방법 논문

맞춤형 HPLC 정화 프로토콜 즉, 올리고머 형성 할 수있는 수율 고순도 아밀로이드 베타 42과 아밀로이드 베타 펩티드 (40),

DOI:

10.3791/55482

⸱

2017년 3월 27일

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of California, Santa Cruz

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서 우리는 올리고머 형성이 가능한 고순도 아밀로이드 베타 42(Aβ42) 및 아밀로이드 베타 40(Aβ40) 펩타이드를 생성하는 맞춤형 HPLC 정제 프로토콜을 보고합니다. 아밀로이드 베타는 알츠하이머병과 관련된 응집이 잘 되는 소수성 펩타이드입니다. 펩타이드의 아밀로이드 생성 특성은 정제를 어렵게 만듭니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

알츠하이머병과 관련된 아밀로이드 베타(Aβ)와 같은 아밀로이드성 펩타이드는 고순도 물질을 얻으려고 할 때 상당한 문제를 제시할 수 있습니다. 여기에서는 고순도 아밀로이드 베타 42(Aβ42) 및 아밀로이드 베타 40(Aβ40) 펩타이드를 생산하기 위한 맞춤형 HPLC 정제 프로토콜을 제시합니다. 우리는 상업적으로 이용 가능한 소수성 폴리(스티렌/디비닐벤젠) 고정상, 고분자 실험실 역상 - 높은 pH 조건에서 스티렌디비닐벤젠(PLRP-S)의 조합이 단일 크로마토그래피 실행에서 고순도(>95%) Aβ42를 달성할 수 있음을 발견했습니다. 정제는 재현성이 높으며 정제하고자 하는 물질의 양에 따라 반분취 및 분석 조건으로 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 Aβ40 펩타이드에 동일한 성공으로 적용할 수 있으며 방법을 변경할 필요가 없습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

알츠하이머 병은 신경 퇴행성 질환 효과 만 35 명 이상의 세계이다. 질병의 발병 및 발달에 크게 관여 1은 매우 응집하기 쉬운 소수성 펩타이드 베타 아밀로이드 (Aβ)이다. 이 Aβ가 그러나, 아밀로이드 베타 42 (Aβ42)는 단백질의 가장 독성 형태 42 아미노산 변이체 인 것으로 생각하고, 길이 36 내지 43 개의 아미노산의 범위이다. (3)이 용이 특히 신경 독성 엔티티 것으로 여겨진다 확산 성, 올리고머 성 종을 형성하는 Aβ42의 능력에 대부분 기인한다. 도 4는 Aβ 펩티드에 대한 이해를 증진하기 위하여, 일상적으로 고순도 재료를 얻는 것이 필수적이다. 미량 불순물의 존재는 크게 펩티드 응집 성향의 특성을 변화하는 것으로 나타났다. (5)

티raditionally 같은 소수성 Aβ 펩티드의 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 분리 C 사 또는 C 8 실리카 계 정지상과 이동상 산성의 조합을 사용하여 수행되었다. (6) 그러나, 이러한 조건은 펩티드의 정제에 도전을 제공 할 수있다. Aβ 펩티드의 낮은 등전점은 PI (약 5.5) (7)는 산성 조건 하에서, 펩티드의 응집이 증가되고, 그 결과 종종 분리하기 어려운 넓은 비 - 분해 HPLC 피크는 (도 2A)을 생산하는 것을 의미한다. 또한, 이러한 넓은 피크들은 펩티드의 응집 프로필 영향 및 일반적 극적 제조 펩타이드의 양에 영향을 미칠 수있는 정제의 후속 발사가 필요할 수 불순물을 함유한다.

폴리 (스티렌 / 디 비닐 벤젠) 정지상 PLRP-S는을 정제의 대안적인 수단을 나타낸다잉 소수성 펩타이드. 정지상 다른 단백질과 메신저 리보 핵산 (mRNA의) 다수의 정제에 사용되어왔다. 8, 9 PLRP-S 정지상은 역상 분리 추가적인 알킬 리간드를 필요로하지 않고,보다 중요한 펩티드 deaggregation 리드 높은 pH에서 화학적으로 안정하다. 7 여기서, 우리는 고순도 아밀로이드 베타 42 (Aβ42)과 아밀로이드 베타 40 (Aβ40) 펩타이드를 산출 맞춤형 HPLC 정화 프로토콜을보고합니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Aβ40 또는 Aβ42 펩타이드의 분취용 HPLC 정제

  1. HPLC 정제를 위해 다음 완충액을 준비합니다.
    1. 초순수 1,000mL에 NH4OH1.3mL(28% 용액)를 첨가하여 완충액 A(20mM NH4OH)를 준비합니다.
    2. 800mL의 HPLC 등급 아세토니트릴 용액과 200mL의 초순수 용액에 1.3mL의 NH4OH(28% 용액)를 첨가하여 완충액 B(20mM NH4OH의 80% 아세토니트릴)를 준비합니다.
    3. 초순수 100mL에 NH4OH100μL(28% 용액)를 첨가하여 시료 용해 완충액(0.1% NH4OH)을 준비합니다.
  2. 그림 1과 같이 HPLC 기기를 설정합니다.
    1. 폴리머 튜브를 사용하여 완충액 A와 완충액 B가 포함된 용매 병을 HPLC 펌프의 입구에 맞춥니다. 일체형 피팅을 사용하여 폴리머 튜브를 HPLC 펌프에 부착합니다. 각 버퍼의 폴리머 튜브가 기기의 올바른 입구 밸브에 장착되어 있는지 확인하십시오. HPLC 펌프에 탈기 장치를 장착합니다.
    2. 폴리머 튜빙을 사용하여 HPLC 펌프를 300 Å 8 μm 25 mm х 300 mm 분취 컬럼(그림 1B, 맨 왼쪽 열, 재료 목록 참조)의 주입구에 연결합니다.
      1. 폴리머 튜빙을 일체형 손가락으로 꽉 끼워 분취용 컬럼에 부착합니다. 폴리머 컬럼이 올바른 방향으로 배치되었는지 확인합니다.
        참고: 분취 컬럼의 고정상은 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 입자로 구성됩니다. 폴리머 컬럼의 올바른 방향은 단일 방향 화살표로 외부 케이싱에 표시되어 있습니다.
    3. 폴리머 튜브를 사용하여 컬럼의 배출구를 이중 파장 검출기에 연결하고 파장 검출기를 214nm 및 280nm로 설정합니다.
      1. 내장 HPLC 소프트웨어의 setup instrument method 옵션에서 검출 파장 매개변수를 변경하여 파장을 변경합니다.
    4. 일체형 손가락 꽉 끼우는 피팅으로 폴리머 튜브를 파장 검출기의 입구에 부착합니다. 파장 검출기의 출력 밸브에 폴리머 튜브를 부착합니다. 일체형 핑거 타이트 피팅으로 폴리머 튜브를 HPLC 검출기의 배출 밸브에 부착합니다. 이것은 샘플 수집 tubing.
      이 될 것입니다. 참고: Aβ 펩타이드에 강한 발색단이 없기 때문에 214nm를 피크 포집을 위한 기본 자외선(UV) 파장으로 사용해야 합니다.

figure-protocol-1
그림 1: 아밀로이드 베타 펩타이드의 정제에 사용되는 HPLC 기기의 실험 설정. (A) 214nm 및 280nm로 설정된 탈기 장치 및 가변 파장 검출기가 장착된 4차 HPLC 펌프; (B) 아밀로이드 베타 펩타이드의 정제에 사용되는 HPLC 컬럼, 왼쪽에서 오른쪽으로 25 x 300 mm2 분취용 컬럼, 7.5 x 300 mm2 반분취용 컬럼 및 4.6 x 250 mm2 분석 컬럼; (C) 분석용 HPLC에 사용되는 20μL 스테인리스강 주입 루프가 있는 수동 주입기; (D) 분취 및 반분취 정제에 사용되는 10mL 스테인리스강 주입 루프가 있는 수동 주입기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 표 1과 같이 정제 분석법을 실행하도록 HPLC 소프트웨어를 프로그래밍합니다. 용매 시간표 파라미터를 변경하여 정제 방법을 입력합니다(HPLC 소프트웨어에 내장된 setup instrument method 옵션에서). HPLC 소프트웨어에서 "켜기" 버튼을 클릭하여 HPLC 펌프를 켭니다.
    참고: 펌프는 분취용 컬럼과 HPLC 기기를 통해 버퍼 A와 버퍼 B의 시작 비율을 공급하기 시작합니다.
    1. 완전히 평형을 이룰 때까지 30분 동안 시스템을 그대로 둡니다.
<표 fo:keep-together.within-page="1"> 시간/분 버퍼 A의 %a 버퍼 Bb의 % 유속d / mL min-1 0 80의 20분 6 45의 75.5 24.5년 6 45.01월 80의 20분 6 52.01월 80의 20분 6 52.02월 73의 27분 6 85의 73의 27분 6 92분 5 개 95씨 6

표 1: 25 × 300mm 폴리머 컬럼을 사용한 Aβ42 및 Aβ40 펩타이드 정제 시간표. ᅡ버퍼 A - H2O, 20 mM NH4OH; b80% MeCN / 20% H2O, 20 mM NH4OH; 씨다음 샘플 주입 전에 컬럼을 세척하기 위해 15분 동안 실행했습니다. 디HPLC 기기에서 6mL/분의 유속을 실행하려면 압력 한계를 200bar로 줄여야 합니다.

  1. Aβ 펩타이드 시료의 정제
    참고: 조잡한 펩타이드는 자동화된 고체상 펩타이드 합성을 통해 얻어졌습니다. 10
    1. 3mg의 미처리 Aβ 펩타이드를 시료 용해 완충액 4mL에 용해시킵니다. 용해를 돕기 위해 실온에서 30-60초 동안 샘플을 초음파 처리하고 40kHz의 주파수에서 가열합니다.
    2. 16게이지 스테인리스강 바늘이 장착된 5mL 플라스틱 주사기를 사용하여 전체 샘플을 HPLC 컬럼에 주입합니다. 하위 단계 1.3.
      에 설명된 대로 정제 방법을 실행합니다. 참고: 이 시스템을 사용하면 10mL 스테인리스강 주입 루프가 장착된 수동 주입기를 사용하여 시료를 주입할 수 있습니다(그림 1D). 원하는 Aβ 펩타이드는 72분에서 74분 사이에 급격한 분리된 피크로 용리됩니다(그림 2C).
    3. 샘플을 50mL 원뿔형 원심분리 튜브에 넣습니다. 수집된 용리액의 직접 주입 질량 분석법을 통해 Aβ 피크의 정체를 확인합니다. 11 -20°C에서 최대 12시간 동안 용리액을 보관하십시오.
      주: 12 h 보다는 더 긴 기간 동안 해결책의 저장은 펩티드의 산화를 위한 가능성 때문에 조언되지 않습니다.
    4. 수집된 Aβ 펩타이드의 분취량/분취액을 액체 질소에서 급속 동결하여 정제된 펩타이드를 분리하고 동결건조합니다. -60°C의 온도와 20mTorr의 압력에서 24시간 동안 샘플을 동결 건조하여 동결 건조를 수행합니다.
    5. Aβ 펩타이드의 순도를 측정하기 위해 아래에 설명된 대로 분석용 HPLC 프로토콜을 실행합니다. 펩타이드는 동결건조된 형태로 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관합니다.

2. 정제된 Aβ 단백질의 분석적 HPLC 분석

  1. 위 프로토콜의 하위 섹션 1.1.에 설명된 대로 HPLC 버퍼를 준비합니다.
  2. 1.2.1단계에 따라 그림 1에 표시된 대로 4.6 × 250mm 분석 컬럼(그림 1B, 맨 오른쪽 컬럼)과 20μL 스테인리스강 주입 루프(그림 1C)가 기기에 장착된 수동 주입기를 사용하여 분석용 HPLC를 설정합니다.
  3. 1.3단계와 유사한 지침에 따라 표 2와 같이 분석 방법을 실행하도록 HPLC 소프트웨어를 프로그래밍합니다.
<표 fo:keep-together.within-page="1"> 시간/분 버퍼 A의 %a 버퍼 Bb의 % 유속 / mL min-1 0 95의 5 개 1 개 30분 50의 50의 1 개

표 2: Aβ 펩타이드의 HPLC 순도 분석 시간표. ᅡ버퍼 A - H2O, 20 mM NH4OH; b80% MeCN / 20% H2O, 20 mM NH4OH.

  1. Aβ 펩타이드의 순도 분석
    1. 샘플 버퍼 용액에서 펩타이드를 용해하여 정제된 펩타이드의 1mg/mL 용액을 준비합니다.
      참고: 버퍼 레시피는 하위 섹션 1.1에서 찾을 수 있습니다. 단백질 농도는 280nm(A280nm)에서 단백질 흡수를 측정하여 결정됩니다. 12 농도를 결정하는 데 사용되는 몰 흡광 계수(ε)는 ε = 1,490dm3 mol-1 cm-1입니다. 13
    2. 1mg/mL(222μM) 용액 20μL를 HPLC 컬럼에 주입하고 2.3.
      단계에서 설정한 분석법을 실행합니다. 참고: 분석에 사용되지 않는 나머지 용액은 액체 질소에서 급속 동결하고 동결 건조하여 Aβ 펩타이드를 회수할 수 있습니다. 동결건조에 대한 자세한 내용은 하위 섹션 1.4.4에서 확인할 수 있습니다. Aβ 펩타이드는 16분에서 18분 사이에 분석 컬럼에서 용리됩니다(그림 2D). HPLC 기기와 함께 제공되는 내장 통합 분석 소프트웨어를 사용하여 Aβ 펩타이드의 순도를 측정할 수 있습니다. 순도는 스펙트럼의 각 개별 피크를 통합하고 펩타이드-피크 백분율 면적을 계산하여 결정됩니다. 일반적으로 >95%의 정제를 확인해야 합니다.

figure-protocol-2
그림 2: Aβ42의 대표적인 HPLC 흔적. (A) 전통적인 C4 실리카 정제, 조건 : 완충액 A : 0.1 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA)을 함유 한 H2O, 완충액 B : 0.1 % TFA를 함유 한 MeCN (아세토 니트릴), 구배 : 40 분 동안 20-27 % 완충액 B 후 등용매 27 % 완충액 B; (B) 25 x 300 mm2 고분자 컬럼을 사용한 분취 정제, 조건: 완충액 A: 20mM NH4OH의 H2O, 완충액 B: 20 mM NH4OH의 80% MeCN / 20% H2O, 구배: 70분 동안 20 - 27% 완충액 B 후 등용매 27% 완충액 B; (C) 25 x 300 mm2 폴리머 컬럼을 사용하여 최적화된 분취 정제, 조건은 프로토콜 설명 텍스트의 하위 섹션 1.3에 있는 표 1에 설명되어 있습니다. (D) 4.6 x 250 mm2 폴리머 컬럼을 사용한 분석적 HPLC, 조건: 버퍼 A: 20mM NH4OH의 H2O, 버퍼 B: 20 mM NH4OH의 80% MeCN / 20% H2O, 30분 동안 그래디언트-5 - 50% 버퍼 B. 파트 A, B 및 C의 경우 Aβ42에 해당하는 피크는 별표로 표시됩니다. 파트 C에서 표시된 Aβ42 피크의 수집은 파트 D에서 볼 수 있듯이 >95%의 순도를 나타냅니다. Aβ42 피크의 정체를 결정하기 위해 질량 분석법을 사용했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PLRP-S 고정상과 높은 pH 이동상의 조합을 사용하여 Aβ42 펩타이드를 정제하면 72분에서 74분 사이의 머무름 시간에서 Aβ 펩타이드에 대한 날카롭고 분리된 피크가 형성됩니다(그림 2C). 피크의 정체는 수집된 용리액의 직접 주입 질량 분석법을 통해 이루어집니다. 용리액은 -20°C에서 용액에 최대 12시간 동안 보관할 수 있습니다. 장기간 보관하면 단백질이 산화될 수 있습니다. 정제된 펩타이드를 분리하기 위해 용리액을 액체 질소에서 급속 냉동하고 동결 건조합니다. 정제된 펩타이드의 분석적 HPLC는 >95%의 순도를 나타냅니다(그림 2D). 동일한 절차를 사용하여 분석법을 수정하지 않고 Aβ40 펩타이드(그림 3A)를 정제할 수 있습니다. 분석용 HPLC는 Aβ40의 순도가 95% 이상임을 나타냅니다(그림 3B).

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aβ 펩타이드의 HPLC 정제는 정제에 사용되는 고정상과 펩타이드를 용리하기 위해 선택된 이동상의 선택에 크게 의존합니다. 펩타이드의 낮은 등전점과 높은 응집 성향은 소수성 단백질(산성 이동 용리액과 결합된 C4 또는 C8 고정상)의 분리를 위한 전통적인 크로마토그래피 조건을 어렵게 만들며, Aβ 펩타이드는 장기간 넓고 분해되지 않은 피크로 용출됩니다(그림 2A).

이 문제를 피하기 위해 높은 pH에서 화학적으로 안정적인 PLRP-S 고정상이 Aβ 펩타이드의 정제에 효과적인 것으로 밝혀졌습니다(그림 2B 및 2C). 높은 pH 이동상을 사용하면 응집 정도가 최소화되었으며, 최적화하면 날카롭고 잘 분해된 피크가 생성되었습니다. 최적화된 프로토콜에서 버퍼 B의 백분율은 52분 시점에서 20%에서 27%로 빠르게 전환되었고 그 결과 잘 정의된 Aβ 피크가 생성되었습니다(그림 2C<...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 기술적 지원에 대해 애질런트에 감사의 뜻을 전합니다. Kate Markham과 Rafael Palomino는 Aβ 펩타이드의 합성 및 정제에 초기에 도움을 준 공로를 인정받았으며, Hsiau-Wei Lee 박사는 원고의 그림 1을 준비하는 데 도움을 준 것에 대해 감사를 표했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
애질런트 1260 Infinity II 쿼터너리 펌프애질런G7111Bhttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
애질런트 1260 인피니티 II 이중 가변 파장 검출기애질런트G7114Ahttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
10 mL 스테인리스강 시료 루프가 장착된 Agilent 1260 Infinity II 수동 주입기 Agilent0101-1232http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
20 µ가 장착된 Agilent 1260 Infinity II 수동 주입기; L 스테인레스 스틸 샘플 루프AgilentG1328Chttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
링 스탠드 마운팅 브라켓Agilent1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5  &마이크로; m 4.6 x 250 mm (분석)AgilentPL1512-5501
http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features Aβ 42 또는 Aβ 40 펩타이드: CEM liberty 자동 펩타이드 합성기를 사용하여 사내에서 합성.
수산화암모늄 (NH4OH, 28% 용액)Fisher ScientificA669-500
아세토니트릴Fisher ScientificA998-4
HPLC 등급 물Fisher ScientificW5-4
Falcon 50 mL 원추형 원심분리기 튜브Fisher Scientific14-954-49A
Supelco PEEK 피팅 일체형 핑거타이트, 5개 패키지시그마-알드리치Z227250
Normject 5  cc 멸균 주사기Fisher Scientific1481729
16 게이지 SS 바늘Rheodyne3725-086
트

참고문헌

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