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방법 논문

S100A12의 발현, 정제 및 항균 활성

8.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55557

⸱

2017년 5월 13일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life and Physical Sciences, Fisk University, 2Tennessee Valley Healthcare Systems, U. S. Dept. of Veterans Affairs, 3Department of Medicine - Division of Infectious Diseases, Vanderbilt University Medical School, 4Department of Biochemistry, Vanderbilt University

이 논문에서

요약

여기에서는 S100A12 (calgranulin C)를 발현 및 정제하는 방법을 제시합니다. 우리는 인간 병원균 H. pylori 에 대한 항균 활성을 측정하기위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

Calgranulin 단백질은 타고난 면제의 중요한 매개체이며 칼슘 결합 단백질 인 EF-hand 계열의 S100 클래스의 구성원입니다. 일부 S100 단백질은 전이 금속을 높은 친 화성으로 결합시킬 수 있고 "영양 면역"과정에서 미생물 병원균 침입으로부터 효과적으로 격리 할 수 ​​있습니다. S100A12 (EN-RAGE)는 아연과 구리를 모두 결합하며 대 식세포와 호중구와 같은 타고난 면역 세포에서 매우 풍부합니다. 우리는 활성, 금속 결합 구성에서 S100A12의 발현, 농축 및 정제를위한 정제 된 방법을보고합니다. 박테리아 증식 및 생존력 분석에서이 단백질의 이용은 S100A12가 박테리아 병원체 인 Helicobacter pylori 에 항균 활성을 가지고 있음을 보여줍니다. 항균 활성은 영양소 아연을 킬레이트 화하는 S100A12의 아연 결합 활성에 기인하며, 이로 인해 아연이 성장 및 P를 필요로하는 H.pylori 가 굶어 죽는다.위험.

서론

S100 단백질은 다양한 기능을 가진 칼슘 결합 단백질의 일종입니다. 그것들은 조직과 세포 특유의 방식으로 발현되며 광범위한 세포 기능을 조절합니다 2 , 3 . 칼슘 결합 단백질에 고유 한 S100 단백질은 세포 내 및 세포 외 기능 모두를 나타냅니다 4 , 5 . 세포 내에서 Ca 2+ 결합은 단백질 결합 파트너를 특이 적으로 표적으로하는 소수성 표면을 노출시키는 구조 변화를 유도합니다. 이 세포 내 메커니즘은 세포 증식, 분화 및 에너지 대사와 같은 중요한 과정을 조절합니다. 세포 외 환경에서 S100 단백질은 두 가지 기능을 나타낸다. 하나는 손상된 분자 패턴 (DAMP) 단백질로 작용하고 친 염증을 일으킨다.패턴 인식 수용체와의 상호 작용을 통한 면역 반응의 초기 반응 8 , 9 . 또한 S100 단백질 군의 여러 구성원은 전이 금속을 격리하며 이는 영양 면역 10 , 11 이라고 불리는 과정에서 미생물 병원균을 굶어 죽이는 역할을한다.

S100A12 (calgranulin C 및 EN-RAGE라고도 함)는 대 식세포 및 호중구에서 많이 발현되며 염증성 질환의 잠재적 인 바이오 마커로 확인되었습니다 12 , 13 . 그것의 EF-Hand 부위에서 칼슘을 결합시키는 것 외에도, S100A12는 이량 체 인터페이스의 양단에 두 개의 고친 화성 전이 금속 결합 부위를 가지고있다 14,15. 각 결합 부위는 3 개의 히스티딘 잔기 및 1 개의 아스파르트 산 잔기로 구성되며 아연 또는 구리를 킬레이트 할 수있다 16 , 17 . 최근에 우리는 S100A12 의존성 아연 결핍이 Helicobacter pylori의 성장과 염증성 독성 인자의 활성을 조절하는데 중요하다고보고했다.

헬리코박터 파일로리 (H. pylori )는 세계 인구의 약 절반에 해당하는 위장에 감염됩니다. 그것은 틀림없이 가장 성공적인 세균성 병원체 중 하나이다 19 . 헬리코박터 파이로리 감염 은 위염 , 소화성 및 십이지장 궤양, 점막 관련 림프 성 조직 (MALT) 림프종 및 침윤성 위암 (위암)을 비롯한 중대한 위암 질환의 결과로 이어질 수 있습니다. 위암은 세계에서 비 - 심장 암 관련 사망의 주요 원인이며, 위암에 대한 가장 큰 관련 위험 요소는 H. pylori 감염 입니다.

헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 는 로브에도 불구하고 위장에 계속 존재한다.이 박테리아 감염을 통제하는 면역 기전의 더 나은 이해에 대한 필요성을 강조했다. 20 , 21 , 22 , 23 . H. pylori와 관련된 염증은 감염 부위에 S100A12를 포함한 항균성 단백질의 레파토리를 입금하는 다형 핵 세포 또는 호중구의 심한 침윤을 특징으로합니다 18 , 24 , 25 . 숙주와 병원체 사이의 복잡한 대화를 이해하기 위해 S100A12를 정제하고이 의학적으로 관련이있는 병원균에 미치는 항생제 영향을 연구하기 위해이 기술을 사용하려고했습니다. 아래의 프로토콜은 생물학적 활성 상태에서의 S100A12 정제 기술을 개량 한 것입니다. 높은 affini와 영양 금속을 바인딩 할 수타이 미생물 침입으로부터 그들을 킬레이트 화시킨다. 또한, 아래의 방법은 선천적 인 항균 분자가 박테리아 병원체의 성장을 제한하는 메커니즘을 연구하기위한 중요한 시약으로서이 단백질의 유용성을 강조합니다.

S100A 계열 단백질은 숙주 방어뿐만 아니라 면역 신호 전달에 관여하는 선천성 면역계 분자의 중요한 그룹으로 인식되어왔다. 이들 중 가장 잘 연구 된 화합물은 calprotectin (MRP-8 / 14, calgranulin A / B, S100A8 / A9)입니다 (28 , 29 , 30) . Calprotectin은 이합체 계면에서 전이 금속을 결합하는 S100A8과 S100A9 서브 유닛의 헤테로 다이머를 형성하는 호중구 - 관련 단백질이다. Calprotectin은 두 개의 금속 결합 부위를 가지고있는 것으로 나타났습니다. Site 1은 Zn 2+ , Mn 2+ 또는 Fe 2+ 를 결합 할 수 있고 Site 2는 Zn 2+ 31 , 32를 결합하라. Calprotectin은 Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli , H. pylori 와 같은 다양한 병원균에 대한 항균 활성을 가지고 있으며 저해 효과는 calprotectin 25 , 28 , 29 .

이전 연구에서 calprotectin은 외막의 지질 A 구조를 변경하고, H.pylori 내 주요 proinflammatory virulence factor 인 cag- Type IV 분비 시스템을 억제하고, biofilm 형성을 유도하고, 억제하는 등 헬리코박터 균에 대한 수많은 활동을 수행했다. 헬리코박터 파이로리 성장 및 생존률class = "xref"> 25 , 33 . 또한, 유전 적 및 생화학 적 분석 결과 칼로필틴의 H. pylori 에 대한 항균 활성은 주로 영양소 인 아연 결합 능력에서 비롯된 것으로 밝혀졌다. 헬리코박터 파일로리 (H. pylori) 는 아연이 필요하며,이 병원균의 미량 영양소 요구량을 확인하기 위해 화학적으로 정의 된 배지를 이용하여 성장하고 증식시키는 이전의 연구에 의해 결정되었다. 또한 칼로 펙틴은 헬리코박터 파일로리에 감염된 조직 내에서 매우 풍부하게 존재하며 호중구의 침윤 물과 관련이 있으며, 이는 감염 및 후속 염증시 항균제로 calprotectin을 사용할 수 있음을 나타냅니다 25 , 35 .

편향된 프로테오믹스 스크리닝 기술로부터 얻은 최근의 증거에 따르면, 반응성 산소 종이 풍부한 조건 하에서는 calprotec주석은 hexa-histidine 결합 부위를 변경하는 post-translational modification을 거침으로써 단백질 36 의 금속 결합 활성을 억제한다. 이와 같이, 우리는이 분자의 광범위한 레파토리 중 다른 S100A 계열 단백질이 잠재적으로 보조 금속 킬레이트 화제로 작용할 수 있다고 가정했다. S100A12는 후속 연구를 위해 전술 한 스크린에서 확인되지 않았기 때문에 S100A12를 선택했다. 아연과 결합 할 수있는 능력을 가지고 있으며 H. pylori 감염 개체에서 유래 한 인간 조직에서 매우 풍부하다.

우리의 연구 결과에 따르면 S100A12는 H. pylori 의 G27 균주에서 H. pylori의 생장 및 생존력을 용량 의존적으로 억제 할 수 있으며,이 단백질의 항균 활성은 과량의 영양소 아연을 첨가함으로써 역전 될 수 있음을 나타냅니다. 이 연구는 PMSS1 및 7.1에 대한 S100A12 항균 활성을 나타내는 이전 연구를 보완합니다3 종의 H. pylori 균주가 H. pylori 18 균주 및 임상 분리 균주에 대한 광범위한 항균 활성을 입증했다. 함께, 이러한 결과는 영양 면제를 통해 박테리아 성장 및 증식을 조절하는 메커니즘으로서 S100A12의 중요성을 확인합니다. 이 중요한 숙주 - 박테리아 상호 작용에 대한 향후 연구에는 숙주 조직 내 박테리아 부담을 줄이거 나 H. pylori 감염과 관련하여 면역 신호 전달에 대한이 단백질의 기여도를 결정하기 위해 S100A12의 활성을 이용하는 것이 포함될 수 있습니다.

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프로토콜

1. S100A12의 발현

  1. 표준 열 충격 프로토콜 18을 사용하여 pGEMEX - S100a12 플라스미드로 유능한 BL21 DE3 세포를 변환하십시오. 얼음에 microcentrifuge 튜브에 박테리아의 50 μL에 플라스미드 1 ~ 5 μL를 추가합니다. 20 분 동안 품어 낸다.
  2. 42 ° C에서 30 초 동안 세포를 열 충격시킵니다.
  3. 얼음에 2 분 동안 세포를 품어.
  4. 세포에 SOC 배지 500 μL를 첨가하십시오. 1 시간 동안 궤도 진탕 기에서 250 rpm으로 흔들어 주면서 37 ° C에서 배양하십시오.
  5. LB - 한천 배지 (100 μg / ML 암피실린으로 보충)에 변형 반응의 플레이트 150 μL. 37 ° C에서 12-16 시간 동안 품어 낸다.
  6. 하나의 식민지를 선택하십시오. LB (100 μg / ML 암피실린과 보충) 2 ML을 예방 접종.
  7. 궤도 진탕 기 (300 rpm)로 37 ° C에서 4 ~ 6 시간 동안 품어 낸다. OD 600 은 1 ~ 3 흡광도 단위를 읽어야합니다.
  8. ZYM-5052 autoindu 50 mL에 starter culture 500 μL 첨가ampicillin 100 μg / mL가 보충 된 배양액 26. 최상의 통기와 최대 발현을 위해서는 250 mL의 배플이있는 삼각 플라스크를 사용하십시오. 37 ° C에서 24 시간 동안 흔들어줍니다 (300 rpm).
  9. 세균 현탁액을 원심 분리 튜브로 옮긴다. 4 ° C에서 원심 분리 (4,000 xg, 10 분)하여 세포를 펠렛.
  10. 미디어를 기울이십시오, 샘플을 기록하고 -80 ° C에 셀 붙여 넣기를 저장하십시오. 샘플은 수년간 안정적입니다.

2. 저압 크로마토 그래피를 이용한 S100A12의 정제

  1. 20 MM 트리스, 산도 8.0의 30 ML에 Resuspend 세포.
  2. 세포 현탁액을 얼음으로 녹여 세포를 용해시킵니다. 5 분 동안 ~ 20W 출력, 5 초 켜짐 및 5 초 꺼짐 사이클 사용.
  3. 솔루션을 고속 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 4 ° C에서 30 분 동안 20,000 xg의 원심 분리로 세포 용 해물을 명확히하십시오.
  4. 상등액을 따라 내고 깨끗한 100 mL 폴리 프로필렌 비이커로 옮긴다. 비이커를 얼음에 붓고 용액을 냉각시킵니다. 약동 추가황산 암모늄 11.20g을 천천히 첨가한다. 용액을 얼음에서 1 시간 더 저어 준다. 이것은 황산 암모늄의 60 % 용액을 만들고 대부분의 대장균 내생 단백질을 침전시킵니다. S100A12는 가용성을 유지합니다.
  5. 침전 된 단백질을 펠렛으로 만들기 위해 20 분 동안 4 ℃, 20,000 xg에서 용액을 원심 분리한다.
  6. 상층 액을 버리고 투석 튜브 (MWCO 3,500 kDa)로 옮긴다. 4 ℃에서 1 L의 20 mM Tris, pH 8.0에 대한 Dialyze. 투석 버퍼를 두 번 변경하십시오. 변경 사이에 4 시간을 허용하십시오.
  7. 음이온 교환 크로마토 그래피
    1. 저압 시스템에서 크로마토 그래피를 수행하십시오. 일반적인 유속은 1 mL / min입니다.
    2. 20 ML 트리스, 산도 8.0 10 ML 5 ML 세파 로즈 컬럼을 평형.
    3. 샘플 펌프를 사용하여 ~ 40 mL의 S100A12 용액을 채 웁니다 (흐름을 수집하십시오).
    4. 컬럼을 20 mM Tris (pH 8) 10 mL로 씻는다.
    5. 0-30 % 그라디언트로 컬럼을 만듭니다 (BuB 컬럼은 19 컬럼 부피 (CV, 95 mL)에서 20 mM Tris, pH 8.0, 1 M NaCl이다. 5 ML 분수를 수집합니다.
    6. 각 분획의 10 μL 분취 량을 취해 쿠마시 염색법으로 MES SDS PAGE를 사용하여 분석하십시오. 30 분 동안 정전압 (20V / cm)을 사용하여 겔을 실행하십시오.
    7. S100A12를 포함한 풀 분획. S100A12는 변성 겔에서 ~ 10 kDa 단백질에서 작동합니다.
    8. 한외 여과 장치 (MWCO 10 kDa)를 사용하여 분획물을 5 mL로 농축시킨다. ~ 8 분 동안 3,000 xg에서 원심 분리하십시오. 최고 분수를 가져 가라.
  8. 크기 - 배제 크로마토 그래피
    1. S75 컬럼을 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl 1 CV (120 mL)로 평형화한다.
    2. 이온 교환 크로마토 그래피에서 얻은 5 mL 이하의 농축 S100A12 분획을 주입하십시오.
    3. 120 mL에 1 mL / m의 유속으로 컬럼을 현상한다. 5 ML 분수를 수집합니다.
    4. 각 분획의 10 μL 분취 량을 취해 SDS PAGE를 사용하여 Coomassie 염색법으로 분석하십시오. 다음을 사용하여 단백질 확인웨스턴 블랏 또는 질량 분광법 (단량체 서브 유닛 10,575.0Da의 계산 된 분자량, 10575.4Da로 측정).
  9. 풀 분수
    1. 분광 광도계를 사용하여 단백질 A 280 의 흡광도를 측정합니다. SEC 버퍼를 공백으로 사용하십시오. S100A12 호모 다이머의 계산 된 흡광 계수는 5960M -1 cm -1 입니다.
      참고 : 일반적인 수확량은 배양액 50 mL 당 S100A12 35-45 mg입니다.
    2. 분주 한 S100A12를 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브 (1 mg / 튜브)에 넣고 -80 ° C에서 액체 질소와 플래시에서 동결합니다.

3. 항균 활성 분석

  1. 5 % 양 혈액 (혈액 한천 플레이트)이 보충 된 tryptic soy 한천 플레이트에 H. pylori 균주 G27 균주. 5 % 이산화탄소가 보충 된 실내 공기에서 37 ° C에서 2-3 일 성장하십시오.
  2. H. pylori 를 1x 콜레스테롤이 보충 된 Brucella 배지에 접종합니다. 문화는 끝났어.37 ℃에서 5 % 이산화탄소가 보충 된 실내 공기에서 밤새 (250rpm) 흔들었다.
  3. H. pylori 1:10을 50 % Brucella broth, 50 % calprotectin 완충액 + 1x cholesterol에 희석하고 배지 단독으로 배양하거나 100 μM zinc chloride와 0, 100 또는 1,000 μg / mL의 정제 된 S100A12를 보충합니다. 37 ℃에서 5 % 이산화탄소가 보충 된 실내 공기 중에서 밤새 진탕 (250 rpm).
  4. 다음날, 일련의 희석을 실시하고 혈액 한천 플레이트에 옮긴다. 5 % 이산화탄소가 보충 된 실내 공기에서 37 ℃에서 2 ~ 3 일 동안 박테리아 콜로니가 자랄 수있게하십시오. S100A12 및 / 또는 외인성 아연의 존재 또는 부재하에 박테리아 성장을 계산하기 위해 식민지 형성 단위를 열거하십시오.

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결과

S100A12 발현 및 정제

세 단계의 정제로 세균 배양액 50 mL에서 재조합 S100A12를 ~ 40 mg 생산했습니다. 첫 번째 단계는 내재 E. coli 단백질의 황산 암모늄 침전이었다. 이 단계 다음에 음이온 - 교환 크로마토 그래피 ( 그림 1A )가 뒤따 랐다. 단백질은 Coomassie Brilliant Blue로 염색 된 SDS-PAGE에 의해 추적됩니다 ( 그림 1B ). 정화 절차의 마지막 단계는 단백질을 분자량과 형태로 분리하는 크기 - 배제 크로마토 그래피 ( 그림 2A )를위한 S100A12를 포함하는 분획을 모으는 것이 었습니다. S100A12는 호모 다이머 (서브 유닛 당 92 아미노산)이고 총 분자량...

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토론

인간 S100A12의 발현 및 정제를위한 효율적인 프로토콜이 제시됩니다. 대장균 발현 시스템은 재조합 단백질 생산에 사용되는 가장 일반적인 도구이며 특히 생화학 및 생물 물리학 연구에 mg이 필요한 경우에 사용됩니다. 여기에 설명 된 절차의 핵심적인 향상은 표준 Luria-broth media 18 을 사용한 발현과 비교하여 정제 단백질의 수율을 거의 30 배 증가시키는 자동 유도 미디어 26 의 사용입니다. 또한 자동 유도 미디어는 단백질 발현 워크 플로를 크게 단순화합니다. 재래 성장 매체를 사용하여, 지수 적 성장 단계 동안 유도제를 첨가 할 수 있도록 배양 물을 연속적으로 모니터링해야한다. 자동 유도 미디어를 사용할 때 배증 시간을 모니터링 할 필요가 없습니다. 배양 물은 포화 상태까지 자랄 수 있습니다. 자동 유도를 통한 성장의 초기 단계배지에서 대장균 은 탄소원으로 포도당을 사용합니다. 일단 포도당이...

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공개 사항

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 재향 군인의 직무 경력 개발 상 1IK2BX001701, 전진 과학 전담 센터의 CTSA 상 UL1TR000445, 국가 과학 재단 상 번호 1547757 및 1400969 및 NIH 부여 GM05551에 의해 지원되었습니다. 이의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 전진을위한 국립 중앙 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 대표하지는 않습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
S100A12 Expression < / strong>
Expression cells < / strong>
BL 21 (DE3) competent cellsNew England BiolabsC25271
자동 유도 배지 구성
요소 효모 추출물Research Products InternationalY20020-250.0
NaClResearch Products InternationalS23020-500.0
트립톤Research Products InternationalT60060-250.0
FeCl3Sigma-AldrichF2877
MgSO4Research Products InternationalM65240-100.0
Na2HPO4Research Products InternationalS23100-500.0
KH2PO4Research Products InternationalP41200-500.0
NH4ClResearch Products InternationalA20424-500.0
Na2SO4Research Products InternationalS25150-500.0
글리세롤연구 제품 국제G22020-1.0
D-포도연구 제품 국제G32040-500.0
유당시그마-알드리치L2643
<강력한>선택제
암피실린연구 제품 국제A40040-5.0
S100A12 Purification
AKTA 시작 크로마토그래피 시스템GE29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast FlowGE17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HRGE17-1166-01
Nanodrop lite 분광 광도계Thermo Fisher ScientificND-LITE
Tris BaseResearch Products InternationalT60040-1000.0
H. pylori Culture
혈액 한천 플레이트Lab Supply CompanyBBL221261
브루셀라 국물Sigma-AldrichB3051
콜레스테롤(250x)Thermo Fisher Scientific12531018
NaCl시그마-알드리치793566
CaCl2Sigma-AldrichC4901
β-메르캅토에탄올시그마-알드리치M6250
트리스 베이스시그마-알드리치T1503
염화아연시그마-알드리치229997
당

참고문헌

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