마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

요약

이 원고는 Gata4, Hand2, Mef2c 및 Tbx5의 레트로바이러스 매개 전달을 사용하여 다양한 재프로그래밍된 심장 아형의 생성 및 정량화를 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

초록

한 세포 유형을 다른 세포 유형으로 직접 재프로그래밍하는 것은 최근 재생 의학, 질병 모델링 및 계통 사양화를 위한 강력한 패러다임으로 부상했습니다. 특히, Gata4, Hand2, Mef2c 및 Tbx5(GHMT)에 의해 섬유아세포가 유도된 심근세포 유사 근세포(iCLM)로 전환되는 것은 in vitro 및 in vivo에서 새로운 심장 근세포를 생성하는 중요한 방법을 나타냅니다. 최근의 증거에 따르면 GHMT는 이전에 알려진 것보다 더 다양한 심장 아형을 생성하므로 추가 연구를 수행하기 위한 체계적인 접근의 필요성을 강조합니다. 그러나 직접 재프로그래밍을 치료 전략으로 사용하기 전에, 특정 심장 아형을 생성하기 위해 계통 변환의 기계론적 토대를 자세히 이해해야 합니다. 여기에서는 마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 GHMT 매개 재프로그래밍에 의해 iCLM을 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

효율적인 재프로그래밍을 달성하기 위해 MEF 분리, 레트로바이러스 생산 및 MEF 감염 방법을 간략하게 설명합니다. 재프로그래밍된 세포의 아형 정체성을 결정하기 위해 정의된 호환 가능한 항체 세트를 사용하여 iCLM에서 면역세포화학을 수행하기 위한 단계별 접근 방식을 자세히 설명합니다. iCLM 및 개별 심방(iAM), 심실(iVM) 및 심박 조율기(iPM) 하위 유형의 컨포칼 현미경 검사, 식별 및 정량화 방법도 제시됩니다. 마지막으로, 프로토타입 직접 재프로그래밍 실험의 대표적인 결과에 대해 논의하고 효율적인 계통 변환을 보장하기 위해 프로토콜의 중요한 기술적 측면을 강조합니다. 종합하면, 당사의 최적화된 프로토콜은 연구자가 개별 CM 하위 유형을 식별해야 하는 의미 있는 심장 재프로그래밍 실험을 수행할 수 있는 단계적 접근 방식을 제공해야 합니다.

서론

핵심은 배아 ^{(1), (2)에서} 개발 한 최초의 기능 기관이다. 순환계와 함께에서는 산소, 영양분, 개발시의 폐기물 처리 장치에 공급한다. 3 주 후, 수정, 인간 심장 처음 박동 및 적절한 조절은 심근 (CMS)에 의해 유지된다. 이들 특화된 세포의 비가역적인 손실 따라서 진보적 심부전의 기초가되는 기본적인 문제이다. 이러한 제브라 피쉬 제노와 같은 일부 유기체는 심장 재생 잠재력을 가지고 있지만, 성인 포유류 심장 ^{3, 5, 6 개의} 제한된다. 따라서, 심장의 중요한 기능을 제공, 심장 질환 혼자 ⁷ 미국에서 60 만 명이 사망를 차지, 세계에서 사망의 주요 원인이다 놀라운되지 않습니다. 그만큼효율적으로 복구하거나 손상된 심근을 대체 할 refore, 세포 기반 치료는 큰 임상 적 관심이다.

야마나카 동료 ⁸ 정액 연구는 네 개의 전사 인자 강제 발현이 다 능성 줄기 세포로 완전히 ....

프로토콜

동물 관행과 관련된 모든 실험 절차는 UT 사우스 웨스턴 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

Hcn4-GFP E12.5 마우스 배아 섬유 아세포 1. 분리 (MEFs에)

1. 동형 접합 Hcn4-GFP의 남성과 CD-1 여성 사이의 시간 제한 교배를 설정합니다.
2. 이산화탄소 안락사 이후 자궁 전위에 의해 E12.5에서 임신 여성을 희생.
   1. ^{이전 23 22} 설명 된대로 해부 집게와 자궁 뿔을 제거하고 ^칼슘 또는 마그네슘없이 1X 인산 완충 식염수 (PBS)와 얼음에 페트리 접시 ^2+에 배치합니다.
3. 멸균 기법을 사용하여 조직 배양 후드에서 모든 후속 단계를 수행한다.
   1. 가위를 사용하여 집게를 해부 골목 자궁과 양수에서 배아를 제거합니다. 더 나은 처리를 위해 첨부 된 태반을 유지합니다. 레그나NT CD-1 여성은 일반적으로 10 ~ 14 새끼를 낳을.
   2. 집게를 해부 사용하여 격리 된 배아을 빠르게 70 % (v / v)의 EtOH로 두 번을 씻어.
      ....

결과

PM을 특정 리포터 마우스 활용, 우리는도 1에 도시 된 바와 같은 다양한 내인성 근세포를 식별하기 위해 멀티 플렉스 면역 전략을 개발했다. 도 2에 도시 된 프로그래밍 단계에 따라, 특정 아형의 CM 유도이라도 낮은 속도 빠르면 4 일째 ^21로 감지 할 수있다. 14 일으로 실험을 중지 할 수 있습니다 및 근절 조직 (그림 3)과 서브 타입 - 사양 (그림 4)에 대한 평가 하였다. 그림 5는 ICC (그림 5 패널 A)에 대한 슬라이드 준비의 워크 플로우 및 iCLM 하위 특정 세포 (그림 / C 5 패널 B)의 정량을 요약 한 것입니다.

토론

본 연구는 심장 전사의 레트로 바이러스 - 매개 발현을 통해 심장 서브 타입의 다양한 세트로 MEFs에의 변환을위한 직접 프로그래밍 전략을 제공하는 Gata4, Mef2c, Tbx5 및 Hand2 (GHMT) 요인. PM 특정 리포터 마우스와 함께 면역 다중화 방식을 사용하여, 우리는 단일 세포 해상도에서 IAM,이 iVMS 및 IPMS를 식별 할 수있다. 이러한 분석은 하위 유형의 다양성과 근절 개발에 대한 개별 전사 인자의 기여를 분리 할 수있는 체외 시스템에서 실험이 가능합니다. 병행하여,이 새로운 전사 인자 또는 특정 혈통 iCLMs쪽으로 치우치게 소분자에 대한 통찰력을 가지고 있었다. 그럼에도 불구하고,이 분석의 성공적인 완료에 대한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 아래에서는 일반적인 iCLM 실험에서 바이러스 역가, 섬유 아세포, 품질 및 이미지 분석의 영향을 다룬다.

우리의 연구에서 우리는 EMP로이의 ecotropic - 레트로 바이러스는 E1.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM	Sigma	D5796	iCLM 배지, Plat-E 배지, 섬유아세포 및 형질주입 배지의 구성 요소
Medium 199	Thermo Fisher Scientific		11150059 iCLM 배지의 구성 요소
소 태아 혈청(FBS)	Sigma	F2442	iCLM 배지, Plat-E 배지, 섬유아세포 및 형질 주입 배지의 구성
Insulin-Transferrin-Selenium G	Thermo Fisher Scientific	41400-045	iCLM 매체
MEM 비타민 용액	Thermo Fisher Scientific	11120-052	iCLM 매체
MEM 아미노산	Thermo Fisher Scientific	1601149	iCLM 매체의 구성
비필수 아미노산	Thermo Fisher Scientific	11140-050	iCLM 매체의 구성 요소
항생제-항진균제	Thermo Fisher Scientific		15240062 iCLM 배지
B-27 보충제	Thermo Fisher Scientific	17504044	iCLM 배지
열 비활성화 호스 세럼	Thermo Fisher Scientific	26050-088	iCLM 배지
NaPyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-70	iCLM 배지 구성 요소
페니실린/스트렙토마이신	Thermo Fisher Scientific		1514022 Plat-E 배지 및 섬유아세포 배지
Puromycin의 구성 요소	Thermo Fisher Scientific	A11139-03	Plat-E 매체
블라스티시딘의 성분	Gemini Bio-Products	400-128P	Plat-E 매체 구성 요소
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	섬유아세포 매체
구성 요소 컨포칼 레이저 스캐닝 LSM700	Zeiss		컨포칼 분석을 위해
FuGENE 6 transfection 시약	Promega	E2692	Transfection 시약
Opti-MEM 감소 세럼 중간	온도 피셔 사이언티픽	31985-070	트랜스펙션 시약
폴리브렌	밀리포어	TR-1003-G	유도 시약. 8 &mu의 최종 농도에서 사용하십시오. M/mL
Platinium-E (PE) 레트로바이러스 팩긴 세포주, Ecotropic	CellBiolabs	RV-101	레트로바이러스 팩킹 세포주
트립신 0.25% EDTA	Thermo Fisher Scientific		MEFs 및 Plat-E 해리용
마우스 안티 &알파;-액티닌(클론 EA-53)	Sigma	A7811	컨포칼 분석을 위한 항체. 컨포칼 분석을 위해 1:200
Chicken anti-GFP IgY	Thermo Fisher Scientific	A10262	. 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA에서 사용	Abgent	AP8534A	컨포칼 분석을 위한 항체. 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG 에서 사용;	ProteinTech	10906-1-AP	컨포칼 분석을 위한 항체. 1:200
Vectashield 용액에서 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Vector Labs	H-1500	Dye와 함께 컨포칼 분석을 위한
사용 Superfrost Plus 현미경 슬라이드	Thermo Fisher Scientific	12-550-15	25 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips	NeuVitro Corp	GG-12-1.5	Coverslips for confocal analysis
100 μ m 세포 여과기	Thermo Fisher Scientific	08-771-19
0.45 μ m 주사기 필터 SFCA 25MM	Thermo Fisher Scientific	09-740-106	바이러스 여과용
6mL 주사기	Covidien	8881516937	바이러스 여과용
염소 치킨 IgY(H& L) A488	Abcam	AB150169	컨포칼 분석을 위한 2차 항체. 1:400
당나귀 안티-토끼 A647 IgG(H+L)	Thermo Fisher Scientific	A31573	컨포칼 분석을 위한 2차 항체.
Goat anti-mouse IgG(H+L) A555	Thermo Fisher Scientific	A21422	2차 항체에서 사용합니다. 1:400
Triton X-100	Sigma	93443-100ml	세포 투과화용
CaCl2 및 MgCl2 없는 Dulbecco의 PBS (D-PBS)	Sigma	D8537
Power Block 10x Universal Blocking 시약	Thermo Fisher Scientific	NC9495720	H2O
16% 파라포름알데히드 수용액(PFA)	Microscopy Sciences	15710	dH2O
6 cm  플레이트	Olympus	25-260
6-웰 플레이트	Genesee Scientific	25-105
24-웰 플레이트	Genesee Scientific	25-107
10 cm 조직 배양 접시	Corning	4239
15 cm  조직 배양 접시	Thermo Fisher Scientific	5442
15 mL 원뿔형 튜브	Corning	4308
50 mL 원뿔형 튜브	Corning	4249
0.4% 트리판 블루 용액	Sigma	T8154	생존력 용
에틸 알코올 200 증거	Thermo Fisher Scientific	7005
표백제	Thermo Fisher 과학	6009

요소 의 구성 요소 의 구성 요소 요소 의 구성 요소 의 구성 요소 항체에서 사용합니다컨포칼 분석을 위해 1:400에서 사용 에 1배로 희석Electro 에 희석된 4%에서 사용