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방법 논문

높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기

7.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55453

⸱

2017년 3월 24일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham

이 논문에서

요약

차세대 항결핵 약물을 위한 초기 약물 개발 과정을 개선할 수 있는 새로운 모델과 분석이 매우 바람직합니다. 여기에서는 고처리량 스크리닝에 쉽게 적용할 수 있는 결핵균에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 빠르고 저렴한 BSL-2 호환 분석에 대해 설명합니다.

초록

항결핵제의 초기 약물 개발 과정은 체외 활성을 가진 화합물이 임상 환경에서 효과로 비효율적으로 번역됨에 따라 방해를 받고 있습니다. 이는 감염된 숙주에 존재하는 생리학적으로 관련된 세포 침투 장벽에 대한 고려가 부족하기 때문일 수 있습니다. 최근에는 조밀하게 밀집된 결핵(Mtb)을 핵심으로 하는 대형 대식세포 응집 구조를 생성하는 대체 감염 모델을 확립했으며, 이는 약물 감수성 검사에 적합합니다. 이 감염 모델은 저렴하고 빠르며 가장 중요한 것은 BSL-2와 호환됩니다. 여기에서는 약물 감수성 검사를 위해 대식세포 계대 Mtb를 생성하는 Mtb/대식세포 응집체 구조를 생성하는 실험 절차를 설명합니다. 특히, 이 감염 시스템을 96웰 플레이트 형식에 직접 적용할 수 있는 방법을 보여주며, Mtb에 대한 화합물 라이브러리 스크리닝을 위한 처리량 능력을 보여줍니다. 전반적으로 이 분석은 단순성, 비용 효율성 및 확장성으로 인해 현재 사용 가능한 Mtb 약물 발견 도구 상자에 추가할 수 있는 귀중한 제품입니다.

서론

결핵 (TB)는 40 년 1 항 결핵 화학 요법의 유용성에도 불구하고 심각한 세계 보건 위협 남아있다. 이 비 준수 (2) 환자에 이르게 여러 약물 조합을 사용하여 6 개월의 긴 치료 기간에 대한 요구에 부분적으로 기인한다. 임상 적으로 승인 된 약물의 개발에 성공 3 사실상 존재이다 최근 약제 내성 결핵의 출현은 상기 전계의 문제를 배합했다. 사실, 철저한 항 결핵 약물 개발에도 불구하고, 단 하나의 약물은 FDA가 지난 40 년 4 임상 사용이 승인되었습니다. 따라서, 항 결핵 약물의 새로운 세대는 시급히이 문제를 해결하기 위해 필요하다.

결핵 신약 개발의 핵심 문제는 임상에서 효능을 시험 관내 활성을 가진 화합물에서 성공적으로 전송의 부족이다= "외부 참조"> 5, 6, 7. 처음에, 목표 기반의 접근 방식은 전체 박테리아 세포로 번역하는 데 실패 방지 MTB 약 5,을 선별하기 위해 사용되었다. MTB 세포가 사용되는 경우에도, 그것은 종종 정확하게 생체 8,9 약물 효능을 예측할 수없는 배양액 성장 배양 물을 사용하여 수행된다. 이러한 문제가 인식되었고 MTB 잠복 또는 MTB 대 식세포를 함유하는 약물 스크리닝 분석은 성공적으로 8, 10, 11, 12을 확립하고있다. 그러나, 이들 고급 분석법 약물 비 혈관 폐 병변 발생 관통 장벽 충분한 고려를하고,하지 감염 부위의 괴사 병소이다. 과연심지어 첫번째 줄 TB 약물 리팜피신위한 차선 투여 인해 생체 조직 및 뇌척수액 (CSF)의 불충분으로 문제시 된 세포 MTB (8, 9)에 대해 효능을 감소뿐만 아니라 13 14 15 침투. 의심 할 여지없이 TB 신약 개발 노력을 향상시킬 것이다 초기 리드 개발 과정에서 계정에 이러한 매개 변수를 걸릴 것 같은, 새로운 모델과 분석으로.

이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 최근 MTB 약물 효능 검사 (16)에 대한 저렴하고 신속하고 BSL-2 호환 대안 감염 모델을 설립했다. 생리 학적으로 관련 세포 침투 장벽을 효과적으로 요약 및 대 식세포 계대를 생성 밀도가 생산 큰 식세포 집계 구조 내에서 MTB 포장이 감염 모델, 잠재 MTB를 닮은 변경된 생리 학적 상태와 MTB. 이 감염 모델로부터 유도 MTB 다른 세포 내 감염 모델과 일치하는 결과를 생성 약효를 평가하는 레사 주린 마이크로 타이 세이 (REMA)와 함께 혈중 농도에 비해 높은 CSF 농도를 달성하기 위해 공통 TB 약물의보고 능력을 잘 상관 관계 16.

여기서는 상세히 REMA를 사용 약제 감수성 테스트 식세포 계대 MTB 적합한 생산하는 MTB / 대식 세포 집합체 구조의 생성을 설명한다. 특히,이 감염 시스템을 후보 항 결핵 약물의 스크리닝과의 호환성을 위해 96- 웰 포맷으로 구성 될 수있는 방법을 보여준다.

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프로토콜

참고 :이 6206는 avirulent 변형 17, 18 결핵균의 MC 바와 같이,이 프로토콜의 모든 작품은 바이오 안전성 레벨 2 시설 (BSL-2)에서 수행 할 수 있습니다.

M. 결핵 엠씨 2 표현 녹색 형광 단백질 1. 문화 조건 6206 (MTB -GFP)

참고 : M. 결핵 H37Rv는 영양 요구 균주에게 6206 엠씨 (2) 유도 (Δ panCD, Δ leuCD) 플라스미드 pMN437을 발현하는 GFP가이 프로토콜 16에서 사용되는 형질 전환. 비 GFP 연구자의 변형 쉽게 접근 가능하도록 야생형 균주를 발현과 MTB -GFP의 피로를 대체 할 수있다. 그러나, GFP 발현은 식균 작용과 MTB / 대식 세포의 응집체 형성을 육안으로 확인 가능하게하는 것이 바람직하다. 경도의 경우g의 장기 저장은, MTB -GFP 20 % 글리세롤로 보충 (단계 1.1에서 설명) 전체 7H9 미디어에서 -80 ° C에서 동결했다.

  1. 10 % 미들 OADC, 0.02 %의 틸록 사폴, 24 μg의 / mL의 D-판토텐산, 50 μg의 / ML의 L-류신 50 μg의 / mL의 하이 그로 마이신 B를 함께 7H9 매체를 보완하여 완전한 MTB -GFP 미디어 (7H9-C)를 준비
  2. MTB -GFP의 한 유리 병을 해동하고, 30 mL의 사각형 바닥이 PETG 플라스크에 7H9-C 10 mL를 추가 할 수 있습니다.
  3. 회전 진탕 (50 회전)에 37 ° C에서 품어. 광학 밀도 측정 (OD 600) 며칠마다 OD 600 1.0 (약 5-8일)에 도달 할 때까지 가져 가라.
  4. OD를 0.2 ~ 600 사이에 유지하기 위해 희석 통로 배양.
  5. 감염의 경우, 대수 성장 단계 (OD 0.6-1 600) 내에서 MTB -GFP의 확립 된 문화를 사용합니다. 큰 덩어리의 문화를 방지하기 위해 수조에 MTB 문화 플라스크를 초음파 처리 (130 W 3 × 5의 펄스) ONC전자 또는 일주일에 두 번

2. 문화 조건 THP-1 세포

  1. 10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청, 2 mM L- 글루타민 및 10 mM의 HEPES과 RPMI 1640 배지를 보충함으로써 완전한 THP-1 세포 배지 (RPMI-C)를 준비한다.
  2. 5 % CO 2의 가습 된 분위기 하에서 37 ℃에서 T-75 플라스크에서 세포를 부화.
  3. 혈구를 사용하여 세포를 계산하거나 매일 유동 세포 계측법 0.1 mL를 당 만 0.6 사이의 밀도 THP-1 세포를 유지한다.

3. 감염 프로토콜 MTB / 대 식세포 집계 구조를 생성합니다

  1. THP-1 세포의 준비 (96 웰 플레이트 당)
    1. 5 분 250 XG에 원심 분리기 7 × 10 6 THP-1 세포. 7 mL의 RPMI-C에 재현 탁.
  2. MTB -GFP 준비
    1. 원심 분리기 2.8 × 10 8 MTB -GFP 스윙 - 양동이 원심 분리기에서 3,200 XG에 5 분에서 유OD 600 1.0 = 3 × 10 8 박테리아 / mL로의 변환을 노래.
    2. 단계 3.2.1에서와 같이 RPMI-C와 원심 분리기로 한 번 씻으십시오.
    3. 10 초 7 mL의 RPMI-C에 재현 탁하고 소용돌이.
  3. 감염
    참고 : 템플릿 그림 1을 참조하십시오.
    1. 배지의 증발을 방지하기 위해 물 림 로우 A 및 H 및 칼럼 1, 12 멸균 물 200 μL를 첨가하여 96- 웰 플레이트를 준비한다.
    2. 배경 제어 (빈)에 대한 2 열 (G2에 B2) 200 μL RPMI-C를 추가합니다.
    3. 감염, THP-1 세포 현탁액 (3.1 단계)에 MTB -GFP 서스펜션 (단계 3.2)을 추가하고 피펫으로 잘 섞는다. 최종 THP-1 세포 밀도는 용액 당 5 × 105이고, 감염에 대응하는 다수의 40이다.
    4. 25 mL의 저수지에 THP-1 / MTB -GFP 서스펜션을 따르십시오.
    5. (G11를 통해 B3) THP-1 나머지 96 우물에 / MTB -GFP 서스펜션의 200 μL 날기 추가GA 멀티 채널 피펫.
      참고 : 여러 96 웰 플레이트로 작업하는 경우, 정기적으로 더 혼합물을 각 웰에 첨가되어 있는지 확인하기 위해 탱크에 남아있는 THP-1 / MTB 서스펜션을 재현 탁.
    6. 7-10일 5 % CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션.
    7. 천천히 (100)을 제거하여 2 일마다 미디어를 변경 μL 100 μL 멀티 채널 피펫을 사용하여 RPMI-C를 미리 예열 추가 잘 부드럽게 각각의 상단에서 미디어를 보냈다. 우물을 재현 탁하고 우물의 바닥에있는 MTB / 대 식세포 집계를 방해하지 마십시오.
    8. 시각 MTB / 대식 세포 응집체의 크기의 노트를 가지고, 매일 형광 현미경 (4-10X 목적)에 의해 우물을 검사합니다. 하루에 7-10으로 MTB / 대 식세포 집계가 충분히 커야한다 약효 시험 (제 4 절) 동안 진행 (참조 그림 2 참조).
    9. 원하는 경우, 자동 세포 이미징 시스템을 이용하여 96 웰 캡처 이미지 끼워밝은 필드와 GFP 필터 MTB / 대 식세포 골재 형성을 문서로 설정합니다.
      주 : 사용자가 자동화 된 이미징 시스템에 대한 액세스 권한이없는 경우, 대표적인 웰 GFP 이미지 및 시야 기능을 가진 임의의 적당한 현미경을 사용하여 측정 할 수있다.

4. 성장 억제 분석은 MTB / 대 식세포 집계에서 파생 의약품 효능에 대해 MTB 평가하기

  1. 약물 준비 (두 약물에 대한 세중의 조건)
    참고 : 템플릿도 1a를 참조하십시오.
    1. 별도의 96 웰 플레이트에서 G10까지 B2에 7H9-C 미디어의 125 μL를 추가합니다.
    2. 단계 4.2.4의 희석을 고려하여 7H9-C의 1 mL에 이중 가장 원하는 최종 농도에서 두 약물을 준비합니다.
    3. 세중 트리트먼트 각각 우물에 B11-C11-D11와 E11-F11-G11 각 약물의 250 μL를 추가합니다.
    4. 멀티 채널 피펫을 사용하여 직렬 DILUTE 시험 약물 B10-G10에 B11-G11에서 125 μL를 이동하여 두 가지. 각 단계에서 5 회 피펫 팅하여 섞는다.
    5. 플레이트에서 (오른쪽에서 왼쪽) 열에 열에서 125 μL를 이동하고, 열 4 후 중지를 계속합니다.
    6. 4 열을 혼합 한 후, 폐기물 용기에 125 μL를 폐기합니다. 열 2와 3은 배경 (빈)과 긍정적 인 성장 컨트롤로 사용할 수 있도록 어떤 약물을 포함 할 수 없습니다.
      , 또는 테스트 약물 라이브러리도 1b에 템플릿을 따르 참고. 각각의 96 웰 플레이트는 단일 농도에서 58 약물을 수용 할 수있다. 이 단계 4.2.4 절반에 희석되기 때문에 이중 원하는 최종 농도를 사용하여이 약물 플레이트를 준비합니다.
  2. 약물 치료 :
    1. MTB를 포함하는 96 웰 플레이트는 대 식세포 (MTB / 대 식세포 집계) -infected 검색합니다.
    2. 조심 멀티 채널 피펫과 관련된 모든 웰 (G11 내지 B2)을 디 캔트.두 단계의 방법이 수행 첫번째 플레이트 기울임없이 150 μL를 제거하고 플레이트를 기울 웰의 저부 에지에 피펫 팁을 삽입하여 나머지 미디어 (~ 50 μL)을 제거한다. 대 식세포 MTB / 집계가 잘 바닥에 부착 한, 어떤 자료가 손실 될 수 없습니다.
    3. 조심스럽게 MTB / 대식 세포 집합체를 포함하는 판의 모든 관련 우물 (G11를 통해 B2)에 7H9-C 미디어의 100 μL를 추가합니다.
    4. 멀티 채널 피펫을 사용하여 감염 판의 대응 웰에 96 웰 플레이트 (단계 4.1)을 함유하는 약물의 100 μL 옮긴다.
    5. 밀폐 된 가방에 넣어 37 ℃에서 3 일간 배양한다.

레사 주린 미세 적정 분석을 사용하여 정량 약물 효능의 (5)

  1. 0.8 mg의 최종 농도 원액 레사 주린 준비 / ㎖가 H 2 O.은 멸균 0.22 ㎛의 공극 크기의 PVDF 막 필터를 통해.
  2. 1 : 1 비율의 2 레사 주린 원액, H 2 O 및 트윈 80 (H 2 O 20 % 용액)을 혼합하여 용액을 준비 작업 레사 주린. 최종 농도가 0.4 ㎎ / ㎖ 레사 주린의 5 % 트윈 80이다.
  3. 플레이트 판독기 설치 530 nm의 여기 및 590 nm의 발광 37 ° C에서 24 시간 동안 매 30 분에서 형광을 판독 할 수있는 프로그램을 사용. 37 ° C까지 사전 따뜻한 플레이트 리더.
  4. 멀티 채널 피펫을 사용하여 약물 치료 플레이트 (단계 4.11)의 모든 관련 우물 (G11를 통해 B2)에 레사 주린 작업 용액 20 μL를 추가합니다.
  5. 플레이트 리더에 접시를 놓고 단계 5.3에서 설정 프로그램을 시작합니다.
    주 : 분석 플레이트의 대량의 처리를 용이하게하기 위해, 37 ° C의 배양기에서 분석을 개발하고 단일 형광 24 시간마다 판독을 수행하기에 충분하다. 이것은 또한 운동 기능 배양 플레이트 리더에 대한 액세스 권한이없는 사용자들에 적용 가능하다.

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결과

96 웰 플레이트 형식으로이 감염 모델을 적응의 견고성을 확인하기 위해, 우리는 여기에 그림에 주어진 템플릿에 따라 약물 우리의 96 웰에서 파생 된 MTB의 감수성 감염 리팜피신에 모델 (RIF) 및 목시 플록 사신 (MOXI를) 적응을 조사 (1A). 우리는이 분석의 핵심 MTB / 대식 세포 집합체 구조의 생성을 확실하게함으로써, 스루풋의 호환성 (도 1b)를 가능하게하는 96- 웰 플레이트 포맷 (도 2)에서 생성 될 수 있음을 보여준다. 대 식세포 MTB 직접 잘 특성화 레사 주린 미세 적정 분석 (도 3)를 사용하여 약효 시험에 이용 될 수있는이 방법으로 제조 계대.

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토론

여기서는 상세히 약효 시험에 적합한 다른 MTB 감염 모델을 설명 하였다. 이 모델은 계정 초기 결핵 약물 개발 과정에서 더 고려를 부여해야 두 가지 주요 요인을 취 약물 침투와 감염시 MTB의 대사 변화에 생리 학적으로 관련 장벽의 존재. 우리는 이전에 우리 감염 모델의 이점을 도시 처리량 호환성 16 감염을 스케일링 가능성을 제시하고 있지만, 여기에서 우리는 96 웰 플레이트 형식으로 직접 시스템을 채택함으로써 실제로 달성 할 수 있음을 보여준다. 이 피펫에 요구를 제거하고, 응집체의 크기는 크기에 도달 할 수있는 본래 어려운 개별 웰에 큰 배양 플라스크로부터 응집체를 분산으로 MTB / 대식 세포를 생성하는 능력은 96 웰 플레이트에서 직접 집계 유리한> 500 μm의. 감염된 대 식세포 응집체의 큰 사이즈는 팁을 막히게 있거나 광범위한 피펫이 집계 깨지 것처럼 처리량 분석에 필요한 P200 멀티 채널 피펫을 사용하지 않도록한...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

Cytation 3 자동 이미징 플레이트 리더를 사용해 주신 Frank Wolschendorf 박사님께 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01-AI104499 to OK에 의해 부분적으로 자금이 지원되었습니다. 작업의 일부는 UAB CFAR 시설과 UAB CFAR 유세포 분석 코어/공동 UAB 유세포 분석 코어에서 수행되었으며, 이는 NIH/NIAID P30 AI027767 및 NIH 5P30 AR048311에서 자금을 지원합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
7H9BD Difco271310제조업체의 권장 사항을 따르십시오
Middlebrook OADCBD Biosciences212351
TyloxapolSigmaT8761H2O에 20% 스톡 용액 준비; 필터 살균
D-판토텐산 헤미칼슘염SigmaP5710H2O;
L-leucineMP Biomedicals194694H2O에서 50mg/mL 원액 살균 필터,
Hygromycin BEMD Millipore400051H2O에서 200mg/mL 원액
Nalgene Square PETG 배지 병Thermo Fisher2019-0030
RPMI 1640 배지HycloneSH30027.01
소 태아 혈청애틀랜타 생물학 S12450H
L-글루타민코닝MT25005CI
HEPESHycloneSH30237.01
Cytation 3 플레이트 리더Biotek모든 형광판 리더 및 현미경과 교체 가능
Gen5 소프트웨어Biotek기록 및 분석 rezasurin coversion
리팜피신 Fisher ScientificBP2679250H2O
Moxifloxacin HydrochlorideAcros Organics10mg/mL 원액 457960010 H2O
Resazurin Sodium SaltSigmaR7017준비 800 μ H2O의 g/mL 원액; 필터 살균
Tween-80Fisher ScientificT164500H2O에서 20% 스톡 용액 준비; 필터 살균
에서 에서 10mg/mL 원액

참고문헌

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