인 해마 중단을 평가하기 위해 사용되었다. 간단히, 방법은 관심과 배경 잡음 및 간섭 물질을 뺄 자체 참조 사이트를 사용하는 신경 전달 물질에 매우 선택적 효소와 다중 사이트 미세 전극을 코팅 포함 사용. 도금 및 교정 한 후, MEA는 마이크로 피펫으로 구성 될 수 있고, 정위 장치를 이용하여 관심있는 뇌 영역으로 낮췄다. 여기서, 상기 방법은 RTG (TauP301L) 4510 마우스를 마취하고 정확하게 해마의 서브 영역 (DG, CA1 및 CA3)를 대상으로하는 정위 장치를 사용하는 것 설명.
서론
뇌의 신경 전달 물질의 변화를 측정하는 것은 종종 신경 전달 물질 조절 곤란을 특징으로 중추 신경계 (CNS) 질환을 연구 신경 과학자을위한 필수적인 도구입니다. 고압 액체 크로마토 그래피 (HPLC / EC)와 함께 미세 투석은 세포의 신경 전달 물질의 레벨 1, 2의 변화를 측정하기 위해 가장 널리 사용되는 방법 하였지만 3, 4, 미세 투석 프로브의 공간 및 시간 해상도는 신경 전달에 적합하지 않을 수도 이러한 단단히 외 공간 (5, 6)에 규정되는 글루타메이트 등. 때문에 유전 촬상 최근의 진보, 생체 내에서의 글루타메이트를 매핑하는 데 사용할 수있는 추가의 방법이있다. 유 전적으로 인코딩 된 글루타메이트 형광성 리포터를 사용하여 (iGluSnFR)를D 이광자 촬상 연구자들은 시험 관내 및 생체 7,
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프로토콜
1. 효소 또는 매트릭스 층과 미세 전극 배열을 코팅
- 단백질 기질 용액을 제조
- 소 혈청 알부민 (BSA) 10 ㎎을 칭량하여 1.5 mL로의 마이크로 원심 튜브로 옮긴다.
- BSA를 포함하는 microcentrifuge 관에 DI 물 985 μL를 추가합니다. (BSA에 용해 될 때까지 1000 μL 피펫 ~ 3 회 피펫 팅하여 재) 수동 교반 용액을 혼합한다.
참고 : 용액에 공기를 도입 할 수있다 이렇게 같은 솔루션을 혼합하는 소용돌이를 사용하지 마십시오. 또한, 기포를 도입하는 것을 방지하기 위해 양 <1000 μL (예를 들어, 700 μL)에 피펫을 설정. 필요한 경우, 용액을 미세 원심 분리에 배치 될 수있다. - BSA에 용액이 용해되면, 25 % 글루 타르 알데히드 용액 5 μL를 추가한다. 5 번 - 밀폐 튜브 3을 반전시켜 용액을 혼합한다. 생성 된 용액을 0.125 % 글루 타르 알데히드로 1 % BSA이다.
- 단백질 매트릭스 SOLU을 따로5 분 기. 이 솔루션은 색상에 밝은 노란색으로 표시됩니다.
- 원하는 효소 용액을 제조하는 (예를 들어, 글루타메이트 산화 효소)....
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결과
이 기술은 같은 외상성 뇌 손상, 노화, 스트레스, 그리고 간질 동물 모델의 많은 종류의 신호 글루타메이트의 변화를 측정 할 수 있지만, 여기에 우리는 MEA 기술은 유전자 변형 마우스 모델에서 글루타메이트의 변화를 검사하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다 인간 타우 병증 (19), (20). RTG를 (TauP301L)는 4510 마우스 염색체 17에 연결 측두엽 치매 및 파킨슨 병에 관련된 타우에서 P301L 돌연변이를 표현하고, 일반적으로 알츠하이머 병, 퇴행성 신경 퇴행성 신경과 측두엽 치매와 관련된 타우 병리학을 연구하는 데 사용됩니다. 우리는 또한 글루타메이트 신호는 약리 개입에 의해 수정 될 수 있음을 보여줍니다. 우리는 릴루 졸과 TauP301L 마우스를 처리, 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)에 대한 FDA의 승인을 질병 변경 약물의 안정화에 의.......
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토론
MEA를 기술은 시험 관내 및 생체 내에서 신경 전달 물질 방출 및 흡수 빠른 반응 속도의 측정을 허용한다. 따라서, 기술 토닉 신경 전달 물질의 농도를 포함하는 데이터 출력 유발 신경 전달 물질 방출, 및 신경 전달 물질 간극 다양한 생산한다. MEA의 사용이 상대적으로 복잡한 과정이기 때문에, 성공적인 사용을 위해 최적화 될 필요가있다 수많은 요인이있다. 예를 들어, 교정 중에 하나에는 신호 파형 (동경 스크린) 또는 자극에 대한 반응이 최소, 또는 부재 있음이 없는지주의있다. 가능성 시스템 레코딩 시스템을 다시 시작 오작동, 또는 컴퓨터로 인해이 문제를 해결할 수 있습니다. 또한, 문제는 연결 오류 일 수 있습니다. 교정하기 전에, MEA 및 기준 전극 연결부가 적절히 연결되어 있는지 다시 확인과 관련된 것이다. headstage에 DIP 소켓의 교체는 MEA 연결 문제를 해결할 수 있습니다.접합체 용액이 완전히 없거나 불완전 유지 기준 전극을 사용하는 경우, 이들은 또한 .......
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공개 사항
GG는이 연구에서 글루탐산 측정에 사용되는 FAST-16 기록 시스템을 만드는 Quanteon, LLC의 유일한 소유자입니다. JEQ는 Quanteon에 대한 유료 컨설턴트이다.
감사의 글
(; U54GM104942 MNR), NIA (MNR, R15AG045812), 알츠하이머 협회 (MNR, NIRG-12-242187), WVU 교수 연구 상원 그랜트 (MNR) 및 WVU PSCOR 보조금이 작품은 국립 일반 의학 연구소에 의해 지원되었다 (MNR).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| FAST-16mkIII-8 채널 | Quanteon | 16mkIII | |
| 미세 전극 어레이 | CenMet | W4 또는 8-TRK | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | 시그마-알드리치 | A-3059 | 10g(1개월 후 유효기간) |
| 글루타르알데히드 | 시그마-알드리치 | G-6257 | 100mL(6개월 후 만료) |
| 글루타메이트 산화효소 | US Biological 또는 시그마 알드리치 | G4001-01 또는 100646 | 50 UI (6개월 후 만료) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #80383 | 2 주사기 |
| 메탄올 | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Battery-powered Magnetic 교반 플레이트 | Cole-parmer | EW-04804-01 | 다른 공급 업체에서 구매 가능 |
| 글루타메이트 | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100g |
| 아스코르브산 | TCI | 50-81-7 | 500g |
| 도파민 염산염 | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5g |
| 과염소산 | VWR UN2920 | 500mL | |
| 염화포스타슘 | VWR | 7447-40-7 | 1kg |
| 염화나트륨 | VWR | 7647-40-7 | 1kg |
| 염화칼슘 | MP | 153502 | 100g |
| 수산화나트륨 | BDH | 1310732 | 500g |
| 유리 압력 배출 피펫 | CenMet | ||
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참고문헌
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Cavus, I., et al.
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