우리는 해부, 고정, 스테로이드 호르몬 생합성과 규제 메커니즘을 연구하는 초파리 유충과 성인 여성의 steroidogenic 장기의 면역 염색을위한 프로토콜을 설명합니다. steroidogenic 기관뿐만 아니라, 우리는 배아 줄기 세포로 steroidogenic 기관의 신경 분포뿐만 아니라 steroidogenic 표적 세포를 시각화.
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방법 논문
과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
다세포 생물에있어서, 세포의 작은 그룹은 성장과 재생에 대한 조직 반응을 유도하는 그들의 생물학적 활성의 특수한 기능을 부여한다. 곤충, 애벌레 prothoracic 글 랜드 (PG) 및 ecdysteroids라는 주요 스테로이드 호르몬 생합성에있는 성인 여성의 난소 플레이 필수적인 역할. 이러한 기관은 ecdysteroidogenic 생합성 타이밍 큐 환경에 의해 영향을 받는다되는 신경계에서 신경 지배된다. 여기에서 우리는 스테로이드 호르몬 생합성과 규제 메커니즘을 연구하기위한 적절한 모델 시스템을 제공 초파리 melanogaster의를 비행 ecdysteroidogenic 기관과 유충에서의 대화 형 기관과 과일의 성인을 시각화하는 프로토콜을 설명합니다. 숙련 된 해부은 우리가 뇌, 복부 신경 코드 및 다른 조직을 포함하여 ecdysteroidogenic 기관의 위치와 그들의 상호 작용하는 기관을 유지할 수 있습니다. 로모그래퍼 면역 염색ecdysteroidogenic 효소에 대한 ntibodies는 조직 - 특이 적 프로모터에 의해 구동 형질 전환 형광 단백질과 함께 ecdysteroidogenic 세포를 레이블을 사용할 수 있습니다. 또한, ecdysteroidogenic 기관의 신경 밀도는 특정 항체 또는 신경의 여러 유형에 GAL4 드라이버의 집합으로 분류 될 수있다. 따라서 ecdysteroidogenic 기관과 신경 세포의 연결은 면역 염색 및 형질 전환 기술에 의해 동시에 시각화 할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 누구의 증식과 유지 보수 ecdysteroids에 의해 제어되는 배아 줄기 세포를 시각화하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 스테로이드 호르몬 생합성과 신경 규제 메커니즘의 포괄적 인 이해에 기여한다.
서론
다세포 생물에서는 세포의 그룹은 몸 전체에 필수적인 그들의 생체 활동의 전문 기능을 부여한다. 자신의 임무를 완수하기 위해 각 조직이나 기관의 기능과 관련된 유전자의 일련의 표현과 발전의 맥락에서 자신의 활동을 조율하기 위해 다른 조직과 통신한다. 이러한 전문적인 세포 기능과 간 장기 상호 작용을 특성화하기 위해, 우리는 다른 종류의 세포가 다세포 구조에서 그대로 유지되고 함께 세포의 그룹을 지정해야합니다.
이러한 전문 기관의 한 예는 많은 생합성 효소가 활성화 스테로이드 호르몬 1 콜레스테롤에서 변환 단계를 중재 steroidogenic 기관이다. 이러한 효소 유전자의 대부분은 기관 steroidogenic 구체적으로 표현되고, 생합성 경로 단단히 체액 입력 및 신경 입력을 통해 다수의 외부 자극에 의해 조절된다. 일단합성 스테로이드 호르몬은 체액으로 분비되는 유전자 (2)의 다양한 종류의 발현을 조절하기위한 여러 조직 및 기관을 대상으로한다. 따라서, 스테로이드 호르몬의 작용은 항상성, 성장 및 재생을 유지하기 위해 전신 반응을 유도한다.
스테로이드 호르몬 생합성 기능 및 스테로이드 호르몬의다면 발현....
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프로토콜
참고 : 프로토콜의 전체 구조는 그림 1과 같다.
1. 애벌레 링 선의 해부 (RG)
참고 : D에서. cyclorrhaphous 파리목에 속하는 melanogaster의는 상기 PG는 복합 내분비 장기 링 마개 (RG,도 2D)라는 조건. PG는 수술 (후술하는) 다른 유형의 세포로부터 분리하는 것이 실행할 수 없게되기 때문에, 실제 타겟 절개하여 그대로 손상 RG를 분리하는 것이다.
- 적절한 발달 단계에서 유충의 준비
참고 : D. melanogaster의 유충의 발달 단계를 동기화하기 위해서는 좁은 시간 창 내에서 계란을 수집하고 적절한 시간에 유충을 수집하는 것이 필요하다.- 25 ° C에서 포도 주스 한천 플레이트에 2 시간 동안 계란을 수집합니다.
- 수집 한 새로 부화 번째 령 집게로 해부 현미경 유충과 으깬 표준 효모 / 옥수수 가루 플라이 음식을 포함하는 작은 유리 병에 전송할 수 있습니다.
참고 : 유충의 ....
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결과
우리는 steroidogenic 기관 및 D. melanogaster의 유충과 성인 여성에서의 대화 형 장기를 시각화하기 위해 위의 프로토콜을 사용했다. 프로토콜의 전체 구조는 그림 1과 같다.
PG (도 2D), 뇌보다 더 작고 더 투명하고, 뇌 (도 2A 및 3A-C-E)의 전방 - 등쪽 측에 위치하고 포함 RG. PG 셀 라벨을 여러 그룹 ecdysteroidogenic 효소에 대한 항체의 다양한 형태를 생성 한 (즉, 버 랜드 (23), 측판 (20), 팬텀 25, 25 맞추기 및 26 그림자 Spookier
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토론
우리는 ecdysteroid 생합성 및 D. melanogaster의에서의 규제 메커니즘을 연구하고, 해부 및 면역 염색을위한 프로토콜을 고안했다. ecdysteroid 생합성의 타이밍은 신경 입력 큐 (33)의 환경에 의해 영향을받는, 그래서 박리시 뇌 VNC 및 다른 조직과 함께 ecdysteroidogenic 기관의 신경 분포를 유지하기 위해 필수적이다.
전술 한 바와 같이, D. melanogaster의 PG는 코퍼스의 allata (CA) 및 코퍼스에 cardiaca (CC) (도 2d)와 복합체 내분비 장기 RG를 형성한다. PG가 ecdysteroids를 생산하는 동안, CA와 CC는 각각 청소년 호르몬과 adipokinetic 호르몬을 생산하고 있습니다. 이 해부학 적 특성은 D에 ecdysteroido.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는이 작품에 대한 자신의 기술 지원 레이코 키세 및 Tomotsune Ameku 감사합니다. 우리는 또한 케이 이토, 올가 알렉시앙코, 아키코 고토 마사유키 미우라, 블루밍턴 초파리 증권 센터, 교토 증권 센터 (DGRC)과 주식 및 시약의 발달 연구 하이 브리 도마 은행에 감사하고 있습니다. 이 작품은 JSPS KAKENHI 허가 번호 16K20945, 나이토 재단, 그리고 이노우에 과학 연구 상에서 YSN 보조금에 의해 지원되었다; 및 문부 과학성 KAKENHI 허가 번호 16H04792에서 RN에 그랜트.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | 포도 주스 한천 플레이트 |
| 회수 컵 | HIKARI KAGAKU | ||
| 효모 페이스트 | 동양 건조 효모, 도쿄 | ||
| 100% 포도 주스 | Welch Food Inc. | ||
| 사육용 유충 | |||
| small 바이알 (12ml, 40회; 23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| 일회용 루프 | AS ONE | 6-488-01 | |
| 표준 플라이 식품 | Blooington 주식 센터의 웹 사이트에서 우리를 recipi. | ||
| <강>해부 | |||
| 해부 현미경 | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 해부 현미경 | Leica | S8 AP0 | |
| 조직 배양 접시(35 x 10mm, 미처리) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | 코팅 실리콘 내부 접시 | |
| 테루모 바늘(27G, 0.40 x 19mm) | TERUMO | NN-2719S | 조직 겸자를 "칼" |
| , Inox, # 5 | Dumont, Switzerland | ||
| 곤충 핀 (직경 0.18 mm) | 시가 브랜드 | 필레 해부 | |
| 마이크로 가위 | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| <강력>고정 | |||
| 초순수 | 머크 밀리포어 | ||
| 인산염 완충 식염수(PBS) | |||
| 포름알데히드 | Nacalai 테스크 | 16222-65 | |
| 파라포름알데히드 | Nacalai 테스크 | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | |
| rocker Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (기니피그), 1:1000 | |||
| anti-GFP (토끼), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary 항체 | |||
| goat anti-Rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life 기술 | A-22283 | |
| <강력>장착 시약 | |||
| 마이크로 슬라이드 유리 | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| 사각 현미경 커버 유리 | Matsunami Glass Ind., Ltd. | ||
| FluorSave 시약 (마운팅 시약) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (일회용 스포이드) | WATSON | 5660-222-1S | |
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| LSM700 레이저 스캐닝 현미경 시스템 | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP 왼쪽 | |
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| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | Ref29, Alekseyenko, O.V, Lee, C. & 크라비츠, E.A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | 블루밍턴 초파리 주식 센터에서. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | 블루밍턴 초파리 주식 센터에서. (#51941) |
참고문헌
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell.....
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재인쇄 및 허가
