이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

차세대 일렉트로 차 인간 Th17 세포 작은 RNA 형질

7.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55546

⸱

2017년 4월 13일

 , 
1Department of Microbiology & Immunology, Sandler Asthma Basic Research Center, University of California, San Francisco

이 논문에서

요약

차세대 전기천공법은 유전자 발현과 세포 거동을 변경하기 위해 인간 Th17 세포를 작은 RNA로 형질 주입하는 효율적인 방법입니다.

초록

CD4+ T cell은 주변 cytokine 환경에 따라 effector T helper cell의 여러 subset으로 분화할 수 있습니다. Th17 세포는 편광 사이토카인 IL-1β, IL-6, IL-23 및 TGFβ의 존재 하에서 활성화하여 in vitro에서 naive CD4+ T 세포에서 생성할 수 있습니다. Th17 세포는 세포외 박테리아 및 곰팡이에 대한 면역을 조직하지만, 이들의 비정상적인 활동은 여러 자가면역 및 염증성 질환과도 관련이 있습니다. Th17 세포는 케모카인 수용체 CCR6에 의해 식별되며 마스터 전사 인자인 RORγt와 특징적인 효과기 사이토카인인 IL-17A에 의해 정의됩니다. Th17 세포 분화를 위한 최적화된 배양 조건은 통제된 환경에서 인간 T 세포 생물학의 기계론적 연구를 용이하게 합니다. 또한 RNA 간섭 또는 microRNA(miRNA) 모방 또는 억제제의 도입을 통해 특정 유전자 및 유전자 발현 프로그램의 중요성을 연구하기 위한 환경을 제공합니다. 이 프로토콜은 차세대 전기천공법(electroporation) 장치를 사용하여 작은 RNA로 분화하는 1차 인간 Th17 세포의 일시적 transfection을 위한 사용하기 쉽고 재현 가능하며 매우 효율적인 방법을 제공합니다.

서론

CD4 + T 세포는 적응 면역 반응의 중요한 관현악입니다. 나이브 CD4 + T 세포는 여러 이펙터 T 세포 (예받은 Th1, TH2, Th17 등)로 현상 할 수있는 로컬 미세 1에 따라 특성 사이토킨 및 전사 인자의 그 자신의 세트 각각. T 세포가 만들어 계보 결정은 자기에게 모두 보호 면역 관용에 대한 중요합니다. Th17 세포 외 박테리아 및 곰팡이를 방지하기 위해 공지 된 T 세포의 서브 세트 중 하나이지만, 그 부적절한 반응은 또한 다발 경화증, 건선과 2, 3과 같이 다수의자가 면역 및 염증성 질환의 병인에 연루되어있다. 인간 Th17 세포는 적절한 환경 편광판 (4)을 제공함으로써 체외 나이브 CD4 + T 세포로부터 생성 될 수있다. 바리오 사이토 카인의 우리 조합은 IL-1β, IL-23, TGFβ, 및 IL-6는 인간의 Th17 세포의 개발을 위해 사용되어왔다. 인간 Th17 세포 CCR6, 통상이 세포 집단을 식별하는 데 사용되며, 그 주요 전사 인자 (RORC 의해 코딩) RORγt (5, 6)의 식에 의해 정의된다 케모카인 수용체 발현. Th17 세포는 여러 사이토 카인을 발현하는 능력을 가지고 있지만, IL-17A는 이들 세포에 의해 생성 된 계통 정의 이펙터 사이토 카인이다. 우리는 우리의 인간 Th17 체외 분화 분석의 견고성을 평가하기 위해 세 가지 Th17 관련 마커 (CCR6, RORγt, IL-17A)의 발현을 조사 하였다. 또한, 우리는이 Th17 마커의 발현이 매우 낮은 또는 부재이어야 이후에는 사이토 카인이나 차단 항체를 음성 대조군으로 사용하는 배지에 첨가되지 않았다 비 편광 조건 하에서 인간 CD4 + T 세포를 배양 하였다.

ve_content는 "> 정상적인 인간 T 세포의 발달 및 생물학을 연구하는 하나의 방법은 개발 중에 유전자 발현을 조작 할 수있다. 짧은 간섭 RNA (siRNA와)는 단백질을 코딩하는 mRNA를 타겟팅 특정 유전자의 발현을 감소시키기 위해 이용 될 수있는 합성 작은 RNA 분자이다 . 마이크로 RNA (miRNA가)는 포스트 - 전사적 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 내인성 비 코딩 작은 RNA를이다.의 miRNAs는 Th17 전지 7, 8, 9를 포함하여 쥐와 인간 T 세포 생물학 모두에서 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 이는 유전자 발현에 궁극적으로 인간 T 세포 생물학에 미치는 영향을 연구하기 위해 인간 T 세포에서 작은 RNA 활동을 조작하는 신뢰할 수있는 방법을 가지고 매우 중요하다. 여기에서, 우리는 우리가 도입 용으로 개발 된, 사용하기 쉽고 일관되고 신뢰할 수있는 프로토콜을 설명 작은 합성 RNA를 잠긴 핵산 (LNA들에서는 화학적 안정성이 증가 된 핵산을 개질)면역 세포로, 특히 인간의 Th17 세포로.

일반적으로, 생물 화학적 또는 물리적 카테고리 (10)에 속하는 포유 동물 세포 내로 RNA를 작은 도입 여러 다른 방법들이있다. 지질 계 형질 감염, 칼슘 포스페이트 형질 비롯한 일반적으로 사용되는 화학적 방법이 더 효율적으로 세포에 의해 흡수되는 화학-DNA 복합체를 만드는 방법에 의존한다. 일반적으로, 화학적 방법은 일차 T 세포의 형질 감염에 대해서는 비효율적이다. 가장 일반적인 생물학적 방법은 직접 자연 복제주기의 일환으로 호스트에 외국 RNA를 삽입하는 바이러스 벡터 (예 : 레트로 바이러스 또는 렌티 바이러스)를 사용하는 것입니다. 바이러스 성 전달은 일반적으로 하나가 프로 바이러스 플라스미드의 분자 클로닝 시간에 요인 특히, 완료하는 데 시간이 오래 걸립니다. 또한, 바이러스 전달 벡터는 인간의 연구자들에게 잠재적으로 해로울 수 있습니다. 전기 물리적 인 m핵산은 일시적으로 그들의 타겟에 작용할 수있는 세포에 들어갈 수 있도록, 고전압 펄스에 세포를 실시함으로써 막 permeabilization 유도 ethod. 전통적인 전기 장비는 차 림프구를 형질 감염에 효과가 없었다. 그러나, 최적화 된 차세대 전기가 작은 물질 인 RNA 형질 감염 될 때, 특히 매우 높은 효율로 T 세포를 형질 감염 할 수있는 것으로 입증되었다. 용어 차세대 느슨하게 기존의 전기 기계에서 두 개의 새로운 플랫폼 (예를 들어, 네온, Amaxa의)를 구분하는 데 사용됩니다. 또한,이 방법은 하나의 실험에서 약 120 작은 RNA를, 최대 종종 검증 합성 시약을 사용하여 함께 적당한 처리량 스크린의 확장이 용이하다. 중요한 것은, 성공적인 형질 감염은 T 세포 활성화 후 적게 16 시간 후에 달성 될 수있다. 이 방법의 단점은, 그러나, 안정한 유전자 incorporati 초래하지 않는다는 점이다에, 그리고 것은 그러므로 과도이다. 따라서, 그것은 바이러스 벡터에 패키지 성공적으로 작은 RNA의 장기 발현이 요구되는 경우에 T 세포에서 발현 할 수있는 안정적인 발현 구조를 만들 수있는 여분의 노력이 가치가있다.

우리는 서로 다른 목적으로 11, 12, 13에 대한 다양한 합성 단일 또는 이중 가닥 RNA 또는 LNA 올리고 뉴클레오티드 도구를 제공하는 차세대 형질 (예를 들어, 네온)을 사용했다. 효율적인 RNA 간섭은 이중 가닥 짧은 간섭 RNA (siRNA에)를 사용하여 기본 마우스와 인간 T 세포에서 유도 할 수있다. 이 프로토콜은 인간 Th17 세포에서이 기술을 사용하기위한 최적의 조건을 설명한다. siRNA를 외에도 시판 합성 miRNA의 모방 및 억제제 miRNA의 이득 및 기능 상실을 연구하는데 사용될 수있다. miRNA의 모방은 siRNA를 매우 유사 이중 가닥 RNA 분자하지만 고안은성숙한 miRNAs는 내생의 시퀀스 D. miRNA의 억제제는 고유의 miRNA에 결합하여 그 기능을 길항하는 RNA 및 / 또는 LNA 기초하여 단일 가닥 올리고 뉴클레오타이드를 화학적으로 변성된다. 우리는이 모든 도구가 포함 배양 차 T 림프구에서 효과적으로 사용하지만 인간 Th17 세포에 국한되지 될 수 있다는 것을 발견했다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

이 프로토콜은 인간의 연구 윤리에 대한 UCSF의 지침을 준수합니다.

T 세포 배양, CD4 + T 세포의 분리와 Th17 분극 1. 제조

  1. 0 일에, CD3에게 항 - 인간 (2 ㎍ / ㎖) 및 항 - 인간 CD28의 웰 당 1.5 ㎖의 코트 6 웰 조직 배양 플레이트 (4 ㎍ / ㎖), 적어도 2 시간 동안 칼슘 및 마그네슘에 함께 PBS에서 37 ° C.
    1. 대안 적으로, 코트 밤새 39 ° C에서 플레이트. 파라 필름에서 접시를 감싸.
  2. 제조업체의 지침에 따라 밀도 구배 원심 분리하여 제대혈 단핵 세포 (CBMCs)를 준비합니다.
    주의 :주의 깊게 작업 및 혈액 매개 병원균에 노출의 위험을 피하기 위해 인간의 피를 처리 할 때 착용 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 확인합니다.
  3. 단핵 세포를 분리하여 세척 한 후, 음극 실리 의해 인간 CD4 + T 세포의 분리를 수행ction 특 상업용 인간 CD4 + T 세포를 이용하여 키트.
    참고 : 단핵 세포 분리 후 적혈구 오염이있는 경우, 옵션 적혈구 세포 용해가 CD4 + T 세포의 분리 단계 이전에 수행 될 수있다. 차단 완충액 (PBS 2 % FBS)의 1 mL의 단핵 세포를 재현 탁. 1 배 용균 솔루션의 5 ML을 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 인큐베이션. 그런 다음 세포 펠렛 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에 차단 완충액 원심 5 mL를 추가한다.
    1. 새로운 5 ㎖ 튜브에 차단 완충액 500 μL 당 50 × 106의 밀도에서 단핵 세포를 재현 탁.
    2. FBS 100 μL 후 잘 섞어 오비탈 진탕 기에서 20 분 동안 4 ℃에서 각각 배양 튜브를 튜브 당 항체 믹스 100 μL를 추가한다.
    3. 배양 후, 세포를 세척 버퍼 분리 3-4 mL를 첨가. 세포 펠렛을 39 ° C에서 8 분간 300 XG에 세포를 원심 분리기. 조심스럽게 공중으로 대기음rnatant.
    4. 이 회전하는 동안, 자기 구슬을 미리 씻는다. (1에서 사용했을 때 세포로 1) 새로운 튜브에 자성 비드의 원하는 양을 옮기고 비드를 세척 완충액 분리 동량을 추가한다. 1 mL의 마이크로 피펫을 사용하여 잘 혼합 한 다음, 적어도 1 분 동안 자석에 튜브를 놓는다. 조심스럽게 뜨는을 대기음. 초기 세척 전에 전송 된 동일한 부피의 자성 비드를 재현 탁.
    5. 분리 완충액 500 μL 각 튜브에 세포를 재현 탁 및 사전 세정 자성 비드 500 μL를 추가한다.
    6. 잘 섞어 상온 (25 ° C 내지 18 ° C)에서 오비탈 진탕 기에서 15 분 동안 자성 비드와 세포를 인큐베이션.
    7. 인큐베이션 후, 충분히 1 mL의 마이크로 피펫을 적어도 10 배를 사용하여 세포를 피펫. 이어서 분리 버퍼 3-4 mL를 첨가하고 2 분 동안 상기 자석의 각각의 튜브를 배치했다.
    8. 조심스럽게에있는 부정적인 선택 CD4 + T 세포를 전송새로운 튜브에 뜨는.
  4. CD4 + T 세포의 분리가 완료되면, 혈구와 세포를 계산하고 얼음에 세포를 유지한다.
  5. PBS와 항체 코팅 된 플레이트를 두 번 씻으십시오. 이어서 각 웰에 Th17 - 편광 미디어 1.5ml의 배의 혼합물을 추가 항 - 인간 IFNγ (20 ㎍ / ㎖), 항 인간 IL-4 (20 ㎍ / ㎖) 인간 TGFβ (10 NG / ㎖) 인간 IL-1β (40 ng의 / ㎖) 인간 IL-23 (40 ng의 / ㎖) 인간 IL-6 (50 NG / ㎖) 총 2 mM의 L- 글루타민이 보충 된 무 혈청베이스 미디어 (희석 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신, 10 mM의 HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨 및 100 μM 2- 머 캅토 에탄올).
    참고 : 형질 및 RNA 간섭 혈청 함유 미디어에서 작업을 수행합니다. 이 프로토콜과 혈청이없는 미디어를 사용하는 목적은 더 나은 IL-17의 생산을 달성하는 것입니다.
  6. 원심 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에 인간 CD4 + T 세포는 세포 펠렛. 조심스럽게 supernat를 대기음개미. 그런 다음, 최종 부피가 웰 당 3 ㎖이고 편광 사이토킨은 1X 최종 농도 이제 잘되도록 1.5 mL의 3 × 106의 밀도로 세포를 무 혈청베이스 미디어 세포를 재현 탁하고 접시.
    1. 5 % CO 2에서, 이틀 동안 37 ° C의 배양기 판을 놓는다.

2. 일렉트로 체외 편광 인간 Th17 세포

  1. 제 2 일, CD3에게 항 - 인간 (2 ㎍ / ㎖) 및 항 - 인간 CD28의 웰 당 250 μL로 코팅 48- 웰 조직 배양 플레이트 (4 ㎍ / ㎖), 적어도 2 시간 동안 칼슘 및 마그네슘에 함께 PBS에서 37 ° C.
    1. 대안 적으로, 코트 밤새 39 ° C에서 플레이트. 파라 필름에서 접시를 감싸.
  2. 형질 전환을위한 작은 RNA를 준비. 각 형질 1.5 ML의 마이크로 원심 튜브에 siRNA를 5 μM 스톡 용액의 분취 액 1 μL. 적절한 화학 - 일치하는 작은 RNA의 제어 방식을 포함OL. 얼음의 모든 튜브를 유지합니다.
  3. PBS와 항체 코팅 된 플레이트를 두 번 씻으십시오. 인간 TGFβ (5 NG / ㎖) 인간 IL-항 인간 IFNγ (10 ㎍ / ㎖), 항 인간 IL-4 (10 ㎍ / ㎖) : 500 μL 1X 각 웰 미디어 Th17가 - 편광의 추가 1β (20 ng의 / ㎖) 인간 IL-23 (20 ng의 / ㎖) 인간 IL-6 (25 NG / ㎖) 모두 2 mM L- 글루타민, 100 U 보충 된 무 혈청베이스 미디어 (희석 / mL의 페니실린, 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신, 10 mM의 HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨 및 100 μM 2- 머 캅토 에탄올).
  4. 배양 플레이트와 형질 전환 시약을 제조 한 후, 1 ㎖의 마이크로 피펫, 피펫으로 부드럽게 세포를 제외한 모든 세포가 웰의 바닥으로부터 분리되는 것을 보장을 재현 탁. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원추형 원심 분리 튜브에 세포를 풀.
    참고 : 여기에 제시된 나흘 프로토콜 이상 문화 기간의 경우, 세포는이 같은 프로토콜을 사용하여 3 일마다 약 형질 전환되어야한다. 2 단계다른 작은 RNA를 처리 한 세포를 풀링 안 보낸 .4 그러나 수정되어야한다. 시험되는 조건이 모두 수집 계산, 별도로 형질 전환해야합니다.
  5. 조심스럽게 상층 액을 흡인하고 PBS 세척 중 적어도 1 mL 중에 세포를 재현 탁. 다음 마이크로 원심 튜브에 세포를 전송 (생존 능력을 평가하기 위해 트리 판 블루 배제를 사용하여 혈구와 예) 라이브 Th17 세포를 계산합니다.
  6. 세포 펠렛을 실온에서 5 분 동안 500 XG 원심 분리기.
  7. 조심스럽게 상층 액을 흡인하고 용액 당 2.5-4 X 107 세포의 밀도로 형질 감염 시스템 10 μL 키트에서 제공 재현 탁 완충액을 사용하여 세포를 재현 탁. 실온에서 세포를 유지합니다.
    참고 : 가이드 라인으로, 30 분 내에 형질 전환 될 수만큼의 세포를 준비하려고합니다. 다수의 배치는 비교 될 수있다.
  8. 각는 MicroC 작은 RNA 1 μL에 세포의 9 μL를 추가entrifuge 튜브. 피펫은 한번 설치 후 피펫 팁 전극에로드 형질 세포 작은 RNA를 혼합한다.
    주 : 일반적으로, 형질 감염 이전 피펫 팁 전극에 거품을 만드는 것을 방지하기 위해 충분히 혼합가되도록 세포 현탁액 9.5 μL를 추가한다.
  9. 실온 전해 버퍼 E. 장소 3 ㎖ 피펫 스테이션 큐벳 내부로 제공 큐벳을 기입 한 후, 큐벳 내부의 위치에 배치 피펫.
  10. 바로 다음의 파라미터를 이용하여 셀과 작은 RNA 각각 10 μL를 혼합 electroporate : 1,500-1,550 펄스 전압을 V, 펄스 폭 10 밀리 초, 3 펄스 형질 장치 합계.
  11. 일렉트로가 완료되면 바로 1X 배양 플레이트의 웰에 제조 된 미디어 Th17가 편광-500 μL에 세포 혼합액을 추가한다. 5 % CO 2 개의 일 이상 37 ℃ 인큐베이터에 넣어 판.
    참고 : 피펫 팅하여 피펫 전극의 끝 부분을 세척위아래로 PBS에서의 각 형질 사이.

3. 인간 수확 Th17 세포

  1. 부드럽게 피펫 팅하지만 모든 세포가 웰의 바닥으로부터 분리되는 것을 보장하는, 마이크로 피펫으로 배양 배지에서 세포를 재현 탁. 기능적 및 / 또는 유전자 발현의 분석을 위해 세포를 준비한다.
    주 : 일상적 충분한 세포가 형질 Th17 세포의 단일 웰에서 수득되는 표면 마커 및 세포 내 사이토 카인 및 전사 인자 염색 유세포 분석 또는 유전자 발현 분석 RNA의 제조에 사용된다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

성공적으로 인간의 Th17 세포를 electroporating의 신뢰할 수있는 시스템을 개발하는 첫 번째 단계는 체외 차별화 된 인간의 Th17 세포 배양에서 강력한 생성하는 것이었다. Th17 - 편광 조건 하에서 배양 된 T 세포는 케모카인 수용체 CCR6 및 전사 인자 RORγt (도 1a 왼쪽)을 나타냈다. T 세포 (오른쪽 그림 1A) 비 편광 (THN) 조건에서 배양했을 때 이러한 마커는 발현되지 않았다. Th17 - 편광 조건 하에서 배양 된 T 세포는 재 자극시 IL-17A를 생성하지만 THN 조건 (도 1B, 우측) (좌측도 1b). Th17 분화 여전히 작은 RNA를 가진 형질 전환 후에 발생하지만, 일부 실험에서, IL-17의 생산의 주파수 (도 1C)에서 관측 된 환...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 프로토콜은 인간 Th17 세포로 소형의 RNA 전달하기위한 개선 된 방법을 제공한다. 인간 Th17 세포가 여기에 사용되었지만, 소형 RNA를 가진 전기의 방법은받은 Th1, TH2 및 Tregs 다른 기본 인간 T 헬퍼 집합으로 사용될 수있다. 세포가 이전에 형질 전환에 문화를 활성화해야합니다 그래서 순진한 CD4 + T 세포에 대해 잘 작동되지 않았습니다. 이 프로토콜을 위해, 우리는 먼저 더 나은 IL-17의 생산을 위해 체외 배양 시스템을 최적화. 가장 큰 요인은 기본 미디어이었다. 우리는 혈청이없는 미디어는 기존의 혈청 함유 생산 IL-17A의 더 나은 유도를 위해 미디어를 인간의 Th17 세포에 우수한 것을 알았다. Th17 세포가 사이토킨 TGFβ, IL-1β, IL-23 및 IL-6의 서브 세트에 의해 발생 될 수 있기 때문에, 우리는 다른 시토 킨의 혼합물을 시험했다. 네 편광 사이토 카인이 포함 된 경우 본 연구에서는보다 강력한 IL-17의 생산을 달성했다. 또한, 우리...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금(R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), 백혈병 및 림프종 학회 학자상(K.M.A.), 미국 국립일반의학연구소(NIGMS) 의학과학자 교육 프로그램(보조금 #T32GM007618)(M.M.)의 지원을 받았습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
항-인간 IL-17A PEebioscience12-7179-42 클론: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITCebioscience11-7319-82클론 : 4S. B3
anti-human CD4 eVolve605ebioscience83-0047-42클론: SK3
마우스 anti-human CD196 (CCR6) BV421BD biosciences562515클론: 11A9
anti-human RORgt AF647BD biosciences563620클론: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450ebioscience48-9459-42클론: 2D1
Foxp3/transcription factor staining 버퍼 세트ebioscience00-5523-00세포 내 전사 인자 유세포 분석 염색
Hu FcR 결합 억제제 정제ebioscience14-9161-71
ImmunoCult-XF T 세포 확장 매체줄기세포 기술10981"무혈청 염기 매체"
MACS CD28 순수 기능 등급, 인간Miltenyi Biotec130-093-375클론: 15E8
항-인간 CD3 정제UCSF 단클론 항체 코어N/A클론: OKT-3
LEAF 정제 안티-휴먼 IL-4Biolegend500815클론: MP4-25D2
안티-휴먼 IFNg, 기능성 등급 정제ebioscience16-7318-85클론: NIB42
재조합 인간 IL-23Peprotech 200-23
재조합 인간 IL-1&베타;페프로텍 200-01B
재조합 인간 TGF-&베타; 1페프로텍 100-21C
재조합 인간 IL-6Peprotech 200-06
siGENOME 제어 풀, 비표적 #2DharmaconD-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORCDharmaconM-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRCDharmaconM-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells KitThermoFisher Scientific11346DHuman CD4+ T cell 분리 키트
네온 Tranfection 시스템ThermoFisher ScientificMPK5000차세대 electroporation 기기
Neon Tranfection 시스템 10 μ L KitThermoFisher ScientificMPK1096
Resuspension Buffer TThermoFisher Scientific키트(MPK1096)"Transfection Resuspension Buffer"
MphoprepStemcell Technologies#07801밀도 구배 매체
costar 6-well tissue culture treated platesCorning3516flat bottom plates
costar 48-well 조직 배양 처리 플레이트Corning3548플랫 바닥 플레이트
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10xBD biosciences555899사용하기 전에 증류수로 1x 용액을 만들어야 합니다
에 제공림.

참고문헌

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).
  2. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).
  3. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14 (9), 585-600 (2014).
  4. Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).
  5. Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).
  6. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).
  7. Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).
  8. Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).
  9. Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).
  10. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  11. Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).
  12. Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).
  13. Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).
  14. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
  15. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

TCD4 TTh17siRNACCR6ROR Gamma TIL 17A
차세대 일렉트로 차 인간 Th17 세포 작은 RNA 형질
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.