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방법 논문

Zebrafish의

11.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55507

⸱

2017년 4월 18일

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Campus (UCAMC), 2Neuroscience Graduate Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus (UCAMC)

이 논문에서

요약

이 원고는 제브라 피쉬 배아 및 유충의 척수 신경 세포에서 전기 생리 녹음하는 방법을 설명합니다. 준비는 현장에서 뉴런을 유지하고 자주 최소 절개를 포함한다. 이 방법은 초기 애벌레 단계를 통해 초기 전기 흥분의 인수, 척추 신경의 다양한 전기 생리학 연구 할 수 있습니다.

초록

먼저 개발 모델로 소개 제브라 피쉬는 다른 많은 분야에서 인기를 얻고있다. 급속히 발전 유기체 많은 수의 양육의 용이성, 배아 광학 선명도와 결합,이 모델의 초기 강력한 속성으로 봉사했다. 지난 20 년 동안,이 모델의 성공은 더 큰 규모의 돌연변이 유발 화면에의 복종 할 의무에 의해 형질 전환의 용이성에 의해 추진되고있다. 최근 유전자 편집 방법은 모델의 힘을 확장했다.

신경 발달 연구, 제브라 피쉬 배아와 유충은 여러 가지 방법이 적용될 수있는 모델을 제공한다. 여기, 우리는 신경 세포, 전기 흥분의 필수 속성의 연구를 할 수 방법에 초점을 맞 춥니 다. 제브라 피쉬의 척수 신경 세포의 전기 생리학 연구를위한 우리의 준비는 기록 챔버에 대한 준비를 확보하기 위해 수의사 봉합 접착제의 사용을 포함한다. 기록을위한 대체 방법제브라 피쉬 배아와 유충 미세한 텅스텐 핀 1, 2, 3, 4, 5를 이용하여 챔버 제조의 부착을 포함한다. 이 최대 4 애벌레의 등쪽 측 장착하기 위해 사용되었지만 텅스텐 핀은 대부분, 횡 방향의 제조를 탑재하기 위해 사용된다. 봉합 접착제는 두 방향에서 배아 및 유충을 장착하는 데 사용되었습니다. 접착제를 사용하여, 최소한의 절개함으로써 얻어진 임의의 손상을 피하기 위해, 효소 처리의 사용없이 척추 신경 접근 할 수 있도록 수행 될 수있다. 그러나 유충의 경우, 척수를 둘러싸고있는 근육 조직을 제거하는 간단한 효소 처리를 적용하는 것이 필요하다. 여기서 설명하는 방법은 여러 가지 developmenta에서 운동 신경,의 interneurons 및 감각 신경 세포의 고유 전기적 특성을 연구하는 데 사용되었다L은 6, 7, 8, 9 스테이지.

서론

조지 스트라이징거 척추 동물의 개발 (10)의 유전 적 분석을위한 모델 시스템으로, 일반적으로 제브라 피쉬로 알려진 다니오 레 리오 (rerio)의 사용을 개척했다. 모델 등 여러 가지 장점을 제공한다 : (1) 상대적으로 간단하고 저렴한 축산을; (2) 체외 수정, 초기 발달 단계에서 배아에 쉽게 액세스 할 수 있도록; 및 (3) 투명 배아가 형성로서 세포, 조직 및 기관의 직접 반복 관측을 허용.

계속되는 년 동안, 여러 진보는 더 제브라 피쉬 모델의 힘을 증가했다. 특히, 앞으로 유전 화면과 전체 게놈 시퀀싱 노력이 많은 발달 과정 11, 12, 13, 14에 돌연변이 중요한 유전자의 식별에 중요한 역할을,"> 15, 16. 게이트웨이 클로닝 방법은 전사 활성 형 (TALENs)로 예시. 유전자의 루틴은 애플리케이션 (17), (18)에 접근 게놈 편집 최근 발전시키고 클러스터 한 정기적 interspaced 짧은 상동 반복 (CRISPR) -Cas9 클레아, 돌연변이의 목표로 도입을 허용뿐만 아니라 노크 아웃 및 노크 인은 (22). 결합은, 이러한 방법은 제브라 피쉬의 특정 행동과 여러 인간의 질병의 기초가되는 유전 적 메커니즘 연구를위한 강력한 모델 만들기, 21, 20, 19에 접근 23, 24, 25, 26, 27.

이 작품은 개발에 초점을 맞추고정신 규제와 신경 발달에 전기 활동의 역할. 초점은 제브라 피쉬 모델은 몇 가지 장점을 제공하는 척수에있다. 첫째, 배아와 애벌레 단계에서 제브라 피쉬에 액세스하는 데 상대적으로 쉽다; 따라서, 하나는 적은 수의 뉴런과 간단한 회로 (28), (29)이 발달 단계에서 척수의 기능을 연구 할 수 있습니다. 또한, 상기 제브라 척수 전사 특성과 구분 패턴에 의해 설명 30, 31, 32, 33, 34, 35 요인으로 다른 척추 유사 신경의 다양한 세트를 갖는다.

척수 회로의 기능을 기초 메커니즘을 발견하는 것을 목표로 제브라 피쉬의 연구의 대부분, 특히운동을 지원 것들, 당연 애벌레 단계 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43에 집중된다. 그러나, 척추 기관차 네트워크를 구성하는 뉴런의 많은 초기 배아 단계에서 분화를 개시 ~ 9-10 시간 후 수정 (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. 이러한 관점에서, 척추 신경 세포의 형태 학적 및 전기적 특성이 발생하고 배아와 애벌레 단계 사이의 변화는 overa 중요하다 이해하는 방법전위의 회로 형성 및 기능의 이해 LL.

여기에 설명 된 해부 방법은 척추 신경 세포에서 패치 클램프 녹음을 허용하고 성공적으로 배아 단계 (~ 17-48 HPF) 및 애벌레 단계 (~ 3~7일 게시물 수정 [DPF])에 적용되고있다. 이 방법은 관심의 뉴런에 대한 액세스를 제공하는 데 필요한 해부의 양을 제한합니다. 프로토콜은 상기 기록 챔버로 배아 또는 유충을 첨부 오히려 미세 텅스텐 핀 대신 사용되는 의사 봉합 접착제에 제브라 척수 뉴런 기록 다른 번역 메소드의 대부분 다르다. 두 개의 서로 다른 접근 방식의 가용성 (즉, 텅스텐 핀 대 봉합 접착제) 전기 생리학 분석을 위해 제브라 피쉬 배아 또는 애벌레를 장착 대체 옵션 연구진은 특정 실험 목표를 달성하기 위해 제공합니다.

첫째, 팝업에서 액세스하고 기록하기위한 절차 차 감각 뉴런의 ulation는 Rohon 수염 - 셀들은 기재되어있다. 이러한 신경 세포의 세포체는 척수 척수 내에서 거짓말. Rohon - 수염 세포는 다수의 척추 동물 종에서 존재하는 초기 개발에서 차별화, 그리고 배아 터치 반응 6, 44, 47, 48의 기초가.

둘째, 액세스 및 척추 운동 뉴런에서 기록 절차의 상세한이다. Zebrafish의 척추 운동 뉴런은 신경의 두 파도 동안 발생한다. 이전 태생 일차 운동 뉴런 hemisegment 45, 46, 49에 따라 본 3-4 일차 운동 뉴런, 낭배 (~ 9-16 HPF)의 단부에서 발생한다. 반면, 보조 운동 신경의 이상 태생 인구는 더 많은입니다 ~ 14 HPF에서 시작, 오랜 기간 동안 발생EF "> 45, 50. 미드 트렁크 세그먼트 보조 운동 신경의 기원은 대부분 (51), HPF (50)에 의해 완성된다. 보조 운동 뉴런은 양막 류 (amniotes)의 운동 뉴런의 대응되는 것으로 간주된다 (46). 흥미롭게도, 척 주상 뉴런이 도파민을 통해 운동을 규제 유충 및 이차 운동 신경 기원 배아 및 어린 유충 50, 51. 초등 운동 뉴런은 각각 여러 가지 아형을 포함한다. 각 일차 운동 뉴런 아형 프로젝트 박힌 결과 특징 근육 그룹 innervates 주변 축색을 축삭 궤도를 식별하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 이차 운동 뉴런 이전 기본 운동 뉴런에 의해 설정된 축삭 통로를 따른다. 따라서, 축삭 궤적에 대해 일차 및 이차 운동 뉴런을 제외하고 유사하다는 축삭 두께 인 somata 크기 A를기본 운동 뉴런 45보다 재.

셋째,의 interneurons의 몇 가지 유형에서 녹화하는 방법이 설명되어 있습니다. 그러나, 이러한 경우, 다른 척수 세포 분리의 제한된 양이 필요하며, 따라서 척추가 Rohon 수염 - 셀 또는 운동 뉴런으로부터 녹화 용 미만 그대로.

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프로토콜

(; 실험 동물 자원의 사무실, 콜로라도 앤 슈츠의 대학 메디컬 캠퍼스 IACUC) 모든 동물의 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. Zebrafish의 축산

  1. 올리고 10 시간 어둠 / 14 시간 표시 등주기 적절한 수처리 교환기 (52)는 28.5 ° C로 성인 제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio))를 유지한다.
  2. 그들이 원하는 스테이지 (예컨대, DPF (2))에 도달 할 때까지 배아 매체에 28.5 ℃, 제브라 피쉬 배아 / 유생 올린다.

해부 재료의 제조 2

  1. 제브라 피쉬의 해부에 대한 접착제 디스펜서
    참고 :이 프로토콜은 기록 챔버로 준비를 부착하는 수의사 봉합 접착제의 사용을 포함한다. 봉합 접착제의 성공적인 사용은 통제 된 방식으로 접착제의 소량의 응용 프로그램이 필요합니다. 접착제는 즉시 강화하기 시작수성 환경 발생. 따라서, 마이크로 피펫에 접착제를 그리고 입에 의해 음 또는 양 압력의인가를 허용하는 홈 메이드 "접착제 디스펜서"을 사용하여 적은 양을 제공한다. 접착제 디스펜서의 중심 부분은 구멍 유리, 붕규산 얇은 벽 유리 모세관 (도 1a)를 포함하는 패키지에 포함되어있는 부분이다. 일단에 구멍이 타 단부는 유리 마이크로 피펫 (도 1)를 유지하면서, 마우스 피스에 유연한 튜브 조각을 통해 연결된다.
    1. 하나 개의 유리 구멍에서 검은 색 전구를 제거하고 다른 유리 구멍 (그림 1B 및 1C)에서 흰색 고무 어댑터로 교체하십시오.
      주 :이 두 어댑터 덮인 유리 보아 작은 직선 프로필렌 피팅 (도 1b, 인셋)를 통해가요 성 튜브의 일부에, 타 단부에서 일 단부에 유리 마이크로 피펫에 연결 가능하고.
      2. <리> ~ 38cm 길이의 유연한 튜브의 일부를 잘라. 유리 구멍에 연결되지 않은가요 성 배관의 단부에 마우스 피스 (예를 들면, 황색 200 μL 마이크로 피펫 팁)을 부착.
      주 : 튜브의 단편은 마이크로 피펫 팁 황색 입안 (도 1D)에있는 동안 해부 하에서 유리 마이크로 피펫을 조작 할 수 있도록 충분히 길어야한다.

figure-protocol-1
도 1 접착제 디스펜서. (AC)는 유리 구멍은 한쪽 끝에서 다른 유리 마이크로 피펫에 유연한 튜브에 연결된다. 고무 어댑터 타단 유리 마이크로 피펫으로, 결국, 배관에 작은 폴리 프로필렌 피팅 (B, 인셋)를 통해 접속 가능하고. (D)은 최종 접착제 디스펜서 (마우스 피스를 가지고 예를 들면, 플라스틱으로 만든TIC 튜브의 일단 피펫 팁) 및 기타 (화살촉 연결된 마이크로 피펫으로 유리 보어).

  1. 해부 기록 / 챔버
    주 : 절개 챔버는 또한 전기 생리학 기록 챔버로서 기능한다. 챔버는 경화 된 실리콘 엘라스토머 (도 2a)의 프리 컷 조각을 사용하여 유리 슬라이드 상에 형성된다.
    1. 상기 실리콘 엘라스토머를 준비 4에서 원추형 플라스틱 튜브베이스와 경화제를 추가하는 방법 : 각각 1 비율.
    2. 철저하게 엘라스토머베이스와 경화제를 혼합하고 두 개의 100mm 배양 접시에 믹스를 부어. 다른 ~ 2.5 mm를 <1 일 배양 접시 및 mm의 두께로 엘라스토머를 붓는다.
    3. 실리콘 엘라스토머가 ~ 4~5일 공기에 노출 치료 할 수 있습니다. 경화 된 엘라스토머 빨리 필요한 경우, 60 ° C에서 배양하여.
    4. 다음 크기로 경화 된 실리콘 엘라스토머의 조각을 잘라 :
      1. ~ 1mm에서두께의 엘라스토머를 경화 ~ 3.8 X 6.3 cm의 직사각형을 잘라; 이 부분은 챔버 (도 2A)의 저부의 역할을한다. ~ 2.5 mm 두께의 경화 된 실리콘으로 직사각형 ~ 3.8 X 6.3 cm를 잘라. 후자의 직사각형에서, 내부 사각형 ~ 2.5 × 5cm 잘라; 결과 프레임은 챔버 (도 2a)의 상부로서 기능한다.
    5. 상기 절개 기록 / 실을 실리콘 유리 (도 2a) 사이에 기포가 확실하게 제거, 유리 슬라이드 (5 × 7.6 cm)의 바로 위에 얇은 실리콘 사각형을 배치한다. 실리콘의 얇은 바닥층 위에 두꺼운 엘라스토머 절단 실리콘 사각형 프레임을 두지.
    6. 실리콘 층이 서로 잘 부착하는 것이 두 층 (도 2a) 사이에 기포가 없음을 확인한다.
    7. 사용 후에는, 하부 실리콘 바닥에서 사각형 두꺼운 실리콘 프레임을 제거하여 챔버를 해체ER 즉 유리 슬라이드에 부착된다. DDH 2 O 사용하기 전에 각각의 기록 세션 후 건조 낮은 린트 와이프와 함께 실리콘 표면을 씻어.
    8. 실리콘의 두 조각 사이에 곰팡이 성장을 방지하기 위해 챔버 건조를 저장합니다.
      주 : 실리콘으로부터 쉽게 헹구어 않을 수 독소 또는 약리학 적 제제를 사용하는 경우, 이러한 목적에 대한 특정 챔버 할애.

figure-protocol-2
그림 2 : 전기 생리학 실 및 해부 도구를 제공합니다. (A) 해부 및 전기 생리 학적 기록에 사용되는 챔버는 프레임 및 웰에 대한 바닥을 제공하기 위해 서로의 상부에, 경화 된 실리콘 엘라스토머의 두 개 위치 적층 된에 유리 슬라이드로 구성된다. 우물의 크기 ~ 2.5 × 5cm는 세포 외 기록 소량 (2-2.5 ㎖)의 사용을 허용해결책. 하부 실리콘 층은 유리에 부착하지 않는 제브라하여 배아 조직 접착제의 안전한 위치 허용한다. (B) 유리 마이크로 피펫 (위) 중에 절개 접착제 전달을 위해 사용된다. 얇은 벽 유리 ~ 75 μm의 직경 팁을 생성 나중에 절단 긴 테이퍼 단부를 만드는 당겨. 테이퍼 유리 마이크로 피펫 흡입의 적용을 통해 접착제로 채워진 전방 접착제 디스펜서 (도 1D, 화살촉)과의 자유 단부에 부착된다. 상기 후뇌의 절개를 위해 피부를 제거하는 데 사용되는 패치 클램프 기록을 위해 사용되는 한 경우와 다른 마이크로 피펫 (하단)에 꺼냈다. 직립 현미경 (C)는, 미세 조작기는 최종 해부 단계의 마이크로 피펫을 기동하는 데 사용됩니다. 유리 마이크로 피펫은, B, 하단과 같이, 전극 홀더 (화살표)에 부착된다. 근육이 제거함으로써 달성된다배기구 (화살촉)에 접속되는 호스를 통해 흡입 pplying. 그 타 단부에 상기 튜브 (별표)의 반대쪽에, 마우스 피스에 부착 호스를 갖는 콕 (흑색 화살표)에 연결된다.

척수 신경에서 패치 클램프 녹음 배아와 유충 3. 해부

figure-protocol-3
그림 3 : 제브라 피쉬의 척수의 등쪽 해부. 후뇌 절개는 (a) 2 DPF 배아 피부 배아 (b)의 좌우 양측에 절단되면 (AA '). 두번째 컷 제에 수직 한 다음 (c)를 수행한다. 다음으로, 피부는 핀셋을 잡고 피부를 끌어낼 수 있도록 마이크로 피펫을 이용하여 올려진다. 피부의 (B)를 제거하여 지느러미 척수를 공개한다. 검은 선에 주동이, 스키N이 제거 된 상기 수막 포함 척수 (별표)의 표면이 노출된다. 피부는 검은 색 선 (화살표)에 그대로 꼬리 남아있다. 유리 마이크로 피펫의 팁 (CC ')는 수막에 가압하고, 신속, 측 방향 이동은 짧은 수막을 관통하도록 수행된다. 이 수막 (DD ')을 관통되면 (DD'및 EE ')는 (두 개의 세그먼트로 수막 찢어 rostrally 이동 마이크로 피펫 고급 및 EE) 인'. Rohon-수염 뉴런의 통상적 인 somata는 수막 (화살표)를 제거하여 나온다. 7 DPF 애벌레 (FG ')는, 근육의 층 Rohon-수염 뉴런에 대한 액세스를 방해하는, 척추의 등 부분을 커버한다. 피부의 제거 후, 유충은 0.05 % 콜라게나로 처리됩니다. (F) 0.05 % 콜라게나 제와 5 분 인큐베이션 결과 너무 엄격과도한 근육 손상, 마모와 근육 (화살표 인셋)에 의해 입증. 선 (F ') 지나친 콜라게나 제 처리는 Tg가 (GFP islet2b)에서의 GFP의 발현으로 여기서 공개 Rohon-수염 뉴런 (화살표)를 손상시킬 수있다. Tg는 (islet2b : GFP) 라인, 후근 신경절 신경 세포는 GFP (화살표)을 표현한다. myotome 형태 (화살표 삽입)을 보존하면서 0.05 % 콜라게나 제와 짧 1 분간 인큐베이션 충분히 근육 (G)를 느슨하게. (G ') 색소 세포가 가장 등쪽 근육층 (화살촉)의 상부에 존재한다. Tg는 (islet2b : GFP)을 (H 및 I) 라인은 Rohon-수염 뉴런 (화살표) 및 척수 신경절 (화살촉) 7 DPF로 GFP를 발현하는 것을 계속한다. Tg가보기 지느러미 2에서 DPF (islet2b GFP) 지브라 피쉬 배아 (H)를D 7 DPF (I). 패널 스케일 바에 = 500㎛ 인; 스케일 바 (패널 B에 도시) 일하면 80 μm의 =; (패널 F에 도시) F '및 G'스케일 바 = 200㎛ 인; (패널 H에 도시) H 및 I = 100 μm의 막대 규모. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. Rohon - 수염 세포에서 레코딩을위한 배아의 해부
    1. 링거 용액 ~ 2-3 ㎖ (도 2a)를 포함하는 박리 챔버 배아를 놓는다. 챔버에 0.4 % tricaine 용액 ~ 100 μL를 첨가하여 배아 고정시킨다.
    2. 사출 마이크로 피펫 (도 2B, 탑) (53)와 유사한 가늘고 긴 선단부를 얻었다 박스 필라멘트를 사용 풀러 마이크로 피펫에 얇은 벽 유리 마이크로 피펫을 당긴다.
    3. 유리 구멍 오에 뽑아 유리 마이크로 피펫을 첨부접착제 디스펜서 F. 끝이되도록 해부 현미경에서 사용 핀셋 ~ 75 μm의 (그림 2B, 위) 유리 마이크로 피펫의 팁을 깰.
      주 : 팁 크기가 부압 (구강 흡입)의인가를 통해 선단부에 접착제의 효율적인 로딩을 허용 할만큼 충분히 커야한다 마이크로 피펫을 전면 기입하지만, 정압 통한 접착제의 정확한 적용을 허용하기에 충분히 작은 .
    4. 마우스 피스를 통해 흡입함으로써 접착제 ~ 3-5 μL와 유리 마이크로 피펫을로드. 해부 챔버 접착제 충진 팁을 준비한다.
      참고 : 접착제와 마이크로 피펫을 작성 강한 흡입을 필요로한다. 마이크로 피펫 약한 흡입 빠르게 채워지면 끝이 너무 큽니다.
    5. 기록 챔버 (도 3a 및도 3a ')의 배아로; 태아와 어린 유충 (≤72 HPF)에서 녹음을 위해, 근육 조직을 제거 할 필요가 없다.
    6. 가져오다입구 튜브를 통해 마이크로 피펫에 약간의 정압을 유지하면서 배아 / 애벌레의 헤드 근처 풀로드 마이크로 피펫의 팁 (수용액의 유입을 방지하기 위해). 선단이 태아의 머리 근처되면, 상기 챔버의 하부에 접착제의 작은 방울을 배출하기에 충분한 양의 압력을 적용한다.
      주 : 접착제 수용액과 접촉 회 경화하므로 적용되고 상기 박리 액에 배치 온화한 양압을 유지하는 것이 중요하다.
    7. 머리는 접착제와 접촉하도록 접착제의 드롭으로 배아 / 애벌레를 이동 해부 핀 도구를 사용합니다. 접착제와 좋은 접촉을 보장하기 위해 머리에 배아 최대 지느러미 쪽을 누르의 방향을.
    8. 접착제 천천히 경화 같이, 그 아래 등쪽 측을 위로 복부 측 놓 이도록 배아 / 애벌레 위치를 다시 해부 핀을 사용한다. 접착제의 드롭에 해부 핀 도구를 찍어 이상하고 머리를 가로 질러 접착제의 스레드를 그릴배아의 자세한 위치를 고정합니다.
      참고 : Tricaine는 접착제가 경화되는 속도를 속도가 빨라집니다. 접착제 작업에 더 많은 시간을 허용하려면, 배아 / 애벌레를 고정하는 데 필요한 tricaine의 최소 금액을 사용합니다. 또한, 경화 속도는 접착제의 다른 많은 다를 수 있습니다. 접착제의 새로운 배치를 사용하는 경우 따라서, 절개 사용하기 전에 경화의 비율을 확인.
    9. 헤드 안전하게 실리콘에 부착되어 상기 접착제가 고화되면 다른 유리 마이크로 피펫와 후뇌 수준에서 절개하여 배아 / 애벌레 희생 (도 3A-A 및 4A- a).
      참고 : 후뇌 절개는 인도적인 동물의 희생을 여기에 사용되는 방법이다. 그러나, 실험적인 목표에 따라 (예를 들어, 가상의 수영의 연구는) 다른 방법이 필요할 수 있습니다.
    10. 챔버에 꼬리를 장착하기 전에 트렁크으로부터 피부를 제거합니다.
      1. 용도새로운 유리 마이크로 피펫 (도 2B, 바닥) 피상적 후뇌 (도 3A-B와 4A-의 b)에 위치 꼬리의 피부를 여러 번 절단한다. 피어스 피부 표면적 등쪽에 대한 트렁크의 각각의 측면에 rostro - 꼬리 축에 수직 피펫을 이동시킴으로써 (도 3A-나) 시료를 장착 또는 횡 장착 시험편 (도 4A-의 b)에 대한 트렁크의 노출 측.
    11. 잡아 핀셋 스킨의 플랩을 만들려면 레벨에서 수직으로 단계 3.1.10.1 (도 3A-C 및 4A- 온도)의 초기 잘라 피부에 마이크로 피펫으로 수회 긁어.
    12. 핀셋을 사용하여, 점차적으로 피부 플랩을 들어 올려 꼬리 쪽 피부를 당겨.
      참고 :이 종종 트렁크에서 피부 전체의 제거가 발생합니다. 그러나, someti입니다MES는 필요한 반복 수행 스크래핑하고 피부의 당김으로써 여러 부분에서 피부를 제거한다. 일부 애플리케이션의 경우, 피부의 부분적 제거는이자 (도 3B 및 4B)의 척수 부분에 충분한 액세스를 허용 할 수있다.
    13. 배아 / 애벌레의 꼬리 근처 접착제의 작은 방울을 제공합니다. 해부 실의 바닥에 꼬리를 부착하기 위해 접착제를 사용합니다. 접착제가 경화로이 단계에서, 트렁크는 유지 등쪽 배향가 완전히 챔버에 연결되어 있는지 확인하기 위해 해부 핀 도구 트렁크의 위치를 ​​조정한다.
    14. 초기 해부에 따라, tricaine와 파편을 제거하는 링어의 솔루션을 광범위하게 준비를 씻어. 준비는 ~ 5 분 동안 휴식을 허용합니다.
    15. 세포 외 기록 용액으로 해부 솔루션을 교체합니다. 필요한 경우, (준비에 고정화 에이전트를 추가 예., α-bungarotoxin [최종 conce을1 μM의 ntration).
      참고 : 1 μM의 α-bungarotoxin 30 분 ~ 내 1 배아 DPF 2를 고정시킨다. 나이 유충의 경우, α-bungarotoxin의 높은 농도가 필요할 수 있습니다. α-bungarotoxin은 전형적으로 1 시간의 기간 내에서 수행되고 기록 중에 욕 용액에 유지된다. 코발트와 같은 이가 양이온을 포함 기록 솔루션은 고정화 화제의 첨가를 필요로하지 않는다. (1 시간 이상) 연장 된 기록 기간을 필요로하는 실험에서, 제제는 0.5 ㎖ / 분의 속도로 조 용액으로 관류된다.
    16. 40 배의 물에 침지 긴 작동 거리 목적 갖춘 직립 화합물 현미경의 스테이지에 탑재 된 배아와 해부 실 이동.
      참고 :이 현미경은 녹음이 수행 될 장비의 일부입니다. 리그 headstage 또한, 패치 클램프 증폭기, 미세 조작기, 데이터 취득 / 컴퓨터 시스템 (도 2c 갖추어져 야).
    17. headstage (도 2B, 2C 및 아래쪽 화살표)의 전극 홀더에 빈 두꺼운 벽 붕규산 유리 마이크로 피펫을 탑재. 호스 연결 (0.16 cm, 외경 : 0.32 cm, 길이 : 내경 90 ~ cm)를 전극 홀더 (화살촉)의 배기구 일단하고 (도 2c 삼원 콕에 타단 검은 색 화살표).
      1. (~ 길이 60 ~ 70 센티미터) 튜브의 또 다른 조각의 한쪽 끝에서 마우스 피스를 놓고 다른 쪽 끝 (그림 2C, 블랙 별표)에서 세 방향 꼭지에 연결합니다.
        주 :이 배관 시스템은 시일 형성시, 기록 피펫 내부에 양극과 음극 압력의 적용을 허용한다.
    18. 척수의 대부분의 지느러미 부분에 마이크로 피펫 팁을 가지고 부드럽게 수막을 뚫고. 신속과에 따라, 짧고 옆으로 움직임이 화장실하기센 수막 (도 3c 및도 3c를 ').
    19. 마이크로 피펫의 선단이 수막을 통과 한 후, 전진 거리 및 척수 (도 3D 및 3D ')의 수막을 끌어 마이크로 피펫을 올린다.
    20. Rohon 수염 - 셀 (도 3E 및도 3e ')을 노출시키기 위해 1-2 hemisegments 통해 전진 rostrally 마이크로 피펫을 이동.
      참고 : 몇 Rohon - 수염 세포를 노출하는 데 필요한 수막의 최소 금액을 해부하다. 각각의 기록 후, 절개 부가 더 Rohon-수염 세포를 나타 내기 위해 수행된다. 모두 배아 및 유충에서 Rohon - 수염 뉴런은 때때로 패치 마이크로 피펫과 접촉시 폭발 할 수 있습니다. 다른 척수 신경이는 자신의 mechanosensitivity로 Rohon - 수염 세포의 독특한 특성을 반영 할 수 있음을 시사한다, 이런 식으로 작동하지 않습니다. 이지지 여러 용액 조성물 (예, 이온 성 구성 요소및 삼투압)을 시험하고, 없음 Rohon-수염 셀이 문제를 방지 없다.
  2. Rohon - 수염 세포에서 레코딩을위한 유충의 해부
    참고 : 7 DPF 유충에서 지느러미 척추를 둘러싼 근육을 제거해야합니다. 단계 3.1.15에 따라 3.1.1 효소로 처리 전 (배아 치환 유충으로).
    1. 근육을 제거하고, 1 분 동안 0.05 % 콜라게나 제와 배양 유충.
    2. 링거액과 함께 준비 ~ 5 회 세척하여 콜라겐을 제거합니다. 완전히 콜라겐을 제거하는 세포 외 액의 5 ~와 헹굼을 따르십시오.
    3. 녹화 장비의 현미경의 무대에서 기록 챔버를 장착 한 후 절개의 나머지 부분을 수행합니다. 전극 홀더에 붕규산 두꺼운 벽 패치 마이크로 피펫 (도 2B, 바닥)를 부착하고 부드럽게 하단 대조를 칫솔질하여, 마이크로 피펫의 선단을 깰실리콘 챔버.
    4. 멀리 근육을 애타게 등쪽 척수를 노출 약간 깨진 마이크로 피펫을 사용합니다. 제조에서 근육 섬유를 분리하기 위해, 상기 전극 홀더 출구에 연결된 호스를 통해 흡인을 적용한다. 흡입을 적용하는 동안 근육 섬유의 길이를 따라 마이크로 피펫을 이동 미세 조작기를 사용합니다.
      참고 : 목표는 첫째 기계적으로 근육을 느슨하게하는 마이크로 피펫을 사용하고 멀리 빨아 개별 근육 섬유를 제거합니다. 때때로, 근육의 제거 중에 마이크로 피펫은 흡입 된 조직들로 가득 찼어된다.
      1. 챔버의 바닥에 대해 마이크로 피펫을 브러시 내용을 추방하기 위해 튜브를 통해 공기를 불어 동안 약간의 팁을 끊는 마이크로 피펫을 방해를 없애기합니다.
        참고 : 마이크로 피펫 팁의 크기가 지나치게 커지면, 새로운 마이크로 피펫이 필요할 수 있습니다. 근육 층 (CL)을 제거 할 때, 마이크로 피펫 팁의 크기가 더 중요척수 또는 수막을 (소형 마이크로 피펫 팁을 더 제어 작업을 허용) 주변의 막에 osest.
    5. 단계 바와 같은 수막을 제거 3.1.18-3.1.20 새로운 마이크로 피펫 (도 2B, 바닥)을 사용.

figure-protocol-4
그림 4 : 제브라 피쉬의 척수의 측면 해부. 측면 방향으로 제브라 피쉬 배아를 장착하면 운동 신경에 대한 액세스를 용이하게합니다. 모터 신경을 노출 근육 수막의 박리 제거는 40X 물 침지 목적으로 구성된 수직 현미경 하에서 수행된다 (도 2 참조). (A) 운동 신경 세포체는 척수 내 복부 측 방향으로 위치한다. 자신의 등쪽이 전극 홀더에 대향하도록 배아 챔버에 부착된다.은 (별표)를 견고하게되면 봉합 접착제 흰색 표시합니다. 후뇌 (a)는 횡단되면, 피부는 유리 마이크로 피펫을 사용하여 후뇌에 사이트 (b)의 꼬리에 피상적으로 여러 번 잘라입니다. 첫 번째 세트에 수직 한 표면 부가 컷 (c)는, (b), 핀셋 피부의 제거 잡을 수있는 피부 탭을 형성한다. (BG) 빈 유리 마이크로 피펫이 짧은 테이퍼 팁 (도 2B, 바닥)에 인출 전극 홀더에 부착된다. 마이크로 피펫은 후속 미세 해부 및 근육 조직의 제거를위한 미세 조작기를 사용 였는데된다. (B) 유리 마이크로 피펫의 선단 제 부드럽게 챔버의 저부에 대해 그것을 칫솔질 톱니 끝과 끝 큰 직경을 만들어 다소 세분화된다. 흡입이인가 된 상태에서 마이크로 피펫은 근육 섬유의 길이를 따라 이동한다. 근육 섬유는 하나 개의 층을 제거한 번에 기본 수막의 중단을 방지합니다. 이러한 얇은 경향 배아 가장 척수 근육 층이 먼저 제거된다. 피부는 더 꼬리 hemisegments (화살표)에서 제거되지 않습니다. (C) hemisegment 하나의 근육의 등 반 (화살표)을 제거하고있다. (D)은 검은 줄 척수 (별표)를 덮는 그대로 수막 가진 근섬유 하나도 없어도 hemisegment를 구별. 마이크로 피펫 (EE ')는, 압력이 약간 운동 신경 인 somata 배측 위치에 수막이인가된다. 마이크로 피펫의 빠른, 짧은 측면 움직임은 수막의 관통로 이어집니다. (FF ')는 마이크로 피펫 hemisegment의 복부 측면을 향해 전진 복부 및 신경 조직으로부터 분리 수막을 해제한다. (GG ')는 수막의 길이를 따라 rostrally 마이크로 피펫을 이동시킴으로써 횡단되고hemisegment. 뉴런은 즉시 노출 된 척수에서 나오는 지금 패치 전극 (화살표)에 액세스 할 수 있습니다. 스케일 바 = (A) 500 ㎛의; 스케일 바 = (패널 B에 도시)에서 100 μm의 BG.

  1. 운동 신경과 interneuron 녹음을위한 배아의 해부
    1. 링거액을 함유하는 박리 챔버 내의 배아를 넣고 단계 3.1.1 에서처럼 tricaine와 배아를 고정시킨다.
    2. 그 등쪽 사용자에 대해 최적 인 상기 챔버의 측면을 향하도록 측 방향 배아 마운트 (전형적 선성에 의존한다). 단계에 따라 3.1.2-3.1.17 및 배아 실리콘 (도 4A 및 4A ')에 대해 평면 유지되도록.
    3. 3.2.4-3.2.4.1 (도 4b를 ~ 25 ㎛의은 긁어하는 세분화 된 팁 붕규산 두꺼운 벽을 마이크로 피펫을 사용하여 얻어 근육 흡입 단계에 기재된 바와 같이, 수막이 노출 - <강한> 4D).
    4. 근육 층이자 (도 4d)의 hemisegment (들)로부터 제거되면, 온전한 팁 (도 2B, 바닥)가 새 것으로 유리 마이크로 피펫을 대체. 표적 뉴런 지느러미 인 위치에 수막 천공. 미세 조작기를 사용하여, 수막에 마이크로 피펫을 푸시하고 찢어 수막 (도 4E 및도 4e ')을 횡단하는 가로 신속히 이동.
    5. 수막 파열되면, 전진 거리 및 척수 (도 4F 및도 4f ')의 수막을 리프트 마이크로 피펫을 올린다. hemisegment (도 4G 및 4G ')의 길이를 따라 막 찢어 rostrally 마이크로 피펫을 이동.
      참고 : Rohon - 수염 세포와 일차 운동 뉴런에서 녹음의 경우, 해부는 immediat에서 떨어져 수막을 삭제 제한됩니다즉 대상 영역. 대조적으로, 보조의 interneurons 및 운동 뉴런의 녹화를 들어, 관심있는 셀에 대한 액세스를 방해 척수 내의 뉴런을 제거 할 필요가있다. 후자의 경우에는 척수 회로의 광범위한 파열로 인해 연구 극한 막의 전기 특성의 분석에 한정된다.

척수 신경 세포에서 4. 전기 생리 녹음

  1. 피펫 용액 (도 2B, 하)로 채워진 경우 Rohon 수염 - 세포 및 운동 뉴런의 레코딩을위한 ~ 3 MΩ의 저항을 뽑아 붕규산 두꺼운 벽 유리 모세관을 사용한다.
    1. 앞서 용기에 마이크로 피펫에 침지 전극 홀더에 연결된 배관을 통해 부드럽게 불어 양압을 적용한다.
      주 : 정압 마이크로 피펫 팁 막힘 파편을 방지하고, 오프 (P)에 삼방 콕을 돌려 유지osition. 일단 타겟 신경 근처 양압 세포막, 마이크로 피펫 시일 형성을 개시하기에 충분히 가깝다 유용한 지표의 독특한 압입 될 것이다.
    2. 마우스 피스를 통해 추가의 광 흡수를인가하면서 개방 위치로 밸브 마개를 돌리면 정압 릴리스.
    3. 세포막 및 마이크로 피펫 팁 사이 GΩ 시일의 형성 후, 막 파열 전체 셀 구성을 달성하기 위해 흡입 짧은 펄스를 적용한다.
    4. 입력 저항 (500) 및 액세스 MΩ 저항 10 MΩ으로 안정한 전체 셀 구성을 설정 한 후에, 어느 전압 - 전류 클램프 모드에서 기록을 얻었다.

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결과

우리가 성공적 유충 DPF 1-7 17 개 HPF 배아 Rohon-수염 뉴런에서 기록했다 (도 5a 및도 5b). Rohon-수염 셀이 기록 된 경우, 제제는 등쪽 측까지 장착 하였다. 이러한 장착은 등쪽 표면 위치와 큰 소마 크기에 기초 Rohon 수염 - 셀의 명확한 식별을 허용한다. 식별 추가적으로 이러한 뉴런의 전형적인 과분극 휴지 막 전위 (도 5, 삽입 테이블) (6), (54)에 의해 확인된다. 또한, 차 감각 뉴런 같은 수염 - Rohon 뉴런의 시냅스 입력 부족하다. 전류 클램프 모드 (도 5B ')에 기록하는 동안 따라서, 전기적 자극의 부재 하에서, 막 전위의 변경이 발생하지 않는 것이다. Rohon 수...

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토론

여기에 설명 된 방법은 척수의 최소 절개 후 제브라 배아 감각 뉴런과 모터의 전기적 특성과 형태 학적 허용한다. 뉴런은 적어도 1 시간이 기록에 부과 된 시간 제한에 대한 건강을 유지. 뉴런은 표준 전체 셀 구성을 사용하여 기록 된뿐만 아니라 핵 패치에서 같은; 후자의 방법은, 이온 전류 (9)의 상세한 생물 물리학 연구를 배제 할 공간 클램프 문제를 최소화한다.

중요한 도전은 피부를 제거하고 관심의 뉴런에 대한 액세스를 제공하는 데 필요한 제한 해부을 수행하기 위해 챔버에 배아 또는 유충의 확고한 첨부 파일을 달성하는 것입니다. 제조는 적절한 전체 셀 패치 - 클램프 방법을위한 기록 챔버에 고정 할 필요가있다. 수의사 봉합 접착제의 사용을 통해이 문제를 충족하는 방법은 배아 또는 유충에 첨부하기해부 / 기록 챔버, 여기서 다른 모델 유기체의 박리에 사용 된 접근법 (예를 들어 초파리)

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 (ABR에 RLM 및 R01NS25217 및 P30NS048154에 F32 NS059120)에 NIH 보조금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
진공 필터/보관 병, 0.22 mm 포어Corning431096
주사기 필터 0.2 mmWhatman6780-2502
TricaineSigmaA-5040Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt 
&알파;-부가로톡신토크리스11032-79-4
테트로도톡신토크리스4368-28-9
알렉사-549 히드라진 염분자 프로브A-10438형광 염료
스핀-X 원심분리기 튜브 필터코닝8161
유리 현미경 슬라이드피셔12-550C
실가드 실리콘 엘라스토머 키트Dow Corning184실리콘 엘라스토머
페트리 접시Falcon351029
붕규산 유리 모세관Harvard Apparatus30-00380.78 및 1.0mm의 내부 및 외부 직경(얇은 벽 유리 모세관)
붕규산 유리 모세관Drummond Scientific1-000-1000-1001.13 및 1.55 mm의 내부 및 외부 직경 (두꺼운 벽 유리 모세관)
미니어처 가시 폴리프로필렌 피팅 Cole-Palmer6365-90
Vetbond 티슈 접착제 3M1469SB
Collagenase XISigmaC7657
마이크로전극 풀러셔터 기기  모델 P-97 
증폭기분자 장치Axopatch 200B
헤드 스테이지분자 장치CV203BU
전동 마이크로 매니퓰레이터   Sutter InstrumentsMP-285
Tygon 튜빙Fisher14-169-1BID 1/16 IN, OD 1/8 IN 및 WALL 1/32 IN (유연한 실험실 튜빙)
전극 홀더분자 장치1-HC-U
Pharmaseal 삼방향 스톱콕 BaxterK75
디지타이저Axon InstrumentsDigidata 1440A
도립 현미경 ZeissAxioskop2 FS plus
40X/0.80W Achroplan 대물렌즈 Zeiss
데이터 수집 및 분석 소프트웨어 Axon InstrumentsPClamp 10 - Clampex 및 Clampfit 
마이크로피펫 풀러Sutter Instruments모델 P-97
Name<strong>Company카탈로그 번호Comments
Dissection and Recording Solutions (in mM)
세포 내를 제외한 모든 용액은 여과(0.22mm 필터 컵)하고 실온(RT)에서 보관할 때 ~2-3개월 동안 안정적입니다.
세포 내 용액을 여과하고(0.2mm 주사기 필터) 동결(-20°C)하여 동결 보관합니다(-20°C; C) 사용 당일에 개별적으로 해동되는 작은 부분 표본에 들어 있습니다. 
해부/벨소리' s 용액145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 Hepes; pH 7.4 (NaOH 포함)
피펫 (세포 내) 기록 용액135 KCl, 10 EGTA 산, 10 HEPES; pH 7.4 (KOH 포함).
수조(세포외) 기록 용액/전압 및 전류 클램프125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 Hepes; pH 7.4(NaOH 포함).
Alexa-594 히드라진 염원 용액. ddH2O, 부분 표본(~100 µ l)에 저장하고 -20 °C에 저장합니다. 사용을 위해 원액을 피펫 용액으로 132배 희석하여 최종 농도 100mM로 만듭니다. 희석 후 피펫 용액이 포함된 Alexa-594를 필터링합니다  원심분리기 튜브 필터 포함.
NameCompany카탈로그 번호Comments
Immobilizing agents
0.4% ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)0.2M Tris, pH 9 (0.4 g Tricaine/100 mL 0.2 M Tris)에 0.4% 원액을 준비합니다
NaOH로 pH를 7로 조정하고 -20°C에서 보관하십시오.
사용하려면 배아 배지
250 mM α-bungarotoxin하고 ddH2< / sub>O (1 mg / 500 mL)에서 250 mM 스톡을 준비하고 100 µ를 준비합니다. L 분취량, -20 °C에서 소트레.
사용하려면 세포 외 용액으로 2,500 배 희석하여 최종 농도 100nM까지 만듭니다.
1 mM 테트로도톡신ddH2O (1 mg/3 mL)에 1 mM 스톡을 준비하고, 100 &마이크로를 준비합니다. L 분취량, -20 °C에서 소트레.
사용을 위해 세포 외 용액으로 2,000배 희석하여 최종 농도 500nM까지 만듭니다.
.에서 스톡 용액을 ~ 25 배 희석

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