여기, 제한 효소 사이트를 동의어 DNA 시퀀스에 삽입 및 기능 플라스미드 복구를 기반으로하는 프로토콜 인 플라스미드 회수 및 제한 효소 사이트 삽입 (CAPRRESI)에 의한 키메라 어셈블리를 제시합니다. 이 프로토콜은 단백질 코딩 유전자 융합을위한 빠르고 저렴한 방법입니다.
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이 논문에서
요약
초록
여기, 우리는 플라스미드 복구 및 제한 효소 사이트 삽입 (카프레 리)에 의한 키메라 조립을 제시한다. CAPRRESI는 원래의 플라스미드 회수 방법의 많은 장점을 활용하고 제한 효소 소화를 도입하여 DNA 라이 게이션 반응을 완화합니다 (키메라 조립에 필요함). 이 프로토콜의 경우 사용자는 야생형 유전자를 동일한 플라스미드 (pUC18 또는 pUC19)에 복제합니다. 키메라가 조립되어야하는 아미노산 서열 영역의 in silico 선택 후, 사용자는 그들을 암호화하는 모든 동의어 DNA 서열을 얻는다. Ad Hoc Perl 스크립트를 사용하면 사용자가 모든 동의어 DNA 시퀀스를 결정할 수 있습니다. 이 단계 후에 다른 Perl 스크립트는 모든 동의어 DNA 시퀀스에서 제한 효소 사이트를 검색합니다. 이 in silico 분석은 pUC18 / 19 플라스미드에서 발견되는 암피실린 내성 유전자 ( ampR )를 사용하여 수행됩니다. 사용자는 synonym region 내에서 올리고 뉴클레오타이드를 디자인하여 PCR로 wildtype과 ampR 유전자를 파괴합니다. obt 후상보적인 DNA 단편을 정제하고 정제하고, 제한 효소 소화를 수행한다. 키메라 조립은 적절한 상보적인 DNA 단편을 연결함으로써 달성된다. PUC18 / 19 벡터는 작은 크기 (2,686 염기 쌍), 높은 카피 수, 유리한 시퀀싱 반응 특징 및 상업적 유용성과 같은 기술적 이점을 제공하기 때문에 CAPRRESI를 위해 선택된다. 키메라 조립을위한 제한 효소의 사용은 무딘 - 종단 제품을 생산하는 DNA 중합 효소의 필요성을 제거합니다. CAPRRESI는 단백질 코딩 유전자 융합을위한 빠르고 저렴한 방법입니다.
서론
키메라 유전자 어셈블리는 단백질 기능을 밝히고 생물 공학적 목적으로 분자 생물학에서 널리 사용되어왔다. 중첩 PCR 산물 증폭 1 , 플라스미드 회수 2 , 상 동성 재조합 3 , CRISPR-Cas9 시스템 4 , 부위 유도 재조합 5 및 깁슨 어셈블리 6 과 같은 유전자 융합에 대한 다른 방법이있다. 이들 각각은 서로 다른 기술적 이점을 제공합니다. 예를 들어 중복 된 PCR 디자인의 융통성, 플라스미드 회복 동안 구조의 생체 내 선택, CRISPR-Cas9 및 Gibson 시스템의 고효율성 등이 있습니다. 반면에 이러한 방법 중 일부를 수행하는 동안 약간의 어려움이 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 처음 두 접근법은 둔기가 끝난 DNA 단편에 의존하며 이러한 유형의 산물의 결찰은 stic에 비해 기술적으로 어려울 수 있습니다연말 결찰. Site-directed 재조합은 Creoxox 시스템과 같이 원래 DNA 서열 (흉터)의 흔적을 남길 수 있습니다 5 . ....
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프로토콜
1. CAPRRESI 프로토콜
참고 : 그림 1 은 전체 CAPRRESI 프로토콜을 나타냅니다. 이 기술은 in silico 디자인과 원하는 키메라의 후속 구성을 기반으로합니다.
- 클로닝 플라스미드, pUC18 또는 pUC19의 선택.
- 기술적 인 요구에 가장 적합한 pUC 벡터를 선택하십시오.
참고 : 두 벡터는 다중 복제 사이트의 방향을 제외하고는 동일한 순서를 갖습니다. 이것은 올리고 뉴클레오티드의 디자인과 PCR 플라스미드 파괴에 중요합니다.
- 기술적 인 요구에 가장 적합한 pUC 벡터를 선택하십시오.
- 야생형 유전자와 pUC18 / 19 염기 서열에 대한 in silico 분석.
- 야생형 유전자의 DNA 서열을 얻어 FASTA 형식 파일 ( 예 : genes.fas)에 저장하십시오.
참고 : pUC18 / 19 벡터의 시퀀스는 pUC.fas 파일에 포함되어 있습니다 ( 그림 1 , 1 단계). - 어떤 제한 enz 결정ymes는 REsearch.pl 스크립트를 실행하여 wildtype 유전자와 pUC18 ....
- 야생형 유전자의 DNA 서열을 얻어 FASTA 형식 파일 ( 예 : genes.fas)에 저장하십시오.
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결과
그림 1 은 CAPRRESI를 나타냅니다. 이 방법을 사용하여 2 개의 키메라 유전자를 2 개의 박테리아 1 차 시그마 인자 ( 즉, 대장균 RpoD 및 R. etli SigA)의 도메인을 교환함으로써 조립 하였다. rpoD 및 sigA 유전자의 DNA 서열은 각각 GenBank 게놈 파일 NC_000913 및 NC_007761에서 Artemis Genome Browser 14 를 사용하여 얻었다. pUC18 벡터의 DNA 서열은 NCBI 서버의 뉴클레오티드 데이타베이스로부터 얻어졌다. 제한 효소 사이트의 in silico 분석은 REsearch.pl Perl 스크립트 (단계 1.2.2 참조)를 실행하여 DNA 서열에 대해 수행되었습니다. 이러한 결과는 올리고 뉴클레오타이드 디자인에 사용되었습니다 (1.2.3 단계)........
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토론
CAPRRESI는 PRM 2 의 대안으로 설계되었습니다. 원본 PRM은 강력한 기술입니다. 그것은 선택된 유전자의 어떤 부분을 따라 DNA 서열의 융합을 허용한다. PRM의 경우 야생형 유전자를 동일한 플라스미드에 클로닝해야합니다. 그 후, 올리고 뉴클레오타이드는 플라스미드에서 발견되는 야생형 및 항생제 내성 유전자 내에서 설계된다. 플라스미드 혼란은 둔기가 끝난 고 충실도의 DNA 중합 효소와 이전에 고안된 올리고 뉴클레오타이드를 사용하여 PCR로 얻을 수 있습니다. 상보 적 PCR 산물의 라이 게이션은 키메라 유전자를 조립하고 항생제 내성 카세트를 복원하여 기능적 플라스미드 회복을 가져온다. PRM은 동일한 플라스미드 백그라운드에서 키메라 유전자 라이브러리의 구축을 가능하게합니다. 불행히도, blunt-ended DNA 서열의 연결은 기술적으로 힘들 수 있습니다. 겹쳐지는 PCR 단편 1에 의한 키메라 조립은 또한 DNA 중합 효소가 무딘.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, México (보조금 번호 154833) 및 Universidad Nacional Autónoma de México에서 지원되었습니다. 저자는 Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos 및 Soledad Juárez에게 행정적이고 기술적 인 조언을 해주신 것에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304011 | 블런트/3'-A 오버행 엔드 PCR 산물의 혼합물을 생산 |
| 순도 플라스미드 분리 키트 | Roche | 11754785001 | 모든 플라스미드 정제 반응에 사용됩니다. |
| 순도 PCR 산물 정제 키트 | Roche | 11732676001 | 아가로스 겔의 모든 PCR 정제 반응에 사용됩니다. |
| AflII 제한 효소 | New England Biolabs | R0520L | 은 서열 5'-CTTAAG-3'을 인식하고 37°C에서 절단합니다. C |
| KpnI-HF 제한 효소 | New England Biolabs | R3142L | 서열 5'-GGTACC-3'을 인식하고 37°C에서 절단합니다. C |
| SpeI-HF 제한 효소 | New England Biolabs | R3133L | 은 서열 5'-ACTAGT-3'을 인식하고 37°C에서 절단합니다. C |
| XbaI 제한 효소 | New England Biolabs | R0145L | 은 서열 5'-TCTAGA-3'을 인식하고 37°C에서 자릅니다. C |
| 암피실린 나트륨 염 | 시그마 알드리치 | A0166-5G | 항생제 |
| 날리딕신 산 | 시그마 알드리치 | N8878-5G | 항생제 |
| 효모 추출물 | 시그마 알드리치 | Y1625-1KG | 세균 세포 배양 |
| 카제인 펩톤 | 시그마 알드리치 | 70171-500G | 세균 세포 배양 |
| NaCl | 시그마 알드리치 | S9888-1KG | 소금 |
| Agar | Sigma Aldrich | 05040-1KG | 박테리아 세포 배양 |
| XbaI 제한 효소 | Thermo Fisher | FD0684 | 빠른 소화 XbaI enzyme |
| KpnI 제한 효소 | Thermo Fisher | FD0524 | 빠른 소화 KpnI 효소 |
| 빠른 결찰 키트 | New England Biolabs | M2200S | Fast DNA ligation kit |
| AflII 제한 효소 | Thermo Fisher | FD0834 | 빠른 분해 AflII enzyme |
| SpeI 제한 효소 | Thermo Fisher | FD1253 | 빠른 분해 SpeI enzyme |
참고문헌
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strat....
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재인쇄 및 허가
