맞춤형 HPLC 정화 프로토콜 즉, 올리고머 형성 할 수있는 수율 고순도 아밀로이드 베타 42과 아밀로이드 베타 펩티드 (40),

요약

여기에서 우리는 올리고머 형성이 가능한 고순도 아밀로이드 베타 42(Aβ42) 및 아밀로이드 베타 40(Aβ40) 펩타이드를 생성하는 맞춤형 HPLC 정제 프로토콜을 보고합니다. 아밀로이드 베타는 알츠하이머병과 관련된 응집이 잘 되는 소수성 펩타이드입니다. 펩타이드의 아밀로이드 생성 특성은 정제를 어렵게 만듭니다.

초록

알츠하이머병과 관련된 아밀로이드 베타(Aβ)와 같은 아밀로이드성 펩타이드는 고순도 물질을 얻으려고 할 때 상당한 문제를 제시할 수 있습니다. 여기에서는 고순도 아밀로이드 베타 42(Aβ42) 및 아밀로이드 베타 40(Aβ40) 펩타이드를 생산하기 위한 맞춤형 HPLC 정제 프로토콜을 제시합니다. 우리는 상업적으로 이용 가능한 소수성 폴리(스티렌/디비닐벤젠) 고정상, 고분자 실험실 역상 - 높은 pH 조건에서 스티렌디비닐벤젠(PLRP-S)의 조합이 단일 크로마토그래피 실행에서 고순도(>95%) Aβ42를 달성할 수 있음을 발견했습니다. 정제는 재현성이 높으며 정제하고자 하는 물질의 양에 따라 반분취 및 분석 조건으로 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 Aβ40 펩타이드에 동일한 성공으로 적용할 수 있으며 방법을 변경할 필요가 없습니다.

서론

알츠하이머 병은 신경 퇴행성 질환 효과 만 35 명 이상의 세계이다. 질병의 발병 및 발달에 크게 관여 ^1은 매우 응집하기 쉬운 소수성 펩타이드 베타 아밀로이드 (Aβ)이다. ^이 Aβ가 그러나, 아밀로이드 베타 42 (Aβ42)는 단백질의 가장 독성 형태 42 아미노산 변이체 인 것으로 생각하고, 길이 36 내지 43 개의 아미노산의 범위이다. ^(3)이 용이 특히 신경 독성 엔티티 것으로 여겨진다 확산 성, 올리고머 성 종을 형성하는 Aβ42의 능력에 대부분 기인한다. ^{도 4는} Aβ 펩티드에 대한 이해를 증진하기 위하여, 일상적으로 고순도 재료를 얻는 것이 필수적이다. 미량 불순물의 존재는 크게 펩티드 응집 성향의 특성을 변화하는 것으로 나타났다. ⁽⁵⁾

티raditionally 같은 소수성 Aβ 펩티드의 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 분리 C _사 또는 C ₈ 실리카 계 정지상과 이동상 산성의 조합을 사용하여 수행되었다. ⁽⁶⁾ 그러나, ....

프로토콜

1. Aβ40 또는 Aβ42 펩타이드의 제조용 HPLC 정제

1. HPLC 정제를 위한 다음의 버퍼를 준비한다.
   1. 1,000 mL의 초순수에 NH₄OH(28% 용액) 1.3 mL를 첨가하여 버퍼 A(20 mM NH₄OH)를 준비한다.
   2. 800 mL의 HPLC 등급 아세토니트릴과 200 mL의 초순수로 구성된 용액에 NH₄OH(28% 용액) 1.3 mL를 첨가하여 버퍼 B(20 mM NH₄OH가 포함된 80% 아세토니트릴)를 준비한다.
   3. 100 mL의 초순수에 NH₄OH(28% 용액) 100 µL를 첨가하여 시료 용해 버퍼(0.1% NH₄OH)를 준비한다.
2. 그림 1에 표시된 대로 HPLC 기기를 설정한다.
   1. 폴리머 튜빙을 사용하여 버퍼 A와 버퍼 B가 들어 있는 용매 병을 HPLC 펌프의 입구에 연결한다. 일체형 피팅을 사용하여 폴리머 튜빙을 HPLC 펌프에 고정한다. 각각의 버퍼 튜빙이 기기의 올바른 입구 밸브에 연결되었는지 확인한다. HPLC 펌프에 디가서를 장착한다.
   ....

결과

PLRP-S 고정상과 고 pH 이동상의 조합을 사용하여 Aβ42 펩타이드를 정제하면, 72분에서 74분 사이의 머무름 시간에서 Aβ 펩타이드에 대한 날카롭고 분리된 피크가 형성됩니다(그림 2C). 수집된 용출액의 직접 주입 질량 분석법을 통해 피크의 동일성을 확인합니다. 용출액은 용액 상태로 -20 °C에서 최대 12시간 동안 보관할 수 있습니다. 보관 기간이 길어지면 단백질의 산화가 발생할 수 있습니다. 정제된 펩타이드를 분리하기 위해, 용출액을 액체 질소로 급속 냉동시킨 후 동결 건조합니다. 정제된 펩타이드의 분석용 HPLC 결과 >95%의 순도가 나타납니다(그림 2D). 동일한 절차를 방법의 수정 없이 Aβ40 펩타이드 정제에도 사용할 수 있습니다(그림 3A). 분석용 HPLC 결과 Aβ40의 순도는 95% 이상인 것으로 나타납니다(그림 3B

토론

Aβ 펩타이드의 HPLC 정제는 정제에 사용되는 고정상과 펩타이드를 용리하기 위해 선택된 이동상의 선택에 크게 의존합니다. 펩타이드의 낮은 등전점과 높은 응집 성향은 소수성 단백질(산성 이동 용리액과 결합된 C4 또는 C8 고정상)의 분리를 위한 전통적인 크로마토그래피 조건을 어렵게 만들며, Aβ 펩타이드는 장기간 넓고 분해되지 않은 피크로 용출됩니다(그림 2A).

이 문제를 피하기 위해 높은 pH에서 화학적으로 안정적인 PLRP-S 고정상이 Aβ 펩타이드의 정제에 효과적인 것으로 밝혀졌습니다(그림 2B 및 2C). 높은 pH 이동상을 사용하면 응집 정도가 최소화되었으며, 최적화하면 날카롭고 잘 분해된 피크가 생성되었습니다. 최적화된 프로토콜에서 버퍼 B의 백분율은 52분 시점에서 20%에서 27%로 빠르게 전환되었고 그 결과 잘 정의된 Aβ 피크가 생성되었습니다(그림 2C<.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
애질런트 1260 Infinity II 쿼터너리 펌프	애질런	G7111B	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
애질런트 1260 인피니티 II 이중 가변 파장 검출기	애질런트	G7114A	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
10 mL 스테인리스강 시료 루프가 장착된 Agilent 1260 Infinity II 수동 주입기 Agilent		0101-1232	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
20 µ가 장착된 Agilent 1260 Infinity II 수동 주입기; L 스테인레스 스틸 샘플 루프	Agilent	G1328C	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
링 스탠드 마운팅 브라켓	Agilent	1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5  &마이크로; m 4.6 x 250 mm (분석)	Agilent	PL1512-5501
http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features Aβ 42 또는 Aβ 40 펩타이드			: CEM liberty 자동 펩타이드 합성기를 사용하여 사내에서 합성.
수산화암모늄 (NH4OH, 28% 용액)	Fisher Scientific	A669-500
아세토니트릴	Fisher Scientific	A998-4
HPLC 등급 물	Fisher Scientific	W5-4
Falcon 50 mL 원추형 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	14-954-49A
Supelco PEEK 피팅 일체형 핑거타이트, 5개 패키지	시그마-알드리치	Z227250
Normject 5  cc 멸균 주사기	Fisher Scientific	1481729
16 게이지 SS 바늘	Rheodyne	3725-086

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