이 보고서는 저압 진공을 사용하여 생물학 연구를 위한 세포와 기질로 미세유체 채널을 채우는 간단하고 수행하기 쉬운 기술을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
기질 및 세포 패터닝 기술은 세포 생물학에서 세포 간 및 세포 간 및 세포 간 상호 작용을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 기존의 패터닝 기술은 단순한 모양, 작은 영역 및 선택한 바이오 재료에서만 잘 작동합니다. 이 기사에서는 음압을 사용하여 세포 현탁액과 기질 용액을 복잡하고 긴 폐쇄형(막다른 골목) 폴리디메틸실록산(PDMS) 마이크로 채널로 분배하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 통해 연구원들은 피브로넥틴, 콜라겐, 항체(Sal-1), 폴리-D-라이신(PDL) 및 라미닌을 포함한 여러 기질을 패턴화할 수 있습니다. 기질의 패터닝을 통해 다양한 세포를 간접적으로 패터닝할 수 있습니다. 우리는 C2C12 근아세포, PC12 신경 세포주, 배아 쥐 피질 뉴런 및 양서류 망막 뉴런을 테스트했습니다. 또한, 우리는 이 기술이 세포 현탁액에 저진공을 간단히 적용하여 미세유체 채널에서 섬유아세포를 직접 패턴화할 수 있음을 보여줍니다. 저진공은 세포 생존율 분석에서 나타난 바와 같이 세포 생존율을 크게 감소시키지 않습니다. 다른 세포 및 기질 유형에 대한 방법의 적용에 대한 수정이 논의됩니다. 이 기술을 통해 연구원들은 이국적인 재료나 장비 없이 세포와 단백질을 특정 패턴으로 패턴화할 수 있으며 진공이 있는 모든 실험실에서 수행할 수 있습니다.
서론
조직 공학 및 바이오 센서에서는 μm의 규모 단백질 및 세포의 공간 조직을 제어하는 능력은, 마지막 네 수십 1, 2, 3 위로 갈수록 중요 해지고있다. 단백질 및 세포의 정확한 공간적 조직 연구자들은 세포 증식을 유도하고, 바이오 센서 4, 5, 6, 7, 8의 제조에 생체 분자를 고정하기 위해, 세포의 유사하거나 또는 상이한 유형을 포함하는 셀과 기판 사이의 상호 작용을 조사 할 수있다 9.
패터닝 단백질의 현재의 방법은 포토 패터닝 및 마이크로 콘택트 인쇄를 포함한다. 포토 패터닝은 ultr에 노출시 가교 감광 재료를 사용바이올렛 (UV) 빛. (UV 광 투과를 방지하는 어두운 영역과 투명 영역으로 구성된) 포토 마스크....
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프로토콜
참고 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 프로토콜에서 사용되는 화학 물질 중 일부는 독성 및 발암 성이다. 독성 또는 산 / 염기 재료를 사용하는 경우 모든 적절한 안전 사례 (흄 후드, 글러브 박스) 및 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발)를 사용하십시오.
소프트 리소그래피 사용하여 포토 리소그래피를위한 마스터 금형 1. 제작
- 컴퓨터 지원 설계 (CAD)의 그리기 도구를 사용하여 마이크로 채널의 레이아웃을 그린다.
- 레이저 마스크 작가를 사용하여 빈 마스크 판에 레이아웃을 인쇄합니다.
- 어떠한 용매는 웨이퍼 상에 남지 않도록 질소 공기 총 이소프로판올 건조한 다음, 아세톤으로 4 인치 실리콘 웨이퍼를 헹군다.
- 5 분 동안 200 ℃에서 핫 플레이트로 소성하여 웨이퍼 탈수.
- 마이크로 채널의 원하는 높이에 대한 설계 네가티브 포토 레지스트를 선택합니다. 에프또는 예를 들어, 50 ㎛의 높이와 미세 채널을 얻었다 네가티브 포토 레지스트 SU-8 (50)를 사용한다.
- 웨이퍼를 실온까지 냉각되도록 한 후, 스핀 코터의 척 상에 웨이퍼를 정렬. <....
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결과
이 방법은 단백질 및 마스터 주형이 이루어지면 거의 모든 생물 실험실에서 10 μm의 가능한 장비 한 작은 치수 데드 엔드 미세 유체 채널을 사용하여 세포의 간접 패터닝의 패터닝을 허용한다. 이 기술은 기존의 소프트 리소그래피, 또는 접착 테이프의 제작 (도 1) (28) (29)로 작성된 PDMS 미세 유체 채널을 사용하여 생성 된 PDMS 미세 유체 채널을 이용할 수있다. 우리는 이전에 광 수용체 4 (30)의 축삭지도의 평가를위한 신경 세포의 간접 패턴이 절차의 사용을 증명하고, 지금은 다양한 기원의 몇 가지 추가 세포 유형에 사용을 증명하고있다. 폴리 - D - 라이신 (PDL)에 패턴 배아 쥐의 대뇌 피질의 뉴런과 라미닌 .......
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토론
기존의 포토 리소그래피 소프트 리소그래피, 장비, 재료 및 기존의 포토 리소그래피를 사용하는 데 필요한 기술을위한 금형 제작을위한 잘 확립 된 기술이지만 대부분의 실험실에 쉽게 사용할 수 없습니다. 이 자원에 대한 접근없이 실험실을 위해, 우리는 마이크로 유체 장치를위한 비교적 단순한 기능 주형을 만드는 방법으로 접착 테이프 제조를 제시 하였다. 이 방법은 어떤 기관이 작성하고 쉽게 사용할 수있는 도구와 연구 목적을위한 미세 유체 장치를 이용 할 수 있습니다. 접착 테이프 방식은 저비용 데스크탑 비닐 커터 (31)로 개선 될 수있다. 화상 비닐 커터 재현성, 해상도뿐만 아니라 레이아웃 복잡도를 증가시킬 수있다. 이러한 옵션, 기존의 포토 리소그래피, 바탕 화면 절단기, 또는 접착 테이프 제조의 각 신중 충분하다 어떤 방법을 고려해야합니다 서로 다른 기능과 제한 사항 및 연구자를그들의 필요합니다.
경화 PDMS에, 디메틸 실록산의 긴 .......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구를위한 자금 조달이 (FHK에) 척수 연구 (NJCSCR)에 뉴저지위원회에 의해 제공되었다 (BLF에) CSCR14IRG005을 부여 NIH는 (CHC에) R15NS087501 및 (ETA까지) FM 커비 재단을 부여합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| CorelDRAW X4 CAD 도면 도구 | Corel Corporation, Canada | X4 버전 14.0.0.701 | 미세 유체 장치의 레이아웃을 그리는 데 사용되는 CAD 도구 |
| 레이저 프린터 HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | 접착 테이프 기법을 위한 미세 유체 장치의 레이아웃을 인쇄하는 데 사용 |
| Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | PDMS 혼합물 |
| 을 탈기하는 데 사용됩니다.접착 스카치 테이프 | 3M 제품, MN | 테이프 600 | 접착 테이프 Master |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | 주조 폴리머 |
| 페트리 접시 | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | 주조를 위해 금형을 유지하는 데 사용 |
| (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976 # 11 | PDMS를 절단하는 데 사용 |
| 핀셋 | Ted Pella, CA | 5627-07 | 유리 슬라이드를 벗기는 동안 PDMS 캐스트를 처리하는 데 사용 |
| Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | 를 패턴화하는 표면으로 사용 | |
| Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | ||
| 를 패턴화하는 표면으로 사용기포를 가두지 않고 유리에 접착 테이프를 부착하는 데 사용 | |||
| 레이저 마스크 라이터 | Heidelberg Instruments, 독일 | DWL66fs | 포토리소그래피 제조 공정에 사용되는 석영 마스크 제작에 사용 |
| EVG Mask Aligner(포토리소그래피 UV 노출 도구) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | 포토레지스트를 자외선에 노출시키는 데 사용 |
| Spin Coater | Headway Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | 실리콘 웨이퍼의 포토레지스트를 스핀 코팅하는 데 사용 |
| 포토레지스트 SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | 금형 제작에 사용되는 네거티브 포토레지스트 |
| SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | 포토레지스트 개발자 |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | PDMS 접착을 피하기 위한 코팅 금형 |
| 이소프로판올 | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | 세척 용매 |
| 에탄올 | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | 살균 용매 |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL 용액은 사붕산나트륨 완충액 |
| 라미닌 | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | 에서 0.1mg/mL로 만들어집니다.라미닌은 10 µ로 분주되었습니다. L 분취 및 20 µ로 희석; g/&마이크로; L 사용 전 PBS |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | 세포 배양 |
| C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | C2C12 패터닝 |
| PC12 세포주 | ATCC, VA | CRL-1721 | PC12 패터닝 |
| 콜라겐 유형 1, 쥐 꼬리 | BD Biosciences | 40236 | 세포 배양 |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | 세포 배양 |
| 말 혈청, 열 비활성화 | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | 세포 배양 |
| 팔로이딘-테트라메틸로다민 B 이소티오시아네이트(TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | 세포 라벨링 |
| Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | 세포 생존력 분석 |
| 생검 홀 펀치 | Ted Pella, CA | 15110-10 | PDMS에 천공된 구멍 |
참고문헌
- Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
- Lin, R. Z., Ho, C. T., Liu, C. H., Chang, H. Y. Dielectrophoresis based-cell patterning for tissue engineering. Biotechnol J<....
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