기술은 유도 및 정량화 세포 노화하기

요약

세포 노화, 세포주기 정지의 비가역적인 상태는 다양한 세포 스트레스에 의해 유도 될 수있다. 여기, 우리는 노화의 마커를 평가하기 위해 세포 노화 및 방법을 유도 프로토콜을 설명합니다.

초록

세포 스트레스 또는 손상에 대한 응답으로 증식하는 세포는 세포 노화이라고 장기 세포주기 정지의 상태를 개시하는 특정 프로그램을 유도 할 수 있습니다. 노화 세포의 축적은 생명체의 노화와 체외에서 계속 배양을 통해 발생합니다. 노화 세포는 배아 발달, 조직 복구 및 재생, 종양 억제, 노화 등 많은 생물학적 과정을, 영향을 미친다. 노화 세포의 특징을 포함하지만, 증가 된 노화 - 관련 β 갈 락토시다 제 활성 (SA-β-gal을)에 한정되지 않는다; P16의 ^INK4A, p53의, 그리고 P21 수준; γ-H2AX을 포함하여 DNA 손상의 높은 수준; 노화 관련 이질 병소 (SAHF)의 형성; 및 노화 관련 분비 표현형 (SASP), 염증성 사이토 카인 시그널링 분자의 수 분비를 특징으로하는 현상 획득. 여기, 우리가 모두 복제 성을위한 프로토콜을 설명하고DNA의 배양 세포에 노화를 유발 손상. 또, SA-β-gal을, γ-H2AX 및 SAHF 얼룩 등 여러 노화 - 관련 마커를 이용한 노화의 표현형을 모니터링하고, 세포주기 조절제 및 SASP 인자 단백질의 mRNA 수준을 정량화하는 방법을 강조. 이 방법은 다양한 모델과 조직에서 노화의 평가에 적용 할 수 있습니다.

서론

반 세기 이상 전 헤이 플릭와 동료들은 문화 확산 방법 변형되지 않은 세포를 설명하지만, 시간이 ¹ 만 한정된 기간 동안. 인간의 섬유 아 세포의 장기 배양이 확산 막을 수있는 세포를 발생; 그러나, 그들은 대사 활동했고, 이것은 세포 노화라고했다. 노화 종양 억제에 도움이 될 수 있지만,이 에이징 ^{(2, 3)에} 발생하는 회생 용량의 감소에 기여하는 것으로 생각된다으로도 불리 할 수있다. 노화 세포는 ^{4 세를} 인간과 배아 발달, 상처 치료, 조직 복구 및 나이와 관련된 ^염증이 포함 생물학적 과정의 숫자에 연루되어있다으로 조직에 축적하는 것으로 나타났다.

문화에 세포의 지속적인 계대이 연결되었습니다 복제 성 노화를 유도마찰과 게놈의 불안정성을 텔로미어합니다. DNA 손상과 암 유전자를 포함한 다양한 세포 스트레스는 또한 노화 ^3가 발생할 수 있습니다. 텔로미어 (telomere)의 감소가 아닌 다른 요인에 의한 노화는 종종 스트레스 유발 또는 조기 노화라고 일반적으로 ....

프로토콜

1. 유도하는 증식 및 노화

1. 해동 저역 통과 인간의 배수체 섬유 아세포 (예를 들면, WI-38 및 IMR-90) 또는 다른 세포주.
   참고 : 여기, 사람 이배체 섬유 아세포가 사용되었지만, 이러한 프로토콜은 이러한 내피 세포, 상피, 또는 중간 엽 줄기 세포와 같은 다른 종류의 세포에서 노화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 배양 조건으로 인해 상이한 성장 속도 또는 성장 조건을 사용하는 다른 세포 유형에 대해 최적화 될 수있다.
   주 : 세포를 증식하고, 스핀들 형태를 (개략과 예 2도도 1 참조)를 가져야한다. 이상적으로는, 세포는 가능한 복제 성 세포 노화를 피하기 위해 실험 시작 30 <인구 두배 레벨 (PDL)를 가져야한다.
   1. 하기 식 PDL 로그 = N의 _F는 최종 세포 수이며 (N의 _F / N ₀₎ /은 log2를 이용하여 세포의 PDL을 계산 N _{0 시드} 셀 ^(21)의 초기 개수이다.
2. 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 배양....

결과

6 SA-β-gal을 염색에서 대표적인 결과를 보여준다 - 2도 γ-H2AX 및 SAHF위한 염색; P16의 ^INK4A, P21 및 p53의 단백질 수준의 평가; 및 mRNA의 노화와 관련된 분자의 단백질 수준. 증가 된 SA-β-gal을 염색 및 복제 성 DNA 손상 - ​​유도 노화 발생. 또한, 노화와 함께 일어나는 형태 학적 변화를 관찰한다. 세포는 섬유 아세포 증식 스핀들 외관에 비해 확대 된 평면이된다. 본 실험 패러다임, 세포를 염색하고, RNA / 단백질 IR 노광 후 7 (D)를 분리 하였다. 더 강력한 결과는 IR 노출 (예 : 10 D) 후 이상 대기에 의해 발생할 수 있습니다. 조건은 각 조건 및 실험 장치에 대해 결정해야합니다. 이들 결과는 대표적인 노화 및 다른 방법을 사용하여 유도 될 때 이러한 마커는 검출 할 수있다.

토론

여기에서는 인간의 배수체 섬유 아세포를 이용하여 복제 성 및 DNA 손상 - ​​유도 노화에 대한 방법을 설명 하였다. 또한, 다양한 단백질 및 노화 관련 단백질의 mRNA 수준을 정량화하기위한 기술이 포함될뿐만 아니라, 염색 SA-β-gal을위한 상기 DNA 손상 - ​​마커 γ-H2AX위한 것이다. 많은주의가 생체 ^(20)에 노화의 특성이 존재하지만,이 프로토콜은 널리 생체 외 및 생체 내에서 모두 노화 표현형을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 다른 세포들이 노화 된 세포없는 경우에도, 노화 마커를 표현할 수 있습니다. 예를 들면, 파골 세포 및 대 식세포와 같은 세포는 β-gal을 활성 ^{(32, 33)보다} 높은 수준을 갖는다. 또한, 많은 암 세포는 P16의 ^{INK4A (34)을} 상향 조절했다. 세포는 DN.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
16% 트리스-글리신 겔	Invitrogen	XP00160BOX
Acid-Phenol ChCl3	Ambion	AM9720
Alexa-Fluor 568 염소 안티 마우스 항체	Invitrogen	A11031	1:300 희석
세포 리프터	Corning Inc.	3008	셀 스크레이퍼
ECL 안티 마우스 HRP 연결 항체	Amersham	NA931V
ECL Plus Western Blotting Substrate	Pierce	32132	ECL
DAPI	Molecular Probes	MP01306	재고 5 mg/mL in dH2O
GAPDH 항체	Santa Cruz	sc-32233	1:1,000 - 5,000 희석
GlycoBlue	Ambion	AM9515
히스톤 H3 디메틸 K9 단클론 항체	Abcam	1220	1:500 희석
인간 IL-6 Quantikine ELISA 분석	R & D 시스템	D6050
인간 IL-8 퀀티킨 ELISA 분석	R& D 체계	D8000C
인간적인 GROa Quantikine ELISA 분석실험	R& D 시스템	DRG00
N-N-디메틸포름아미드	Sigma	D4551	DMF
p16 단클론 항체	BD Biosciences	51-1325gr	1:500 희석
p21 단클론 항체	Millipore	05-345	1:750 희석
p53 단클론 항체	Santa Cruz	sc-126	1:500 희석 클론 DO-1
phospho-H2AX (Ser139) FITC 접합 항체	세포 신호	9719	1:2,000 희석
POWER SYBR-green PCR 마스터 믹스	Applied Biosystems	4367659
사전 염색된 분자량 마커	Biorad	161-0374
ProLong Gold Antifade	Invitrogen	P36930
PVDF 멤브레인	Thermo Scientific	88518
노화 &베타;-갈락토시다아제 염색 키트	세포 신호 전달	9860
TRIzol	Ambion/Life Tech	10296028