차세대 전기천공법은 유전자 발현과 세포 거동을 변경하기 위해 인간 Th17 세포를 작은 RNA로 형질 주입하는 효율적인 방법입니다.
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이 논문에서
요약
초록
CD4+ T cell은 주변 cytokine 환경에 따라 effector T helper cell의 여러 subset으로 분화할 수 있습니다. Th17 세포는 편광 사이토카인 IL-1β, IL-6, IL-23 및 TGFβ의 존재 하에서 활성화하여 in vitro에서 naive CD4+ T 세포에서 생성할 수 있습니다. Th17 세포는 세포외 박테리아 및 곰팡이에 대한 면역을 조직하지만, 이들의 비정상적인 활동은 여러 자가면역 및 염증성 질환과도 관련이 있습니다. Th17 세포는 케모카인 수용체 CCR6에 의해 식별되며 마스터 전사 인자인 RORγt와 특징적인 효과기 사이토카인인 IL-17A에 의해 정의됩니다. Th17 세포 분화를 위한 최적화된 배양 조건은 통제된 환경에서 인간 T 세포 생물학의 기계론적 연구를 용이하게 합니다. 또한 RNA 간섭 또는 microRNA(miRNA) 모방 또는 억제제의 도입을 통해 특정 유전자 및 유전자 발현 프로그램의 중요성을 연구하기 위한 환경을 제공합니다. 이 프로토콜은 차세대 전기천공법(electroporation) 장치를 사용하여 작은 RNA로 분화하는 1차 인간 Th17 세포의 일시적 transfection을 위한 사용하기 쉽고 재현 가능하며 매우 효율적인 방법을 제공합니다.
서론
CD4 + T 세포는 적응 면역 반응의 중요한 관현악입니다. 나이브 CD4 + T 세포는 여러 이펙터 T 세포 (예받은 Th1, TH2, Th17 등)로 현상 할 수있는 로컬 미세 1에 따라 특성 사이토킨 및 전사 인자의 그 자신의 세트 각각. T 세포가 만들어 계보 결정은 자기에게 모두 보호 면역 관용에 대한 중요합니다. Th17 세포 외 박테리아 및 곰팡이를 방지하기 위해 공지 된 T 세포의 서브 세트 중 하나이지만, 그 부적절한 반응은 또한 다발 경화증, 건선과 2, 3과 같이 다수의자가 면역 및 염증성 질환의 병인에 연루되어있다. 인간 Th17 세포는 적절한 환경 편광판 (4)을 제공함으로써 체외 나이브 CD4 + T 세포로부터 생성 될 수있다. 바리오 사이토 카인의 우리 조합은 IL-1β, IL-23, TGFβ, 및 IL-6는 인간의 Th17 세포의 개발을 위해 사용되어왔다. 인간 Th17 세포 CCR6, 통상이 세포 집단을 식별하는 데 사용되며, 그 주요 전사 인자 (....
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프로토콜
이 프로토콜은 인간의 연구 윤리에 대한 UCSF의 지침을 준수합니다.
T 세포 배양, CD4 + T 세포의 분리와 Th17 분극 1. 제조
- 0 일에, CD3에게 항 - 인간 (2 ㎍ / ㎖) 및 항 - 인간 CD28의 웰 당 1.5 ㎖의 코트 6 웰 조직 배양 플레이트 (4 ㎍ / ㎖), 적어도 2 시간 동안 칼슘 및 마그네슘에 함께 PBS에서 37 ° C.
- 대안 적으로, 코트 밤새 39 ° C에서 플레이트. 파라 필름에서 접시를 감싸.
- 제조업체의 지침에 따라 밀도 구배 원심 분리하여 제대혈 단핵 세포 (CBMCs)를 준비합니다.
주의 :주의 깊게 작업 및 혈액 매개 병원균에 노출의 위험을 피하기 위해 인간의 피를 처리 할 때 착용 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 확인합니다. - 단핵 세포를 분리하여 세척 한 후, 음극 실리 의해 인간 CD4 + T 세포의 분리를 수행ction 특 상업용 인간 CD4 + T 세포를 이용하여 키트.
참고 : 단핵 세포 분리 후 적혈구 오염이있는 경우, 옵션 적혈구 세포 용해가 ....
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결과
성공적으로 인간의 Th17 세포를 electroporating의 신뢰할 수있는 시스템을 개발하는 첫 번째 단계는 체외 차별화 된 인간의 Th17 세포 배양에서 강력한 생성하는 것이었다. Th17 - 편광 조건 하에서 배양 된 T 세포는 케모카인 수용체 CCR6 및 전사 인자 RORγt (도 1a 왼쪽)을 나타냈다. T 세포 (오른쪽 그림 1A) 비 편광 (THN) 조건에서 배양했을 때 이러한 마커는 발현되지 않았다. Th17 - 편광 조건 하에서 배양 된 T 세포는 재 자극시 IL-17A를 생성하지만 THN 조건 (도 1B, 우측) (좌측도 1b). Th17 분화 여전히 작은 RNA를 가진 형질 전환 후에 발생하지만, 일부 실험에서, IL-17의 생산의 주파수 (도 1C)에서 관측 된 환.......
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토론
이 프로토콜은 인간 Th17 세포로 소형의 RNA 전달하기위한 개선 된 방법을 제공한다. 인간 Th17 세포가 여기에 사용되었지만, 소형 RNA를 가진 전기의 방법은받은 Th1, TH2 및 Tregs 다른 기본 인간 T 헬퍼 집합으로 사용될 수있다. 세포가 이전에 형질 전환에 문화를 활성화해야합니다 그래서 순진한 CD4 + T 세포에 대해 잘 작동되지 않았습니다. 이 프로토콜을 위해, 우리는 먼저 더 나은 IL-17의 생산을 위해 체외 배양 시스템을 최적화. 가장 큰 요인은 기본 미디어이었다. 우리는 혈청이없는 미디어는 기존의 혈청 함유 생산 IL-17A의 더 나은 유도를 위해 미디어를 인간의 Th17 세포에 우수한 것을 알았다. Th17 세포가 사이토킨 TGFβ, IL-1β, IL-23 및 IL-6의 서브 세트에 의해 발생 될 수 있기 때문에, 우리는 다른 시토 킨의 혼합물을 시험했다. 네 편광 사이토 카인이 포함 된 경우 본 연구에서는보다 강력한 IL-17의 생산을 달성했다. 또한, 우리.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금(R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), 백혈병 및 림프종 학회 학자상(K.M.A.), 미국 국립일반의학연구소(NIGMS) 의학과학자 교육 프로그램(보조금 #T32GM007618)(M.M.)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
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| Hu FcR 결합 억제제 정제 | ebioscience | 14-9161-71 | |
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| MACS CD28 순수 기능 등급, 인간 | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | 클론: 15E8 |
| 항-인간 CD3 정제 | UCSF 단클론 항체 코어 | N/A | 클론: OKT-3 |
| LEAF 정제 안티-휴먼 IL-4 | Biolegend | 500815 | 클론: MP4-25D2 |
| 안티-휴먼 IFNg, 기능성 등급 정제 | ebioscience | 16-7318-85 | 클론: NIB42 |
| 재조합 인간 IL-23 | Peprotech | 200-23 | |
| 재조합 인간 IL-1&베타; | 페프로텍 | 200-01B | |
| 재조합 인간 TGF-&베타; 1 | 페프로텍 | 100-21C | |
| 재조합 인간 IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| siGENOME 제어 풀, 비표적 #2 | Dharmacon | D-001206-14-05 | |
| siGENOME SMARTpool Human RORC | Dharmacon | M-003442-00 | |
| siGENOME SMARTpool Human PTPRC | Dharmacon | M-008067-01 | |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | ThermoFisher Scientific | 11346D | Human CD4+ T cell 분리 키트 |
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참고문헌
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J.
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재인쇄 및 허가
