Method Article

3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법

DOI:

10.3791/55544

⸱

March 27th, 2017

 ,  , 
1Division of Cancer Biology and Genetics, Queen's University Cancer Research Institute, 2Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 세포 응집을 통해 3D 세포 스페로이드를 형성하기 위한 빠르고 유연한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 여러 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있으며 세포 이동, 침습 또는 아노이키스 분석을 포함한 다양한 응용 분야와 세포-매트릭스 상호 작용의 이미징 및 정량화에 적합합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단층 세포 배양 충분히 복잡한 세포 - 세포 및 세포 - 기질 상호 작용을 포함한다 조직의 생체 내 행동을 모델링하지 않습니다. 3 차원 (3D) 세포 배양 기술을 접착 세포 배양의 단점을 해결하기 위해 개발 된 최근의 기술 혁신이다. 시험관 내에서 조직 유사체를 생성하기위한 몇 가지 기술이 개발되었지만,이 방법은 비용이 확립 자주 복잡 특수 장비를 필요로하고, 일반적으로 특정 유형의 세포와의 호환성에 의해 제한된다. 여기서는 종양 정상적인 다양한 세포주의 성장과 호환 일관된 크기 다세포 차원 타원체로 세포 응집을위한 신속하고 유연한 프로토콜을 설명한다. 우리 앵커리지 독립적 타원체 생성을 촉진하고, 높은 재현성으로 세포 단층의 형성을 방지하기 위해 혈청 및 메틸 셀룰로오스 (MC)의 다양한 농도를 사용한다. 개인 라지을위한 최적의 조건idual 세포주 회전 타원체 형성 매체 MC 또는 혈청 농도를 조정함으로써 달성 될 수있다. 생성 된 3D 타원체 셀 시그널링 또는 유전자 발현 연구 후보 약물 스크리닝, 또는 종양 세포의 침윤 및 이동과 같은 세포 과정의 연구 등의 다양한 애플리케이션에 사용하기 위해 수집 될 수있다. 프로토콜은 또한 용이하게 단일 세포 클론 타원체를 생성하도록 구성되고, 앵커리지 - 독립된 성장 anoikis 저항을 평가하도록 구성 될 수있다. 전체적으로, 우리는 프로토콜을 생성하고, 정상 및 종양 세포의 생체 내 성장을 조직의 3 차원 미세 요점을 되풀이하고 모델링하기 위해 3 차원 셀 타원체를 이용하는 쉽게 수정 방법을 제공한다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

종양 세포의 생물학적 행위 관련 사정이 적절히 생체 내에서 발견되는 세포 미세 환경을 반영하지 않기 때문에, 부분적으로는 기존의 2 차원 세포 배양 방법을 사용하여 도전하고있다. 배양 (예, 보이든 챔버 분석법)에 세포 외 기질 성분을 통합하는 대안 적 방법은 생체 조직 환경 이상의 생리 대표. 그러나, 개별 셀 동작의 평가에 한정 될 수 있으며, 조직 또는 종양 성장을 1, 2, 3에 기여하는 세포 기질 및 세포 - 세포 상호 작용의 생체 조합 복소 요점을 되풀이하지 않는다.

다세포 타원체의 사용은,보다 정확하게 생체 내 세포 성장 (1)의 콤팩트 한 구조를 재생하는 방법이다 최근4. 구 상체는 정상 세포의 세포 - 기질 상호 작용을 조사하기 위하여 사용될 수 있으며,뿐만 아니라, 전이성 성장 또는 약물 내성 4와 같은 종양 진행의 특성을 모델링하....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고 : 모든 시약 및 소모품은 재료 목록에 나열되어 있습니다.

셀 집계 1. 회전 타원체 생산

  1. 메틸 셀룰로오스 용액 100 ㎎ / ㎖의 메틸 셀룰로오스 100 ㎖를 준비한다.
    1. 열 50ml의 초순수 H 2 O 80 °의 C. 10g 메틸 셀룰로오스 분말을 추가하고 입자가 균일하게 분산 될 때까지 교반.
    2. 차가운 초순수 H 2 O와 최종 부피 가져 오기 및 솔루션이 명확해질 때까지 4 ℃에서 교반, 밀짚 색깔, 그리고 눈에 보이는 고체가 포함되어 있지 않습니다.
    3. 용해되지 않은 고형물을 제거하기 위해 0.45 ㎛의 필터를 통과한다. 준비된 용액을 분주하고 12 개월까지 4 ℃에서 저장 될 수있다.
      주 : 메틸 셀룰로오스는 세포 - 세포 부착을 향상시키고 접착 성 세포 단층의 형성을 억제 할 수있는 비 독성, 불활성, 현탁 화제로서 기능한다. 메틸 셀룰로오스는 수용성이고 spher 따라 씻겨 수OID 세대.
  2. 회전 타원체 형성 매체
    참고 : 사용하기 전에 즉시 회전 타원체 형성 매체를 준비....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 세포 반발 판과 MC로 보충 회전 타원체 형성 미디어를 사용하여 개별 회전 타원체를 생성하는 유연하고 효율적인 방법을 설명합니다. MC 혈청의 적절한 조건 하에서, 각각의 세포가 정착 웰 바닥에 최소한으로 부착 구 상체를 형성하는 웰의 중심에 함께 부착. 이 프로토콜을 이용하여, 구 상체는 다양한 세포주 (도 2b)에서 발생 하였다. MC 혈청 농도 적정은 단일 타원체가 단편화없이 조작 할 수 있도록 충분히 튼튼하다 형성되는 최적의 조건을 식별하는 각각의 세포주에 대해 요구된다. 최적의 구 상체는 직경이 200 내지 500 ㎛의 사이이었으며, 최소 세포 파편 단단히 부착 세포로 구성되었다. 타원체들을 수집 및 분석을 광범위하게 사용될 수 있도록, 손상없이 부드러운 핸들링 살아 남았다.

(도 3a)에 의해 손상 될 수있다. 처리시 먼지 나 오.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 저렴하고 광범위하게 이용할 시약을 이용하여 생체 조직의 구조를 모델링하는 3 차원 셀 구 상체를 제조하기위한 신속하고 융통성있는 방법을 제시한다. 우리 프로토콜 MC (8, 9)의 비 독성 및 접착 촉진 성질 세포 응집을 매개 세포 단층의 형성을 최소화하기를 이용한다. 동물 소스로부터 단리 된 단백질 - 기초 매트릭스는 달리, MC는 불활성에는 성장 인자를 포함하지 않고, 쉽게 잔류 매트릭스의 존재없이 다양한 애플리케이션에 사용하기위한 회전 타원체의 절연 수 세척에 의해 제거된다. 우리의 프로토콜은 다양한 실험 조건 하에서 성장 타원체의 직접적인 비교를 허용 균일 크기의 타원체를 생성 일치 셀 수의 신속한 응집을 이용한다. 이 방법은 (다중 종양 - 관련 세포 유형의 고정 된 숫자를 조합하여 생체 내 종양 성장의 모델로 혼합 배양에 적합 할 수있다예를 들어, 섬유 아세.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 Queen's University Biomedical Imaging Centre의 M. Gordon에게 도움을 준 것에 대해 감사를 표합니다. 이 연구는 캐나다 암 연구 협회(19439) 및 캐나다 보건 연구소(MOP-142303)(LMM)의 운영 보조금, 온타리오 대학원 장학금 및 Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research(SMM, EYL)의 장학금 및 학생, Craig Jury Summer Studentship(SMM)의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

up>+<strong 고압멸멸균하지 마십시오.드

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Buffers
10x Phosphate buffered SalineThermo Fisher Scientific AM9625
염화칼슘 용액Sigma-Aldrich21114PBS+ 세척 버퍼에 사용됩니다. 염화칼슘 추가 시 PBS+ 세척 버퍼를 고압멸균하지 마십시오
마그네슘 용액Sigma-AldrichM1028PBS+ 세척 완충액에 사용됩니다. 염화마그네슘
NameCompany카탈로그 번호Comments
For Spheroid Formation
를650970
Dulbecco's Modified Eagle's MediumSigma-AldrichD5546SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 세포주 배양용
F12K MediumThermo Fisher Scientific2112722TT 세포주 배양용
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF1051미립자 오염 물질 제거를 위한 사용 전 필터
메틸 셀룰로오스Sigma-AldrichM7027100 mg/mL까지 수중에서 준비
Roswell Park Memorial Institute 매체Sigma-AldrichR8758HCT-116, BxPC-3 세포주 배양용
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12605028해리 완충액
Name<strong>Company카탈로그 번호코멘트
Invasion Assay
Bovine Type I CollagenCorning Incorporated354231Stock 3.1 mg/mL; 사용 중에는 얼음 위에 유지하십시오
DMEM 페놀 레드 프리 로우 글루코스 Thermo Fisher Scientific11054-20페놀 레드 보충 배지
Glial Cell Line Derived Neurotrophic FactorPeprotech450-10Chemoattractant
NameCompany카탈로그 번호Comments
면역형광 현미경용
#1.5 CoverglassElectron Microscopy Sciences72225-01절제 스페로이드 장착용
Alexa-Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA123791:200에서 액틴을 염색하는 데 사용
Bovine Serum AlbuminBioshop Canada IncorporatedALB001BSA 차단 완충액에 사용
Dabco 33-LV시그마-알드리치290734안티페이
글리세롤 Bioshop Canada IncorporatedGLY001MOWIOL 장착 매체
ImageJ 소프트웨어프리웨어에 사용, NIH-이미지 분석에 사용 
MicroslidesVWR International48312-024소비된 스페로이드 장착용
MOWIOL 4-88EMD-Millipore475904MOWIOL 장착 매체
파라포름알데히드에 사용됩니다 EMD-MilliporePX0055-3고정 완충액에 사용
Triton X-100Bioshop Canada IncorporatedTRX777투과화 완충액에 사용
. 염화96-well U-bottom Cell-Repellent Plate Greiner Bio-One을 첨가하여 PBS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).
  2. Albini, A., Noonan, D. M.

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3D Spheroid ProductionCell Aggregation MethodMethylcellulose MediumSerum ConcentrationU bottom PlatesCollagen EmbeddingSpheroid FormationAnchorage independent GrowthCell Line CompatibilityTumor Cell Invasion

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