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방법 논문

준비 및

7.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55567

⸱

2017년 5월 2일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

이 논문에서

요약

이 원고는 PEI / MNP 벡터와 자신의 자화에 의해 내피 세포 수 미르 효율적인 비 바이러스 성 전달을 설명합니다. 따라서, 유전자 변형뿐만 아니라,이 방법은 자기 세포 안내와 MRI의 검출 능력 수 있습니다. 이 기술은 치료 세포 제품의 특성을 개선하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

현재까지, 심혈관 질환에 사용할 수있는 수술 및 약물 치료 (CVD)는 제한적이며 종종 완화. 동시에, 유전자 및 세포 치료는 CVD 치료에 매우 유망한 대안 적 방법을 제공합니다. 그러나, 유전자 치료의 다양한 임상 적 적용이 매우 적합 유전자 전달 시스템의 부족에 의해 제한된다. 적절한 유전자 전달 벡터의 개발은 세포 치료의 현재 문제점에 대한 해결책을 제공 할 수있다. 등 부상 기관에 제한 효율성과 낮은 세포 유지와 같은 특히, 기존의 단점에서, 적절한 세포 공학에 의해 (즉, 유전) 이전에 이식에 극복 할 수있다. 제시된 프로토콜은 폴리에틸렌 초상 자성 나노 입자 (PEI / MNP) 기반 전달 벡터를 사용하여 내피 세포의 효율적이고 안전한 과도 변형 례를 설명한다. 또한, 알고리즘과 셀 특성화 방법이 정의되어있다. 성공적인 intracellu마이크로 RNA 인간 제대 정맥 내피 세포로 (은 miR) (HUVEC를)의 경 전달 세포 생존, 기능, 또는 간 통신에 영향을주지 않고 달성되었다. 또한,이 방법은 소개 외생은 miR에서 강력한 기능 효과를 일으킬 것으로 입증되었다. 중요한 것은,이 MNP 기반 벡터의인가는 자기 타겟팅 및 비 침습성 MRI 추적 가능성을 수반 셀 자화를 보장한다. 이것은 MRI와 비 침습적 모니터링 할 수있는 자기 유도, 유 전적으로 조작 된 세포 치료제를위한 기초를 제공 할 수있다.

서론

유전자 및 세포 치료는 CVD 처리에 현재의 문제를 해결할 가능성이있는 강력한 도구입니다. 이러한 접근 방법 모두 현재 임상 실험에서 테스트되고 있다는 사실에도 불구하고, 그들은 아직 다양한 임상 적 적용 일에 대한 준비가되지 않습니다. 특히, 유전자 및 세포 치료의 과제를 해결하는 일반적인 접근 방식은 임상 적 적용에 적합한 다기능 유전자 전달 벡터를 개발하는 것입니다. 안전하고 효율적인 유전자 전달 시스템의 부족은 유전자 치료의 주요 관심사입니다. 동시에, 세포 제품의 유전 공학 낮은 효율 (예를 들어, 심장 분야에서 기능 개선 만 ~ 5 % 달성 후 줄기 세포 이식 1과 세포 치료의 심각한 도전을 극복 할 수 이식에 앞서 시간 포 분 이내에 10 % -)와 가난한 유지 / 상해의 사이트에 생착이 (즉, 세포의 유지는 아래 5 방울세인트 애플리케이션, 투여 경로에 관계없이 2, 3, 4).

현재까지, 바이러스 벡터가 크게 임상 시험에서의 넓은 응용 가져왔다 효율의 관점에서 비 바이러스 시스템 (~ 67 %)를 초과 5. 그러나 바이러스 차량은 실시 유전 물질 (6)의 크기에 심각한 (심각한 합병증 및 후속 염증 반응) 등의 면역 원성 등의 위험, 관련한 종양 및 제한을 실시한다. 이러한 안전 문제 및 바이러스 벡터 생산의 높은 비용으로 인해, 비 바이러스 시스템의 사용은 어떤 경우 7, 8 바람직하다. 여기에는 (CVD 처리에 대한 예)를 제어 혈관 성장 인자의 발현 유전자로서 과도 보정을 필요 이상, 또는 대인 수수에 특히 적합백신의 스피.

우리 그룹에서, 전달 시스템은 지형 25 kDa의 폴리에틸렌 이민 (PEI)과 비오틴 - 스트렙 트 아비딘 상호 작용 (9)에 의해 함께 결합 초상 자성 산화철 나노 입자 (MNP)를 조합하여 설계되었다. 이 벡터는 이전의 이식에 대한 그들의 동시 자화를 허용 세포의 유전 공학에 대한 잠재적 인 도구입니다. 후자는 고급 자기 타겟팅 기술이 성공적으로 10을 개발하고 있습니다로, 요즘 특히 유망 자기 안내 / 보존을위한 기초를 제공한다. 또, 얻어진 자기 응답 세포가 될 가능성이있는 비 침습적으로 자기 공명 영상 (MRI) 또는 자기 입자 이미지 (11) (12)에 의해 모니터링.

PEI는 / MNP 벡터의 경우에, 폴리아민은 분해 인자로부터 핵산 축합 따라서 보호를 보장 의, 세포에서 벡터의 국제화 및 엔도 좀은 5 탈출. MNPS 자기 유도의 관점에서뿐만 아니라, 공지 된 PEI 중독 7, 13, 14을 감소시킴으로써뿐만 아니라, PEI의 특성을 보완. 이전 PEI / MNP 벡터 성질은 섬유 아세포와 인간 중간 엽 줄기 세포 (15, 16)를 사용하여 전달 효율 (즉,과의 pDNA의 miRNA) 및 안전성의 관점에서 조정 하였다.

이 논문에서 miRNA의 변성 세포의 발생에 대한 PEI / MNPS의 애플리케이션에 대한 상세한 프로토콜은 17을 설명한다. 이를 위해, HUVECs를 사용하고 체외 혈관 신생에 대한 확립 된 모델을 나타내고있다. 그들은 형질에 도전하고 독성 영향 (18), (19)에 취약엉덩이 = "외부 참조"> 20. 또한, 우리는 그들의 타겟팅, 세포 간 통신 및 MRI 탐지를 포함하여 체외에서 이러한 세포를 평가하는 알고리즘을 제공한다.

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프로토콜

세포 분리를위한 인간 탯줄은 헬싱키 선언에 따라 연구를 위해이 물질의 사용에 자신의 서면 동의를 준 통보, 건강한 여성에서 분만을 얻었다. 로스 토크 대학의 윤리위원회는 제시된 연구 (REG. 호 2011 년 6 장기간 2013년 9월 23일)를 승인했다.

형질 착물의 제조 1

  1. 폴리에틸렌 이민의 바이오 티 닐화 (PEI).
    1. 300에서 자기 교반하에 초순수에 용해 지형 PEI - 실온 (RT)에서 24 시간 동안 400 rpm으로 0.18 mm의 용액을 얻었다 빛으로부터 보호. 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다.
    2. 수득 된 용액을 21, 22 차 아미노기의 농도를 측정한다.
      1. PR 100 μL를 혼합하여 아민 검출 시약 (23) 2 % 닌히 드린 시약 용액을 사용하여ediluted 샘플 (1 초순수 200) 및 닌히 드린 시약 75 μL. 80 ° C에서 30 분 동안 인큐베이션. 그것을 아래로 냉각 안정화를 위해 50 % 에탄올 100 μL를 추가합니다. 흡수 분광 광도계의 550 nm에서의 흡광도를 측정한다.
      2. 글리신을 사용하여 표준 곡선을 작성합니다.
        1. 1 : 1 : 0.1 M 아미노 N 원액과 희석액 (100 ml의 탈 이온수에 글리신 0.75 g), 1- 준비 5 1:10, 1:20 1시 40분, 1:80, 1 : 100, 1 : 200, 1 : 400, 1 : 600. 단계 1.1.2.1에서 이러한 솔루션을 측정 축에 농도와 흡광도와 플롯을 생성한다.
        2. 얻어진 플롯 및 PEI 용액의 흡광도에 기초하여, PEI의 α - 아미노기의 농도를 정의한다.
          참고 :주의. 닌히 드린 시약 용액 전용 후드 사용해야하며, 질소 분위기하에 저장한다. 용액의 색은 산화에 의한 변경시는 사용할 수 없습니다.
    3. 0.01 mm의 용액을 얻었다 사용 직전 초순수에 비오틴 링커 100mg을 녹인다. biotinylating 시약 (몰 단위) 필요량을 얻었다 (20)에 의해 (단계 1.1.2로 측정)에서의 α-PEI의 아미노기의 농도를 곱함으로써 PEI에 추가 비오틴의 요구량을 계산한다.
      1. pH를 8-9로 PEI 용액 비오틴 용액을 첨가하고 실온에서 자기 교반하에 16 시간 동안 배양한다.
    4. 크기 배제 크로마토 그래피 (23)에 의해 미 반응 비오틴을 제거한다. 25-kDa의 PEI의 정화를위한 겔 여과 매체의 적절한를 포함하는 상업적으로 이용 가능한 열을 사용하고 제조업체의 지침을 따릅니다. 아민 검출 시약 (단계 1.1.2)를 사용하여 아민 농도를 측정하여 바이오틴 결합 효율 (단계 1.2.2)을 결정하기 위해 정제 후 분취 량을 취. 4 ° C에서 얻어진 바이오틴 PEI를 저장합니다.
  2. 캐릭터바이오틴 PEI의 화.
    1. 단계 1.1.2에서 설명 된 바와 같이, 바이오 티 닐화 한 후 PEI의 α - 아미노기의 농도를 결정한다.
    2. 공액 절차를 확인하기 위해 PEI의 바이오 티 닐화의 정도를 결정합니다. 정량은 바이오 틸 레벨 (24) (25)의 정확한 색채 판정을 위해, HABA 염료 (4'- hydroxyazobenzene -2- 카복실산)의 적용에 기초한 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용한다. 제조업체가 제공하는 지침을 따르십시오.
  3. MNPS과 특성의 여과.
    1. 더 큰 독성 집계를 배제하기 위해 0.45 μm의 주사기 기반 필터 (16)를 통해 상업적으로 이용 가능한 스트렙 타비 딘 코팅 된 MNP를 필터링합니다. 표준 광도 분석을 사용하여 (26), 최종 철 농도를 측정한다.
    2. 녹화에 의해 필터링 된 MNPS의 품질을 검사표준 프로토콜 27, 28에 따른 자화 곡선 TEM 이미징에 의한.
      1. 증류수 MNP 현탁액을 희석하고, TEM 분석 300 메쉬 Formvar 탄소 코팅 된 구리 그리드에 현탁시키고 3 μL를 배치했다. 그 후, 가열판에서 유리 슬라이드에 격자를 배치하고 건조하자.
      2. 120 kV의 투과형 전자 현미경으로 시료를 분석 및 X 선 검출기 (27)를 이용하여 원소의 함량을 확인.
  4. 슈퍼 해상도 현미경 형질 단지의 3 색 라벨.
    1. 제조업체의 지침에 따라 NHS-에스더 아토 488 염료와 PEI에서 측정 된 차 아미노기의 0.5 % 레이블. (단계 1.1.4) 전술 한 바와 같이, 크기 - 배제 크로마토 그래피에 의해 결합되지 않은 과량의 염료를 제거한다. ASSA 닌 하이 드린을 사용 아미노기 얻어진 농도를 측정Y (단계 1.1.2).
    2. Cyanine5 염료 (재료 목록 표시) 적절한 라벨링 키트 (15)를 이용하여 시판되는 스크램블링은 miR (SCR은 miR-)를 라벨. 얻어진 분광 형광 - 미르 농도를 측정한다.
    3. 갓 1에 MNP를 바이오틴 - 공액 염료 (예, 비오틴 ATTO 565) 각각의 시간 라벨 : 1000 비율 W / W. 직접 Delyangina 등의 세부 사항에 따라, 형질 감염 복합체 형성 동안 미르 / PEI에 MNP를 추가 한 후 염색을 적용한다. (16).

2. 전지 제조

  1. HUVEC 격리.
    1. 직접 탯줄 정맥의 내부로부터 콜라게나 제 소화를 사용하여 코드를 획득하면, 탯줄로부터 세포를 분리; 이전에 개발 된 프로토콜 29을 따르십시오.
      1. t에로드 - 60 개 단위 / 버퍼에서의 콜라게나 제 IV 형 용액의 ml를 각 코드 ~ 부화그 제대 정맥 - 13 분간 37 ℃.
    2. 모든 실험을 위해, 5 명 환자의 최소에서 HUVECs를 수영장.
      참고 : 재배는 4 ~ 5 개 구절을 초과하지 않아야합니다. 이것은 형질 전환 효율의 감소를 원인으로, 마이코 플라스마 오염 된 세포를 사용하지 마십시오. 마이코 플라즈마 오염은 마이코 플라즈마의 고감도 검출을위한 PCR 키트를 사용하여 프로토콜을 시작하기 전에 테스트해야합니다.
      1. 마이코 플라스마의 존재를 테스트합니다.
        1. 10 분 (13,000 XG)을위한 세포 배양 상등액을 원심 분리 한 용액. 3 분 동안 17 DH 2 O의 μL와 종기 (93 ° C)의 펠릿을 중단. DNA의 영역을 증폭하기 위해 서스펜션의 2 μL를 사용하는 다양한 미코 플라스마 종의 고도로 보존 리보솜 RNA를 (16S-rRNA의)에 대한 코드.
        2. PCR을 각각 10 pmol의 프라이머를 사용하여 수행 (정방향 프라이머 : 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 ', 역방향 프라이머 : 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3')을 빗다음 조건에서 PCR 상업용 키트 ination 3 분 동안 94 ° C; 30 초, 30 초, 50 ° C, 30 초 동안 72 ° C, 94 ° C의 45 사이클; 10 분 동안 72 ℃에서 최종 연장.
        3. 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생성물 (292 bp의)을 분석.
    3. 어느 쪽의 5 % CO 2를 함유하는 humidi 인터넷 ED 분위기 하에서 37 ℃에서 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신이 보충 된 내피 성장 배지에서 얻은 세포를 액체 질소 나 배양 그들에 장기간 저장한다.
  2. HUVEC 특성.
    1. 3 표준 프로토콜 (30) 아래의 기저막 매트릭스 튜브 (예, 마트 리겔)를 구축하는 기능적 용량 및 내피 세포 마커 CD31의 발현 (혈소판 내피 세포 부착 분자, PECAM-1)의 측면에 격리 된 HUVEC 특성화1.

3. 형질

  1. 주식 HUVEC 문화 (단계 4.1.2을 참조하십시오.)를 Trypsinize 및 수동 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 70-80 % 컨 플루 언스 (confluence)에 도달 할 때까지 약 13,000 세포의 성장면의 / cm 2, 48 시간 이전에 형질 감염의 개시 세포 밀도, 적당한 크기의 플라스틱 세포 배양 웰 플레이트에 시드 된 HUVEC.
  2. 준비 신선한은 miR / PEI / MNP 때마다 착물.
    참고 : 먼저 미르 / PEI 복합체가 얻어 져야한다 (단계 3.2.1 - 3.2.3) 이어서, 형질 MNPS (단계 3.3)에 사용되는 최종 결과 miR / PEI / MNP 제제를 얻기 위하여 미르 / PEI 용액 (단계 3.2.4)에 추가 될 것이다.
    1. 적절한 상업적으로 이용 가능한 미르 양을 계산 제조업체에서 제공 한 주식의 농도를 사용 (태그 또는 기능, 스크램블, 4 단계 참조). 세포 성장 표면은 miR / cm 2의 2.5 pmol의를 사용합니다. O 5 % 글루코스 용액으로 희석 미르은 miR / μL 0.125 pmol의 최종 농도 btain.
    2. 단계 3.2.1에서 미르 량 25 (32)의 최적 NP 비율에 기초하여, 그 농도를 측정한다 (단계 1.1.2)를 사용하여 PEI의 요구량을 계산한다. 5 % 글루코스 용액을 같은 부피의 PEI를 (필요한 계산 체적 기준) 희석. (단계 3.2.1)에서 미르 용액 얻어진 예비 희석 PEI를 첨가하고 30 초 동안 얻어진 혼합물을 소용돌이.
    3. RT에서 30 분 동안 얻어진 결과 miR / PEI 혼합물을 인큐베이션.
    4. 실온에서 초음파 처리 수조 (재료 목록 참조)에서 적어도 20 분, 35 kHz에서의 MNPS 초음파 처리 미르 / PEI에 MNP 용액의 적당량을 추가 (5 - 조제은 miR / PEI의 철, 25 ㎍ / mL의 / MNP 혼합물을 16), 30 초 동안 소용돌이와 전까지 RT에서 30 분 동안 배양한다.
  3. 세포의 배양 배지에 직접 제조은 miR / PEI / MNP 혼합물 적가. 세포의 막 다른의 얻어진 혼합물을 사용하여은 miR / PEI / MNP로 해부 배지는 트랜 스펙 션 용액에 글루코스 희석 하였다. 신선한 배양액 6 시간 후 형질이 혼합물을 교체합니다.

벡터 안전 4. 분석

  1. 세포 생존율 검사.
    1. (3.1 및 3.2 단계)는 HUVEC를 24- 웰 배양 플레이트에 시딩 형질; 테스트 프로브로는 Cy3-은 miR를 사용하여 유동 세포 계측법에 대한 제어 게이트로 프로브은 miR (SCR은 miR-)를 스크램블링. 24 시간 동안 5 % 이산화탄소를 함유하는 humidi 인터넷 ED 분위기하에 37 ℃에서 인큐베이션.
    2. 상청액을 PBS 및 37 ℃에서 4 분 동안 세포에 첨가 희석 된 1X 트립신 EDTA를 이용하여 형질 감염된 세포를 트립신 수집. 10 분 동안 300 XG 원심 분리기 및 분석을 위해 사용한다.
    3. 24 시간 형질 전환은 거실 / 죽은 세포를 구별하기 위해 시중에서 판매하는 얼룩을 적용하여 유동 세포 계측법 사용 후 세포 생존 미르 흡수 효율을 검사; 사용하는 표준 프로토콜 (15) 까지. 생존을위한 양성 대조군으로 형질 감염되지 않은 세포를 적용합니다.
  2. 기능 분석 세포에 미르 / PEI / MNP 단지의 안전성을 검사합니다.
    1. 형질 전환 된 세포의 증식 활동을 평가합니다.
      1. 형질 HUVEC를 기능적 안티센스은 miR (예, HUVECs를 31 항 miR92a)으로 12 웰 배양 플레이트 (3.1 및 3.2 단계)를 접종하고 24 시간 동안 5 % 이산화탄소를 함유하는 humidi 인터넷 ED 분위기하에 37 ℃에서 배양한다.
      2. 레이저 기반 촛점 현미경 EDU (5-에 티닐 -2'- 데 옥시 우리 딘)과 주사 염색에 의해 증식하는 세포의 수를 정의하기위한 시판 키트를 사용한다. 다음 현미경 설정을 사용하여 오일 침수와 40X 목표를; (a 647 나노 염료) 633 nm의 여기 레이저; (5 개) 임의의 필드는 각 샘플에 기록한다. (총 핵 번호 듀 염색 핵의 수를 나누어 Hoech 증식 세포의 비율을 계산) 세인트 스테인드.
    2. 이전 17 31 바와 같이, 튜브 형상 구조체를 형성하는 형질 세포의 능력을 평가한다.
      1. SCR-은 miR으로 (3.1 및 3.2 단계) HUVEC를는 24- 웰 배양 플레이트에 시딩 형질 5 % CO 2를 함유하는 humidi 인터넷 ED 분위기 하에서 37 ℃에서 48 시간 동안 배양한다. (단계 4.1.1로) 형질 감염된 세포를 수집한다.
      2. 종자 기저막 매트릭스의 140 μL로 코팅 된 24 웰 플레이트에 변성 된 HUVEC 3.5 × 104. 5 % CO 2를 함유하는 humidi 인터넷 ED 분위기에서 37 ° C에서 18 시간 동안 인큐베이션.
      3. 녹음 각 웰하여 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (10 개)의 임의의 필드 화상 (시차 간섭 콘트라스트)과는 '혈관 신생 분석기 "ImageJ에 플러그인 소프트웨어를 사용하여 분석한다. 지점의 총 길이, 지점 수, juncti의 수와 같은 매개 변수를 포함평가의 기능. 처리되지 않은 컨트롤이 비교.
  3. 갭 정션 (GJ)에 형질 감염 복합체의 가능한 독성 영향을 검토하는 차원에서 (FRAP) 33 photobleaching에 후 3D 형광 복구를 테스트하여 세포 간 통신 (GJIC)를 매개 성.
    1. 라이브 세포 이미징 (오일 침지)에 적합한 얇은 바닥 젤라틴으로 코팅 된 유리 슬라이드에 세포를 시드. 비 표지, 비 기능은 miR (SCR은 miR-)와 단계 3.2에서 상술 한 바와 같이 세포를 형질 감염 24 시간 동안 배양한다.
    2. 현미경 전에 직접 칼 세인로로드하여 이미징을위한 세포를 준비합니다. 특히, 20 분 동안 배양, 5 μM의 칼 세인을 함유하는 신선한 배지로 배양 배지를 대체 PBS로 세척하고, 신선한 배지를 추가한다. 37 ° C의 배양기 현미경의 사전 가온하고 5 % 이산화탄소의 농도를 조정.
      참고 : 모든 시약은 세포 contrac을 피하기 위해 따뜻한해야한다측정 전 기.
    3. 세포의 시각화와 FRAP 실험을 위해 561 나노 미터 여기 레이저를 사용합니다. 첫째, 수동으로 관심 영역 (ROI) 등의 측정을위한 셀을 선택; 시험 셀은 적어도 3 개 개의 인접 셀을 가져야한다. 표백되지 밝고 안정된 형광 갖는 기준 셀을 정의한다. A부터 Z 스택의 한계를 정의한다. 층 (15) - (10)을 포함하는 바닥 셀의 상단에서 형광을 기록한다.
    4. 100 %의 레이저 파워를 이용하여 테스트 셀을 표백제 다음 15 분 동안 (이웃하는 셀로부터 GJ 특정 염료 전송하는) 후속 형광 회수를 기록한다. Z 축 (60)의 모든 스택의 원시 데이터를 기록한다. 실험 당 10 테스트 세포 - 총, 이하 5 이상으로 FRAP 측정을 수행합니다. 형질 감염되지 않은 세포에 결과를 비교.

형질 감염 효율 5. 시험

  1. 미르 흡수 시험.
    1. STE에 기재된 프로브를 준비P 4.1 유동 세포 계측법과 미르 흡수를 정의하는 동시에를 사용합니다.
  2. 확인하고 촛점 및 수퍼 해상도 구성된 조명 현미경 (SIM)에 의해 형질 감염 복합체의 세포 내 위치 파악을 설명한다.
    1. (단계 3.1) 이전에 설명한 바와 같이, 24 웰 배양 플레이트의 웰에 배치 젤라틴 - 코팅 유리 커버 슬립에서 HUVEC를 종자. 은 miR / PEI / MNP (단계 1.4) 표지 된 3 색으로 세포를 형질 감염 및 5 % CO 2를 함유하는 humidi 인터넷 ED 분위기에서 37 ° C에서 24 시간 동안 배양한다.
    2. 다만 후 PBS로 완충시킨 식염수 (PBS)에서의 2 % 소 혈청 알부민 (BSA)과 커버 슬립 제 씻고. 표준 프로토콜 DAPI 16 다음 15 개 및 핵 염색을 위해 37 ℃에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 배양하여 세포를 고정한다. 과량의 염료를 제거 진탕 (15 분마다)를 3 회 반복한다.
      참고 : PFA는 발암 신중하게 처리해야합니다.
    3. 홍보를 놓습니다아래에 설명 된대로 현미경 epared 커버 슬립은, 적어도 1 시간 동안 그들을 건조하게하고, 현미경을 사용하고 적절한 설치 매체를 사용하여 슬라이드.
    4. 63X 오일 침지 대물 이미지를 사용하여 다음 SIM 설정 획득 : 여진 용 405-, 488-, 561- 및 633 nm의 레이저 라인; (4)의 평균 각도 5, 5 단계에서 32 비트 깊이와 Z 스택 모드; 633와 405 G2 레이저 라인 격자, 488와 G3하는 561 G4 및 G5.
  3. 미처리 대은 miR / PEI / MNP-된 HUVEC에서 RT-qPCR에 의해 전달 미르 기능을 평가한다.
    1. HUVEC를 기능적 안티센스은 miR로 12 웰 배양 플레이트 단계 (3.1 및 3.2) (예를 들어, HUVECs를 31 항 miR92a) 접종 형질 5 % CO 2를 함유하는 humidi 인터넷 ED 분위기 하에서 37 ℃에서 48 시간 동안 배양한다.
    2. (자료를 참조) 시판 키트를 이용하여 RT-qPCR을 갖는 안티 miR92a 전달 및 처리를 평가; t 따라그는 제조업체의 지침에 다른 곳에서 17, 31 설명한다. 병행하여, 표적 유전자의 발현을 조사 (예 ITGA5 31).
      참고 :이 미르의 실제 결과와 단순히 그것의 세포 내 축적의 측정을 보장하기 때문에 내생은 miR에 대한 AntagomiR 배달 모방을 통해 바람직하다.

평가 및 자기 세포 분리를 대상으로 6 셀

  1. 체외에서 정적 조건에서 대상 셀.
    1. 24 웰 플레이트 (2.5 pmol의 / cm 2-SCR 미르 NP 25, 및 15 내지 25 ㎍ / ㎖의 MNP)는, 24 시간 동안 배양 세척하고 (단계 4) 상기와 같이 수집 된 HUVEC에서 형질.
    2. 물론, 신선한 배지 1 mL의 1로부터 얻은 세포 펠렛을 혼합하고 12 웰 플레이트에 배치. 테이프를 사용하여 플레이트의 하부에 국부적으로 (측면)에 작은 자석을 고정한다.
    3. 24 시간 동안 세포 현탁액을 부화 자석없이 자석을 통해 상기 영역의 면적의 세포 부착 및 성장을 관찰한다. 질적 평가를 위해 기존의 거꾸로 현미경을 사용합니다.
  2. 시험 관내 모의 동적 조건에 타겟팅 전지.
    1. 단계 3.1 및 3.2에 따라 24- 웰 플레이트에서 된 HUVEC 형질 (2.5 pmol의 / cm 2 인 Cy3-미르 NP 25, 15 - 25 ㎍ / mL의 MNP), 24 시간 동안 배양 씻어하여 트립신 처리에 의해 수집 1X PBS에 희석 트립신 EDTA, 37 ℃에서 4 분 동안 세포에 첨가 하였다. 10 분 동안 300 XG 원심 분리기.
    2. 물론, 신선한 배지 1 mL의 1로부터 얻은 세포 펠렛을 혼합하고, 12 웰 플레이트의 웰에 배치. 테이프를 사용하여 (a 웰의 측면에서) 로컬 작은 자석을 고정한다. 진탕 기에서 배양 플레이트를 놓고 동적 조건 (34)을 시뮬레이션 150 rpm에서 12 시간 동안 세포 현탁액을 배양한다.
    3. 세포를 세척하고 수정그들은 4 % PFA를 사용하여. DAPI (16)와 핵을 얼룩. 514 nm의 여기 레이저 스캐닝 레이저 공 초점 현미경을 사용하여 세포 부착을 녹음, Z 스택 모드 (5-12 슬라이스) 분석을위한 이미지를 생성하는 원시 데이터, 및 최대 강도 투사 화상 처리를 얻었다.
  3. 자기 반응과 비 반응 세포의 정량 분석.
    1. 24 웰 플레이트에서 형질 된 HUVEC (2.5 pmol의 / cm 2-SCR 미르 NP 25, 및 15 내지 25 ㎍ / ㎖의 MNP), 24 시간 동안 배양 씻어 전에 기술 된 바와 같이 수집한다 (단계 6.2.1) . 사전 따뜻한 PBS 셀 정렬 버퍼 37 ℃로 (여과에 의해 멸균는 자재 목록 참조). 셀 정렬 버퍼 500 μL로 각 웰에서 얻은 세포 펠렛을 다시 일시.
    2. 자석 신선한 세포 선별 완충액으로 3 회 세척 컬럼 제공된 자석에 의해 고정하는 자기 정렬 열이 세포 현탁액을 적용 및 흐름을 통해 마그네로서 수집캘리 응답 분획 (MAG-).
    3. 자석의 열을 제거하고 즉시 플런저를 사용하여 칼럼을 통해 새로운 셀 정렬 버퍼 밀어 자기 반응성 세포 분획 (마그네틱 +)를 수집한다.
    4. 10 분 동안 원심 분리기 (300) XG MAG-과 탄 + 모두. PBS의 세포 펠렛을 일시 중지 다시, 세포를 계산하고, 트리 판 블루 배제 분석 (35)와 세포 생존 능력을 평가합니다. 얻어진 세포 펠렛 어느 장기 분석을 사용하여 (즉, 리 시드 및 후 24, 48, 72 및 17 시간 배양 평가) 또는 직접 유동 세포 계측법에 대해 (단계 4.1.).
  4. 형질 전환 된 세포의 철 로딩을 정의합니다.
    참고 : 준비하는 동안, 철 산화물 재료 및 악기와 셀 프로브의 접촉을 피해야한다.
    1. 형질 HUVEC를한다 (단계 4.1.1)를 형질 감염되지 않은 제어를 수집. PBS (36) B의 2 % BSA로 두 번 세포를 모아 세척 Y는주의 깊게 세척 완충액 1 ㎖로 세포를 혼합 한 후 10 분 동안 300 XG 원심 분리. , 250 μL의 PBS에서 얻어진 세포 펠렛을 다시 일시 중지 4 % PFA 100 ㎕를 추가하고, 20 분간 세포를 고정하는 동안 배양. 상술 한 바와 같이, PBS로 3 회 반복한다.
    2. PBS 110 μL의 고정 얻어진 세포 펠렛을 다시 중지하고 100 μL PCR 튜브에 옮긴다.
      1. 세포 계수를위한 10 μL 분취 액을 취하여, 자기 입자 분광법 (MPS)의 남은 샘플을 사용한다.
    3. 시중에서 판매하는 MPS 장치에서 측정을 수행합니다. 측정 중에, 다음의 설정을 적용 자기장 B 드라이브 = 25 (MT) 및 주파수 f 0 = 25 kHz로한다. 샘플의 철 정량 2.1 μg의 공지의 철의 양을 가진 MNP 참조 샘플 3, 대응 REF에 MPS 스펙트럼의 제 3 고조파를 정상화외부 참조 "> 37. 컨트롤로 치료 세포를 사용합니다.

7. 정의 MRI 검출 한계

  1. 셀 준비.
    1. 6- 웰 접시에 트랜 종자 된 HUVEC (2.5 pmol의 / cm 2 SCR-미르 NP 25, 15 - 25 ㎍ / mL의 MNP) (팬텀 제조) 세포의 요구량에 따라 중복 또는 삼중있다. 24 시간 동안 세포를 인큐베이션하고 세척 수집하고, (단계 4) 이전에 설명한 바와 같이, 4 % PFA로 고정합니다.
    2. 적합한 세포 수 (예를 들어, 103, 104, 105 등) 분취 량을 준비 얻어지는 세포 수 및 50 μL로 부피를 조절한다.
  2. 아가로 오스 팬텀 준비
    1. 층 (38) 사이에 삽입 된 형질 전환 세포를 상이한 양의 50 ㎖의 튜브에 2 % 아가로 여러 층을 준비한다. 준비, 초음파 처리 및 원심 분리기 뜨거운 아가로 오스 38시유물의 원인이 공기 방울을 파괴한다.
      참고 중요한 비자은 miR / PEI 복합체로 처리 5.5 × 105 HUVEC를 함유 팬텀은 동일한 방식으로 제조한다 대조군 역할을한다.
  3. 상기 코일 중앙에 환상을 배치 한 후 7.1 T 동물 MRI 시스템 체외 팬텀 얻어진 스캔 자계의 Z 축에 평행.
    1. 구배 에코 획득을위한 시퀀스의 다음 시퀀스 파라미터 적용 : TR = 66 MS; TE 1 / 2 TE / TE 3 / 4 TE / TE 5 / 6 TE = 1.44 / 2.88 / 4.51 / 6.11 / 7.60 / 9.01 MS; 플립 각 = 37 °; 매트릭스 = 256 X 256 보간 128 × 128; 도 = 42mm의 필드; 100 %; 평균 = 1, 에코 열차 길이 = 1; 슬라이스 두께 = 1.5 mm; 16 개 조각.
    2. 다른 39 바와 같이, 적절한 소프트웨어를 사용하여 (R2 * = 1 / T2 *)를 네 번 에코의 신호 감쇠 평가 및 R2 * 맵을 계산할.

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결과

제안 된 프로토콜의 주요 목적은 자기 반응은 miR-수정 세포를 생산하기 위해 자신의 정확한 특성 (그림 1)을 수행하는 것입니다. 따라서, MRI 자기장으로 선택하고 안내 및 검출 응답을 효율적으로 형질 감염된 세포를 수득한다.

먼저, 절연 된 HUVEC의 신원은 내피 세포 마커 CD31 전형적인 염색 (PECAM) (도 2a)에 의해 적절한 기저막 매트릭스 (도 2b)의 튜브를 형성하는 능력에 의해 확인되었다. 얻어진 세포는 미르가 매우 효율적으로 PEI / MNP 도입 채택했다; 현미경 모든 셀은 miR 태그 (Cy3가) 24 시간 후 형질 감염 (도 3a)의 신호에 대해 양성인 것으로 보였다. 중요한 것은, 어떤 세포 사멸은 미처리 ...

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토론

상기 자기 자신의 제어 지침 상자성 나노로드 유 전적으로 조작 된 세포의 제조는 현재의 프로토콜에 제공된다. 이 전략의 성공적인 응용 프로그램은 이식에 대한 타겟팅 전지 제품을 제공함으로써, 같은 부상 영역 2, 3, 4, 낮은 유지와 가난한 생착 등 세포 치료의 어려움의 해결을 위해 수 있습니다. 또한, 적절히 선택 유전 물질의 동시 도입은 전지 특성을 촉진 할 수있어 기능적 이득 (41)을 증가 할 수있다.

현재의 프로토콜은 모델로 된 HUVECs에 개발되었다. 이러한 세포 독성 영향이 18, 19,

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공개 사항

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PEI 25 kDaSigma Aldrich408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific21335
PD-10 탈염 컬럼GE Healthcare17085101Sephadex G-25 매체
닌히드린 시약 용액 2%Sigma Aldrich7285
글리신Sigma Aldrich410225
Pierce Biotin 정량 분석 키트Thermo Scientific28005
Microplate 리더 모델 680Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere 상자성 입자PromegaZ5481
Millex-HV PVDF 필터MerckSLHV013SL0.45 µ m
Libra 120 투과 전자 현미경Zeiss가속 전압 120  kV
사파이어 X-선 검출기EDAX-Amatek
세포 배양 플라스틱TPP
NHS-Esther Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-31
NHS-Esther Atto 488 ATTO-TEC GmbHAD 488-31
Cy5 miRNA 라벨 IT 키트Mirus BioMIR 9650
비오틴 Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-71
콜라겐분해효소 유형 IV GibcoThermo Scientific17104019
내피 성장 배지, EGM-2LonzaCC-3156 & CC-4176
페니실린/스트렙토마이신써모 사이언티픽15140122100 U/mL, 100 &마이크로; g/mL
MatrigelBD Biosciences356234
anti-PECAM-1 항체Santa Cruzsc-1506
MS MACS 컬럼Miltenyi Biotec 130-042-201
Near-IR Live/Dead Cell Stain KitThermo ScientificL10119
Cy3 염료 라벨링 Pre-miR 음성 대조군Thermo ScientificAM17120Cy3-miR" 또는 "Cyanine-miR3" 원고
내 Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control Thermo Scientific원고에 "scr-miR"로AM17110
Anti-has-miR92a-3p 합성 억제제 Thermo ScientificAM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 시스템Zeiss
파라포름알데히드Sigma Aldrich158127PBS
DAPI 핵 염색Thermo ScientificD1306
NucleoSpin RNA 분리 키트Machery-Nagel740955
mirVana miRNA 분리 키트Thermo ScientificAM1560
TaqMan MicroRNA 역전사 키트Thermo Scientific4366596
StepOnePlus Real-Time PCR 시스템응용 바이오시스템
고용량 cDNA 역전사 키트Thermo Scientific4368814
has-miR-92a TaqMan 어세이Thermo Scientific000431Mature miRNA 염기서열: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready MixNippon GeneticsLS27
ITGA5 TaqMan 어세이Thermo ScientificHs01547673_m1
RNU6B TaqMan 어세이Thermo Scientific001093
18S rRNA 내인성 제어Thermo Scientific4333760F
젤라틴시그마 AldrichG7041
CellTrace Calcein Red-OrangeThermo ScientificC34851
PBSPan BiotechP04-53500
BSASigma Aldrich
MACS 버퍼Miltenyi Biotec 130-091-221
AgaroseSigma AldrichA9539
7.1 Tesla 동물 MRI 시스템Bruker CorporationA7906
ImageJ 소프트웨어National Institutes of HealthNIH(AngiogenesisAnalyzer)로 업그레이드
MPS 장치Bruker Biospin
Matlab 소프트웨어Mathworks
링 네오딤 자석 magnets4you GmbHRM-10x04x05-Gø 10 mm; 잔열성은 ~ 1.3  T, 보자력 ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 이미징 키트Thermo ScientificC10340
FluorSave 시약Merck345789
초음파 수조Bandelin 전자유형: RK 100 SH
" 내 4% 용액 ,

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