이 원고는 제브라 피쉬 배아 및 유충의 척수 신경 세포에서 전기 생리 녹음하는 방법을 설명합니다. 준비는 현장에서 뉴런을 유지하고 자주 최소 절개를 포함한다. 이 방법은 초기 애벌레 단계를 통해 초기 전기 흥분의 인수, 척추 신경의 다양한 전기 생리학 연구 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
먼저 개발 모델로 소개 제브라 피쉬는 다른 많은 분야에서 인기를 얻고있다. 급속히 발전 유기체 많은 수의 양육의 용이성, 배아 광학 선명도와 결합,이 모델의 초기 강력한 속성으로 봉사했다. 지난 20 년 동안,이 모델의 성공은 더 큰 규모의 돌연변이 유발 화면에의 복종 할 의무에 의해 형질 전환의 용이성에 의해 추진되고있다. 최근 유전자 편집 방법은 모델의 힘을 확장했다.
신경 발달 연구, 제브라 피쉬 배아와 유충은 여러 가지 방법이 적용될 수있는 모델을 제공한다. 여기, 우리는 신경 세포, 전기 흥분의 필수 속성의 연구를 할 수 방법에 초점을 맞 춥니 다. 제브라 피쉬의 척수 신경 세포의 전기 생리학 연구를위한 우리의 준비는 기록 챔버에 대한 준비를 확보하기 위해 수의사 봉합 접착제의 사용을 포함한다. 기록을위한 대체 방법제브라 피쉬 배아와 유충 미세한 텅스텐 핀 1, 2, 3, 4, 5를 이용하여 챔버 제조의 부착을 포함한다. 이 최대 4 애벌레의 등쪽 측 장착하기 위해 사용되었지만 텅스텐 핀은 대부분, 횡 방향의 제조를 탑재하기 위해 사용된다. 봉합 접착제는 두 방향에서 배아 및 유충을 장착하는 데 사용되었습니다. 접착제를 사용하여, 최소한의 절개함으로써 얻어진 임의의 손상을 피하기 위해, 효소 처리의 사용없이 척추 신경 접근 할 수 있도록 수행 될 수있다. 그러나 유충의 경우, 척수를 둘러싸고있는 근육 조직을 제거하는 간단한 효소 처리를 적용하는 것이 필요하다. 여기서 설명하는 방법은 여러 가지 developmenta에서 운동 신경,의 interneurons 및 감각 신경 세포의 고유 전기적 특성을 연구하는 데 사용되었다L은 6, 7, 8, 9 스테이지.
서론
조지 스트라이징거 척추 동물의 개발 (10)의 유전 적 분석을위한 모델 시스템으로, 일반적으로 제브라 피쉬로 알려진 다니오 레 리오 (rerio)의 사용을 개척했다. 모델 등 여러 가지 장점을 제공한다 : (1) 상대적으로 간단하고 저렴한 축산을; (2) 체외 수정, 초기 발달 단계에서 배아에 쉽게 액세스 할 수 있도록; 및 (3) 투명 배아가 형성로서 세포, 조직 및 기관의 직접 반복 관측을 허용.
계속되는 년 동안, 여러 진보는 더 제브라 피쉬 모델의 힘을 증가했다. 특히, 앞으로 유전 화면과 전체 게놈 시퀀싱 노력이 많은 발달 과정 11, 12, 13, 14에 돌연변이 중요한 유전자의 식별에 중요한 역할을,"> 15, 16. 게이트웨이 클로닝 방법은 전사 활성 형 (TALENs)로 예시. 유전자의 루틴은 애플리케이션 ....
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프로토콜
(; 실험 동물 자원의 사무실, 콜로라도 앤 슈츠의 대학 메디컬 캠퍼스 IACUC) 모든 동물의 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. Zebrafish의 축산
- 올리고 10 시간 어둠 / 14 시간 표시 등주기 적절한 수처리 교환기 (52)는 28.5 ° C로 성인 제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio))를 유지한다.
- 그들이 원하는 스테이지 (예컨대, DPF (2))에 도달 할 때까지 배아 매체에 28.5 ℃, 제브라 피쉬 배아 / 유생 올린다.
해부 재료의 제조 2
- 제브라 피쉬의 해부에 대한 접착제 디스펜서
참고 :이 프로토콜은 기록 챔버로 준비를 부착하는 수의사 봉합 접착제의 사용을 포함한다. 봉합 접착제의 성공적인 사용은 통제 된 방식으로 접착제의 소량의 응용 프로그램이 필요합니다. 접착제는 즉시 강화하기 시작수성 환경 발생. 따라서, 마이크로 피펫에 접착제를 그리고 입에 의해 음 또는 양 압력의인가를 허용하는 홈 메이드 "접착제 디스펜서"을 사용하여 적은 양을 제공한....
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결과
우리가 성공적 유충 DPF 1-7 17 개 HPF 배아 Rohon-수염 뉴런에서 기록했다 (도 5a 및도 5b). Rohon-수염 셀이 기록 된 경우, 제제는 등쪽 측까지 장착 하였다. 이러한 장착은 등쪽 표면 위치와 큰 소마 크기에 기초 Rohon 수염 - 셀의 명확한 식별을 허용한다. 식별 추가적으로 이러한 뉴런의 전형적인 과분극 휴지 막 전위 (도 5, 삽입 테이블) (6), (54)에 의해 확인된다. 또한, 차 감각 뉴런 같은 수염 - Rohon 뉴런의 시냅스 입력 부족하다. 전류 클램프 모드 (도 5B ')에 기록하는 동안 따라서, 전기적 자극의 부재 하에서, 막 전위의 변경이 발생하지 않는 것이다. Rohon 수.......
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토론
여기에 설명 된 방법은 척수의 최소 절개 후 제브라 배아 감각 뉴런과 모터의 전기적 특성과 형태 학적 허용한다. 뉴런은 적어도 1 시간이 기록에 부과 된 시간 제한에 대한 건강을 유지. 뉴런은 표준 전체 셀 구성을 사용하여 기록 된뿐만 아니라 핵 패치에서 같은; 후자의 방법은, 이온 전류 (9)의 상세한 생물 물리학 연구를 배제 할 공간 클램프 문제를 최소화한다.
중요한 도전은 피부를 제거하고 관심의 뉴런에 대한 액세스를 제공하는 데 필요한 제한 해부을 수행하기 위해 챔버에 배아 또는 유충의 확고한 첨부 파일을 달성하는 것입니다. 제조는 적절한 전체 셀 패치 - 클램프 방법을위한 기록 챔버에 고정 할 필요가있다. 수의사 봉합 접착제의 사용을 통해이 문제를 충족하는 방법은 배아 또는 유충에 첨부하기해부 / 기록 챔버, 여기서 다른 모델 유기체의 박리에 사용 된 접근법 (예를 들어 초파리)
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 (ABR에 RLM 및 R01NS25217 및 P30NS048154에 F32 NS059120)에 NIH 보조금에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 진공 필터/보관 병, 0.22 mm 포어 | Corning | 431096 | |
| 주사기 필터 0.2 mm | Whatman | 6780-2502 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| &알파;-부가로톡신 | 토크리스 | 11032-79-4 | |
| 테트로도톡신 | 토크리스 | 4368-28-9 | |
| 알렉사-549 히드라진 염 | 분자 프로브 | A-10438 | 형광 염료 |
| 스핀-X 원심분리기 튜브 필터 | 코닝 | 8161 | |
| 유리 현미경 슬라이드 | 피셔 | 12-550C | |
| 실가드 실리콘 엘라스토머 키트 | Dow Corning | 184 | 실리콘 엘라스토머 |
| 페트리 접시 | Falcon | 351029 | |
| 붕규산 유리 모세관 | Harvard Apparatus | 30-0038 | 0.78 및 1.0mm의 내부 및 외부 직경(얇은 벽 유리 모세관) |
| 붕규산 유리 모세관 | Drummond Scientific | 1-000-1000-100 | 1.13 및 1.55 mm의 내부 및 외부 직경 (두꺼운 벽 유리 모세관) |
| 미니어처 가시 폴리프로필렌 피팅 | Cole-Palmer | 6365-90 | |
| Vetbond 티슈 접착제 | 3M | 1469SB | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| 마이크로전극 풀러 | 셔터 기기 | 모델 P-97 | |
| 증폭기 | 분자 장치 | Axopatch 200B | |
| 헤드 스테이지 | 분자 장치 | CV203BU | |
| 전동 마이크로 매니퓰레이터 | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Tygon 튜빙 | Fisher | 14-169-1B | ID 1/16 IN, OD 1/8 IN 및 WALL 1/32 IN (유연한 실험실 튜빙) |
| 전극 홀더 | 분자 장치 | 1-HC-U | |
| Pharmaseal 삼방향 스톱콕 | Baxter | K75 | |
| 디지타이저 | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| 도립 현미경 | Zeiss | Axioskop2 FS plus | |
| 40X/0.80W Achroplan 대물 | 렌즈 Zeiss | ||
| 데이터 수집 및 분석 소프트웨어 | Axon Instruments | PClamp 10 - Clampex 및 Clampfit | |
| 마이크로피펫 풀러 | Sutter Instruments | 모델 P-97 | |
| Name< | strong>Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Dissection and Recording Solutions (in mM) | |||
| 세포 내를 제외한 모든 용액은 여과(0.22mm 필터 컵)하고 실온(RT)에서 보관할 때 ~2-3개월 동안 안정적입니다. | |||
| 세포 내 용액을 여과하고(0.2mm 주사기 필터) 동결(-20°C)하여 동결 보관합니다(-20°C; C) 사용 당일에 개별적으로 해동되는 작은 부분 표본에 들어 있습니다. | |||
| 해부/벨소리' s 용액 | 145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 Hepes; pH 7.4 (NaOH 포함) | ||
| 피펫 (세포 내) 기록 용액 | 135 KCl, 10 EGTA 산, 10 HEPES; pH 7.4 (KOH 포함). | ||
| 수조(세포외) 기록 용액/전압 및 전류 클램프 | 125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 Hepes; pH 7.4(NaOH 포함). | ||
| Alexa-594 히드라진 염원 용액. | ddH2O, 부분 표본(~100 µ l)에 저장하고 -20 °C에 저장합니다. 사용을 위해 원액을 피펫 용액으로 132배 희석하여 최종 농도 100mM로 만듭니다. 희석 후 피펫 용액이 포함된 Alexa-594를 필터링합니다 원심분리기 튜브 필터 포함. | ||
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Immobilizing agents | |||
| 0.4% ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)0.2 | M Tris, pH 9 (0.4 g Tricaine/100 mL 0.2 M Tris)에 0.4% 원액을 준비합니다 | ||
| NaOH로 pH를 7로 조정하고 -20°C에서 보관하십시오. | |||
| 사용하려면 배아 배지 | |||
| 250 mM α-bungarotoxin | 하고 ddH2< / sub>O (1 mg / 500 mL)에서 250 mM 스톡을 준비하고 100 µ를 준비합니다. L 분취량, -20 °C에서 소트레. | ||
| 사용하려면 세포 외 용액으로 2,500 배 희석하여 최종 농도 100nM까지 만듭니다. | |||
| 1 mM 테트로도톡신 | ddH2O (1 mg/3 mL)에 1 mM 스톡을 준비하고, 100 &마이크로를 준비합니다. L 분취량, -20 °C에서 소트레. | ||
| 사용을 위해 세포 외 용액으로 2,000배 희석하여 최종 농도 500nM까지 만듭니다. |
참고문헌
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88 (1), 1-13 (1999).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol.
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