Method Article

준비 및 체외 자화 특성의 내피 세포를 미르 변성

DOI:

10.3791/55567

⸱

May 2nd, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고는 PEI / MNP 벡터와 자신의 자화에 의해 내피 세포 수 미르 효율적인 비 바이러스 성 전달을 설명합니다. 따라서, 유전자 변형뿐만 아니라,이 방법은 자기 세포 안내와 MRI의 검출 능력 수 있습니다. 이 기술은 치료 세포 제품의 특성을 개선하는 데 사용할 수 있습니다.

Abstract

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현재까지, 심혈관 질환에 사용할 수있는 수술 및 약물 치료 (CVD)는 제한적이며 종종 완화. 동시에, 유전자 및 세포 치료는 CVD 치료에 매우 유망한 대안 적 방법을 제공합니다. 그러나, 유전자 치료의 다양한 임상 적 적용이 매우 적합 유전자 전달 시스템의 부족에 의해 제한된다. 적절한 유전자 전달 벡터의 개발은 세포 치료의 현재 문제점에 대한 해결책을 제공 할 수있다. 등 부상 기관에 제한 효율성과 낮은 세포 유지와 같은 특히, 기존의 단점에서, 적절한 세포 공학에 의해 (즉, 유전) 이전에 이식에 극복 할 수있다. 제시된 프로토콜은 폴리에틸렌 초상 자성 나노 입자 (PEI / MNP) 기반 전달 벡터를 사용하여 내피 세포의 효율적이고 안전한 과도 변형 례를 설명한다. 또한, 알고리즘과 셀 특성화 방법이 정의되어있다. 성공적인 intracellu마이크로 RNA 인간 제대 정맥 내피 세포로 (은 miR) (HUVEC를)의 경 전달 세포 생존, 기능, 또는 간 통신에 영향을주지 않고 달성되었다. 또한,이 방법은 소개 외생은 miR에서 강력한 기능 효과를 일으킬 것으로 입증되었다. 중요한 것은,이 MNP 기반 벡터의인가는 자기 타겟팅 및 비 침습성 MRI 추적 가능성을 수반 셀 자화를 보장한다. 이것은 MRI와 비 침습적 모니터링 할 수있는 자기 유도, 유 전적으로 조작 된 세포 치료제를위한 기초를 제공 할 수있다.

Introduction

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유전자 및 세포 치료는 CVD 처리에 현재의 문제를 해결할 가능성이있는 강력한 도구입니다. 이러한 접근 방법 모두 현재 임상 실험에서 테스트되고 있다는 사실에도 불구하고, 그들은 아직 다양한 임상 적 적용 일에 대한 준비가되지 않습니다. 특히, 유전자 및 세포 치료의 과제를 해결하는 일반적인 접근 방식은 임상 적 적용에 적합한 다기능 유전자 전달 벡터를 개발하는 것입니다. 안전하고 효율적인 유전자 전달 시스템의 부족은 유전자 치료의 주요 관심사입니다. 동시에, 세포 제품의 유전 공학 낮은 효율 (예를 들어, 심장 분야에서 기능 개선 만 ~ 5 % 달성 후 줄기 세포 이식 1과 세포 치료의 심각한 도전을 극복 할 수 이식에 앞서 시간 포 분 이내에 10 % -)와 가난한 유지 / 상해의 사이트에 생착이 (즉, 세포의 유지는 아래 5 방울세인트 애플리케이션, 투여 경로에 관계없이 2, 3, 4).

현재까지, 바이러스 벡터가 크게 임상 시험에서의 넓은 응용 가져왔....

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Protocol

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세포 분리를위한 인간 탯줄은 헬싱키 선언에 따라 연구를 위해이 물질의 사용에 자신의 서면 동의를 준 통보, 건강한 여성에서 분만을 얻었다. 로스 토크 대학의 윤리위원회는 제시된 연구 (REG. 호 2011 년 6 장기간 2013년 9월 23일)를 승인했다.

형질 착물의 제조 1

  1. 폴리에틸렌 이민의 바이오 티 닐화 (PEI).
    1. 300에서 자기 교반하에 초순수에 용해 지형 PEI - 실온 (RT)에서 24 시간 동안 400 rpm으로 0.18 mm의 용액을 얻었다 빛으로부터 보호. 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다.
    2. 수득 된 용액을 21, 22 차 아미노기의 농도를 측정한다.
      1. PR 100 μL를 혼합하여 아민 검출 시약 (23) 2 % 닌히 드린 시약 용액을 사용하여ediluted 샘플 (1 초순수 200) 및 닌히 드린 시약 75 μL. 80 ° C에서 30 분 동안 인큐베이션. 그것을 아래로 냉각 안정화를 위해 50 % 에탄올 100 μL를 추가합니다. 흡수 분광 광도계의 550 nm에서의 흡광도를 측정한다. ....

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Results

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제안 된 프로토콜의 주요 목적은 자기 반응은 miR-수정 세포를 생산하기 위해 자신의 정확한 특성 (그림 1)을 수행하는 것입니다. 따라서, MRI 자기장으로 선택하고 안내 및 검출 응답을 효율적으로 형질 감염된 세포를 수득한다.

먼저, 절연 된 HUVEC의 신원은 내피 세포 마커 CD31 전형적인 염색 (PECAM) (도 2a)에 의해 적절한 기저막 매트릭스 (도 2b)의 튜브를 형성하는 능력에 의해 확인되었다. 얻어진 세포는 미르가 매우 효율적으로 PEI / MNP 도입 채택했다; 현미경 모든 셀은 miR 태그 (Cy3가) 24 시간 후 형질 감염 (도 3a)의 신호에 대해 양성인 것으로 보였다. 중요한 것은, 어떤 세포 사멸은 미처리 .......

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Discussion

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상기 자기 자신의 제어 지침 상자성 나노로드 유 전적으로 조작 된 세포의 제조는 현재의 프로토콜에 제공된다. 이 전략의 성공적인 응용 프로그램은 이식에 대한 타겟팅 전지 제품을 제공함으로써, 같은 부상 영역 2, 3, 4, 낮은 유지와 가난한 생착 등 세포 치료의 어려움의 해결을 위해 수 있습니다. 또한, 적절히 선택 유전 물질의 동시 도입은 전지 특성을 촉진 할 수있어 기능적 이득 (41)을 증가 할 수있다.

현재의 프로토콜은 모델로 된 HUVECs에 개발되었다. 이러한 세포 독성 영향이 18, 19,

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Disclosures

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우리는 공개 경쟁 금융 관심 회원이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 필터링 된 초상 자성 나노 입자의 TEM 이미지를 획득과 자신의 X 선 분석을 수행하기에 기술 지원을위한 G. 풀다 (전자 현미경 센터, 로스 토크 대학, 독일)에 감사드립니다. RTC 로스 토크에서 수행 작업은 연방 교육 연구부 독일 (FKZ 0312138A, FKZ 316159 및 VIP + 03VP00241) 및 EU 구조 기금과 국가 메 클렌 부르크 - 서쪽 포메 라니아 (ESF / IV-WM-B34-에 의해 지원되었다 0030/10와 ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) 및 DFG (DA 1296-1), 축축한 재단 및 독일 심장 재단 (F는 / 01 / 12)에 의해. 프랭크 위호스트 EU FP7 연구 프로그램 "Nanomag"FP7-NMP-2013-LARGE-7에 의해 지원되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PEI 25 kDaSigma Aldrich408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific21335
PD-10 탈염 컬럼GE Healthcare17085101Sephadex G-25 매체
닌히드린 시약 용액 2%Sigma Aldrich7285
글리신Sigma Aldrich410225
Pierce Biotin 정량 분석 키트Thermo Scientific28005
Microplate 리더 모델 680Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere 상자성 입자PromegaZ5481
Millex-HV PVDF 필터MerckSLHV013SL0.45 µ m
Libra 120 투과 전자 현미경Zeiss가속 전압 120  kV
사파이어 X-선 검출기EDAX-Amatek
세포 배양 플라스틱TPP
NHS-Esther Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-31
NHS-Esther Atto 488 ATTO-TEC GmbHAD 488-31
Cy5 miRNA 라벨 IT 키트Mirus BioMIR 9650
비오틴 Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-71
콜라겐분해효소 유형 IV GibcoThermo Scientific17104019
내피 성장 배지, EGM-2LonzaCC-3156 & CC-4176
페니실린/스트렙토마이신써모 사이언티픽15140122100 U/mL, 100 &마이크로; g/mL
MatrigelBD Biosciences356234
anti-PECAM-1 항체Santa Cruzsc-1506
MS MACS 컬럼Miltenyi Biotec 130-042-201
Near-IR Live/Dead Cell Stain KitThermo ScientificL10119
Cy3 염료 라벨링 Pre-miR 음성 대조군Thermo ScientificAM17120Cy3-miR" 또는 "Cyanine-miR3" 원고
내 Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control Thermo Scientific원고에 "scr-miR"로AM17110
Anti-has-miR92a-3p 합성 억제제 Thermo ScientificAM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 시스템Zeiss
파라포름알데히드Sigma Aldrich158127PBS
DAPI 핵 염색Thermo ScientificD1306
NucleoSpin RNA 분리 키트Machery-Nagel740955
mirVana miRNA 분리 키트Thermo ScientificAM1560
TaqMan MicroRNA 역전사 키트Thermo Scientific4366596
StepOnePlus Real-Time PCR 시스템응용 바이오시스템
고용량 cDNA 역전사 키트Thermo Scientific4368814
has-miR-92a TaqMan 어세이Thermo Scientific000431Mature miRNA 염기서열: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready MixNippon GeneticsLS27
ITGA5 TaqMan 어세이Thermo ScientificHs01547673_m1
RNU6B TaqMan 어세이Thermo Scientific001093
18S rRNA 내인성 제어Thermo Scientific4333760F
젤라틴시그마 AldrichG7041
CellTrace Calcein Red-OrangeThermo ScientificC34851
PBSPan BiotechP04-53500
BSASigma Aldrich
MACS 버퍼Miltenyi Biotec 130-091-221
AgaroseSigma AldrichA9539
7.1 Tesla 동물 MRI 시스템Bruker CorporationA7906
ImageJ 소프트웨어National Institutes of HealthNIH(AngiogenesisAnalyzer)로 업그레이드
MPS 장치Bruker Biospin
Matlab 소프트웨어Mathworks
링 네오딤 자석 magnets4you GmbHRM-10x04x05-Gø 10 mm; 잔열성은 ~ 1.3  T, 보자력 ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 이미징 키트Thermo ScientificC10340
FluorSave 시약Merck345789
초음파 수조Bandelin 전자유형: RK 100 SH
" 내 4% 용액 ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
  2. Zeng, L., Hu, Q., et al.

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