재조합 단백질 발현, 결정화 및 생물 물리학 연구 바실러스 보존 된 뉴클레오티드 피로 인산화 효소, BcMazG

요약

Bacillus anthracis 는 치명적인 흡입 탄저의 병원성 물질이기 때문에 유전자와 단백질에 대한 연구가 엄격히 규제됩니다. 또 다른 접근법은 orthologous 유전자를 연구하는 것이다. B. cereus 의 B. anthracis ortholog (bc1531)에 대한 생물학적 물리 화학적 연구는 최소한의 실험 장비를 필요로하며 심각한 안전 문제가 없다고 설명합니다.

초록

진정한 병원체에서 유전자와 단백질을 연구 할 때 안전 제한과 규제를 극복하기 위해 동질성을 연구 할 수 있습니다. Bacillus anthracis 는 치명적인 흡입 탄저병을 일으키는 절대 병원균입니다. Bacillus cereus 는 B. anthracis 를 가까운 진화 관계로 연구하는 데 유용한 모델로 간주됩니다. B. anthracis 의 유전자 클러스터 ba1554 - ba1558 은 Bacillus thuringiensis 의 bt1364 - bt1368 클러스터뿐만 아니라 B. cereus 의 bc1531 - bc1535 클러스터와 잘 보존되어 있으며 Bacillus 속의 관련 유전자의 중요한 역할을 나타낸다. 이 원고는 B. cereus , bc1531 에서 ortholog의 재조합 단백질을 사용하여 B. anthracis 의 유전자 클러스터에서 첫 번째 유전자 ( ba1554 )의 단백질 생성물을 준비하고 특성화하는 방법을 설명합니다.

서론

재조합 단백질 발현은 제한된 단백질 양 및 유해한 오염과 같은 천연 단백질 공급원과 관련된 문제점을 극복하기 위해 널리 사용됩니다. 또한 병원성 유전자와 단백질 연구에서 추가적인 안전 예방 조치가 필요없는 대체 실험실 균주를 이용할 수 있습니다. 예를 들어, Bacillus cereus 는 Bacillus anthracis 를 가까운 진화 적 관계 로 연구하는데 유용한 모델이다.

B. 탄저균은 사람과 가축에서 치명적인 흡입 탄저병을 일으키는 필수 병원체이며 잠재적으로 생물 표지 ² 로 사용될 수 있습니다. 따라서 B. anthracis 에 대한 실험실 연구는 BSL-3 (생물 안전성 수준 3) 관행을 요구하는 미국 질병 통제 센터 (Centers for Disease Control)에 의해 엄격히 규제되며 실험실 구역을 음의 실내 압력으로 격리하도록 요구합니다. B. anthracis 와는 대조적으로 B. cereus 는 BSL-1 약제로 분류되어 안전에 대한 염려가 거의 없다. B. cereus 는 감염시 식중독을 일으키는 기회 주의적 병원균으로 의료 지원없이 치료할 수 있습니다. 그러나 B. cereus 는 B. anthracis 와 많은 중요한 유전자를 공유하기 때문에 B. cereus ^1의 동족체를 사용하여 B. anthracis 단백질의 기능을 연구 할 수 있습니다.

B. anthracis 의 ba1554 - ba1558 유전자 클러스터는 bc1531 - bc1535 클러스터와 잘 보존되어있다. Bacillus thuringiensis 의 bt1364-bt1368 클러스터뿐만 아니라 B. cereus 의 유전자 조직 및 염기 서열에 관한 것이다. 또한, 각 클러스터의 첫 번째 유전자 ( ba1554 , bc1531 및 bt1364 )는 절대적으로 보존되어 있습니다 ( 예 : 100 % 염기 서열 동일성). implyiBacillus 종에서 유전자 산물의 결정적인 역할. 이러한 유전자 클러스터에서의 위치 때문에, ba1554 는 추정 전사 조절 자로 오인되었다. 그러나 ba1554 산물의 아미노산 서열 분석은 MazG family에 속하는 것으로 나타 났는데, 이는 nucleotide pyrophosphohydrolase 활성을 가지고 있으며 전사 인자 활성과 관련이 없다 ^{4 , 5} . MazG 계열에 속하는 단백질은 전체 서열과 길이가 다양하지만 EXXE _12-28 EXXD 모티프로 특징 지워지는 ~ 100 잔기의 MazG 도메인을 공유합니다 ( "X"는 아미노산 잔기를 의미하고 번호 X 잔기의 수를 나타낸다).

MazG 도메인은 특정 촉매 활동을 직접적으로 설명하지는 않습니다. Escherichia coli (EcMazG)의 MazG 구성원은 2 개의 MazG 도메인을 보유하고 있지만C 말단 MazG 도메인은 효소 적으로 활성이다 ⁶ . 또한, MazG 효소의 기질 특이성은 비특이적 뉴 클레오 시드 트리 포스페이트 (EcMazG의 경우)에서 특정 dCTP / dATP (인테그린 관련 MazG의 경우) 및 dUTP (dUTPases의 경우) ^{6 , 7 , 8 , 9로} 다양합니다. 따라서 BA1554 단백질의 생물 물리 화학적 분석은 NTPase 활성을 확인하고 기질 특이성을 해독하기 위해 필요하다.

여기에 BSL-3 시설이없는 대부분의 실험실이 분자 수준에서 B. anthracis ba1554 의 ortholog 인 B. cereus bc1531 유전자의 단백질 생성물을 특성화하기 위해 따라갈 수있는 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 간단히, 재조합 BC1531 (rBC1531)을 대장균 에서 발현 시키고 친 화성 태그를 사용하여 정제 하였다. X 선 결정학 실험에서 결정rBC1531 단백질의 zation 조건을 스크리닝하고 최적화 하였다. rBC1531의 효소 활성을 평가하기 위해, NTPase 활성을 비색계로 모니터링하여 통상적으로 사용 된 방사성 표지 된 뉴클레오타이드를 회피 하였다. 마지막으로, 얻어진 생 물리 화학적 데이터의 분석은 rBC1531 결정으로부터 X- 선 회절 데이터를 얻는 것뿐만 아니라 rBC1531의 올리고머 화 상태 및 촉매 매개 변수를 결정할 수있게했다.

프로토콜

1. rBC1531의 재조합 단백질 생산 및 정제

1. 재조합 BC1531 단백질 (rBC1531) - 발현 플라스미드
   1. B. cereus ¹⁰ 의 게놈 DNA를 준비합니다.
   2. Bam HI 및 Sal I 제한 효소 부위를 각각 생성하기 위해 정방향 및 역방향 프라이머 (물질 목록 참조)를 사용하여 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 B. cereus 게놈 DNA의 템플레이트로부터 bc1531 유전자를 증폭시킨다.
   3. PCR 제품과 수정 된 pET49b 벡터 (pET49bm)를 BamHI 및 Sal I을 사용하여 분해하고 ¹¹ .
   4. 설명 된대로 10 μL 반응에서 T4 DNA 리가 제를 사용하여 1.1.3 단계에서 소화 PCR 제품과 벡터 (3 : 1 비율)를 섞는다. 18 ° C에서 30 분 동안 품어 라.
   5. chemica 50 μL에 연결 반응 3 μL 피펫유능한 E. coli DH5α 세포를 튜브에 넣습니다. 피펫 팅을 위아래로 부드럽게 혼합하고 얼음에 30 분 동안 두십시오. 42 ° C에서 45 초 동안 열충격. Luria - Bertani (LB) 배지 1 ML을 추가하고 격렬하게 (250 rpm, 37 ° C, 45 분) 떨고있는 동안 세포를 성장.
   6. 단계 1.1.6에서 형질 전환 한 세포 100 μL를 취해 100 μg / mL kanamycin (칸)이 들어있는 LB- 한천 플레이트에 뿌립니다. 37 ~ 18 시간 동안 ~ 18 시간 동안 품어 낸다.
   7. 멸균 팁을 사용하여 식민지를 선택하고 100 μg / ML 칸과 LB 미디어 3 ML의 세포를 성장; 격렬히 흔들어주세요 (250 rpm, 37 ° C, 18 h).
   8. ¹⁰ 설명한대로 알칼리성 SDS의 lysis 방법을 사용하여 플라스미드 DNA를 준비합니다.
   9. DNA sequencing ¹² 를 사용하여 rBC1531 발현 구조의 염기 서열을 확인합니다.
2. rBC1531 단백질의 과발현
   1. rBC1531-exp로 대장균 BL21 (DE3) 균주를 재조합과발현을 위해 단계 1.1.5-1.1.6에 기술 된대로 레 시온 플라스미드를 사용한다.
   2. 식민지를 선택하고 50 μg / ML 칸 (LB + 칸)을 포함하는 LB 매체의 10 ML에서 그것을 성장; 37 ° C에서 18 시간 동안 격렬히 흔든다.
   3. 1L의 LB + Kan 배지에 밤새 배양 10 mL를 접종하고 OD ₆₀₀ (600 nm에서의 광학 밀도)이 ~ 0.7에이를 때까지 37 ℃에서 성장시킨다.
   4. 온도를 18 ° C로 낮추고 재조합 단백질 발현을 위해 1 mM의 최종 농도에서 배양 물에 이소 프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 첨가하기 위해 약 15 분 동안 얼음물에서 배양합니다. 18 ~ 18 ℃에서 16 ~ 18 시간 동안 배양하십시오.
3. rBC1531의 정제
   1. 원심 분리 (5,000 xg, 4 ° C, 30 분)에 의해 세포를 수확. 세포를 방해하지 않도록주의 깊게 상등액을 버린다. 10 MM 이미 다졸이 들어있는 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액 50 mL에 세포를 재현 탁합니다.
   2. 세포 lysates (시간 : 2 분 30 초, 사이클 : 5 초, 사이클 오프 : 10 초, 진폭 : 38 %)의 과열을 방지하기 위해 얼음 sonication에 의해 세포를 두 번 Lyse.
   3. 원심 분리 (~ 25,000 xg, 4 ℃, 30 분)에 의해 세포 용 해물을 맑게한다.
   4. 10 ML 이미 다졸 및 중력 흐름을 포함하는 60 ML 니켈 비즈 3 ML을 섞어 여분의 버퍼 2.5 X 10cm 유리 크로마토 그래피 칼럼에 평형 니켈 구슬을 해결합니다.
   5. 피펫은 사전에 평형 니켈 구슬과 칼럼에 1.3.3에서 뜨는을 전송하고 저속 (~ 20 RPM)에서 회전 바퀴에 4 시간에 2 시간 품어.
   6. 뜨는를 중력에 의해 배수하고 10 MM 이미 다졸을 포함하는 PBS 100 ML로 열에있는 세 번 니켈 구슬을 씻어주십시오.
   7. 250 mM 이미 다졸을 함유 한 PBS 4 x 5 mL를 적용하여 rBC1531 단백질을 용출시켰다.
   8. 1.3.7 단계에서 15 μL의 용리액을 취해 15 % SDS-PAGE에서이를 수행하십시오. 단백질 밴드를 시각화합니다.Coomassie blue 염색법을 사용하여 젤 ¹⁰ .
4. 트롬빈 단백 분해에 의한 rBC1531 단백질의 친화력 태그 제거
   1. 분주를 투석 튜브 (분자량 차단 : 3 kDa)에 피펫과 트롬빈 절단 호환 버퍼 (20 MM HEPES, 산도 7.4, 150 MM NaCl 및 1.5 MM β - mercaptoethanol)의 4 L를 포함하는 비커에 튜브를 놓으십시오. 4 ° C에서 하룻밤.
   2. 분수를 피펫과 원뿔 튜브로 전송합니다.
   3. 280 nm에서 흡광도를 측정하고 설명 된 바와 같이 rBC1531 단백질 농도를 추정.
   4. 0.5 mL 튜브에서 rBC1531 50 μg을 채취하고 다양한 양의 트롬빈 ( 즉, 2, 1, 0.6 및 0.3 단위)을 첨가하십시오. rBC1531과 트롬빈 반응을 20 ℃에서 ~ 3 시간 동안 배양하여 N- 말단 친 화성 태그를 절단하는데 필요한 트롬빈의 최소량을 결정한다.
   5. rBC1531 및 트롬빈 반응을 15 %SDS-PAGE로 확인하고 N 말단 친화력 태그를 완전히 소화하고 태그가없는 rBC1531을 생산하는 트롬빈의 최소량 ( 예 : rBC1531 50 μg 당 0.3 단위의 트롬빈)을 결정합니다.
   6. 10mg의 rBC1531 단백질과 60 단위의 트롬빈을 15 mL 튜브에 넣고 20 ℃에서 3 시간 동안 트롬빈 - 단백질 분해 반응을 일으킨다.
   7. 설명 된대로 분자량 및 용출 부피의 표준 곡선을 만들기 위해 크기 - 제외 크로마토 그래피 (SEC) 칼럼에 겔 여과 표준을 적용하십시오.
   8. 원심 분리 필터 튜브 (분자량 차단 : 3 kDa)에 1.4.6 단계의 트롬빈 소화 rBC1531 단백질을 넣고 4,000 ml에서 3,000 g으로 원심 분리하여 5 mL 미만의 부피로 줄입니다.
   9. 농도가 rBC1531 단백질을 SEC 칼럼에 적용하고 튜브 당 0.5 mL로 60 개의 용출 분획물을 수집하십시오 ¹³ .
   10. 각 분획물 15 μL를 취하여 15 % SDS-PAGE에서 실행하고,Coomassie 염색 용액 (0.15 % (w / v) Coomassie 브릴리언트 블루, 40 % (v / v) 메탄올 및 10 % (v / v) 빙초산)을 사용하여 겔을 만들었다.
   11. rBC1531을 포함하는 분수를 피펫 씩 하나의 튜브에 모으십시오.

2. 결정화 스크리닝 및 rBC1531의 최적화

1. rBC1531 단백질 결정화를위한 스크리닝 조건
   1. 1.4.8에서 설명한대로 원심 분리 필터 튜브를 사용하여 단계 1.4.11에서 rBC1531를 ~ 18.5 mg / mL까지 농축합니다.
   2. 96- 웰 앉아 드롭 결정화 플레이트의 웰에 각 결정화 스크리닝 용액 (섹션 2.2 참조 ⁾ 을 50 μL 씩 첨가한다. 앉아있는 침대에 18.5 mg / mL rBC1531 단백질 용액 0.5 μL를 놓습니다. 용액 전체 0.5 μL와 단백질 용액을 섞어서 전체 플레이트에 대한 과정을 반복하십시오.
   3. 깨끗한 접착 필름으로 판을 덮으십시오.18 ° C에 96 - 웰 플레이트를 놓고 증기 확산을 허용합니다.
   4. 광학 현미경을 사용하여 20 ~ 40 배율로 방울을 스캔하여 2-3 주 동안 매일 크리스탈 형성을 모니터링하십시오.
   5. 얻은 rBC1531 단백질 결정을 사용하여 X- 선 회절 데이터 ¹² 을 수집하십시오.
2. rBC1531 결정화 조건의 최적화
   1. 선택한 초기 결정화 조건 용액 ( 예 : 0.1 M sodium cacodylate, pH 6.5 및 1.0 M sodium citrate) 500 μL를 준비하고 앉은 방울을 위해 24-well crystallization plate를 채 웁니다.
   2. 앉아있는 침대에 18.5 mg / mL rBC1531 단백질 용액 0.5 μL를 넣고 잘 용액 0.5 μL와 섞은 다음 즉시 투명 필름으로 판을 덮습니다. 플레이트를 18 ° C에 놓습니다.
   3. 가벼운 현미경으로 1 주일 동안 결정 성장을 관찰하십시오.
   4. pH를 변화시켜 다양한 결정화 조건을 최적화하십시오 ( 즉,., pH 5.5-6.8)를 사용하고 구연산 나트륨의 염농도 ( 즉, 0.9-1.2 M)를 변경하여 단핵 결정을 얻는다. 1 주일 동안 결정 성장을 모니터하고 X 선 회절 데이터를 수집하십시오. ¹² .

3. rBC1531의 뉴 클레오 시드 트리 포스파타제 (NTPase) 활성의 특성 규명

1. 무기 인산염 비례 검정의 검증
   1. 피로 인산염 (100 MM)의 주식을 준비하고 반응 버퍼 (20 MM HEPES, 산도 7.4, 150 μl)에 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 5.0, 10, 50, 100 및 250 μm의 최종 농도로 희석 mM NaCl 및 2 mM MgCl ₂ )로 ₂ 번 96- 웰 플레이트에서 배양 하였다. 첫번째 판을 대조군으로 사용하십시오 (이것은 피로 포스파타제를 포함하지 않습니다). 두 번째 플레이트에 3.1.2 절에서 설명한대로 작업 플레이트로 pyrophosphatase가 포함되어 있는지 확인하십시오.
   2. Saccharomyces cerevisiae 무기 p 0.01 단위 첨가Yrophosphatase (1 μL)를 작용 플레이트의 웰에 넣고 20 ° C에서 30-60 분 동안 배양합니다.
   3. 몰리브덴 산 암모늄 (0.86 % v / v)과 아스코르브 산 (14 % v / v)을 7 : 3의 비율로 혼합하여 몰리브덴 산 용액을 제조한다. 몰리브덴 산 용액 16 μL를 작업 및 대조 우물에 모두 넣고 15 분 동안 기다린다.
   4. 690 nm (OD 690 nm)에서 광학 밀도를 읽습니다.
2. 비색 NTPase 분석
   1. 100 mM 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 (NTP) 기질을 준비하고 검정 완충액 (20 mM HEPES, pH 7.4) 중 180 μL에서 원하는 농도 ( 예 : 0, 0.2, 4.4, 11, 22, 44, 88, 132 μM) pH 7.4, 150 mM NaCl 및 2 mM MgCl ₂ )에 용해시켰다.
   2. 96- 웰 플레이트에서 반응 당 200 μL까지 단계 3.2.1에서 rBC1531 (1.5 mM) 및 NTP 기질 20 μg을 첨가하고 잘 혼합하기 위해 위아래로 피펫 팅하십시오. 뚜껑을하여 플레이트를 덮고 30 분 동안 37 ° C 배양기에 두십시오기질 가수 분해 반응을 수행한다.
   3. 플레이트를 70 ° C의 수 욕조에 옮기고 15 분 동안 방치하여 rBC1531 매개 촉매 반응을 중지시킵니다.
   4. S. cerevisiae 무기 pyrophosphatase (1 μL) 0.01 단위를 반응 판 (단계 3.2.3)의 각 웰에 첨가하고 20 ℃에서 30 분 동안 배양한다. 몰리브덴 산 용액 16 μL를 반응 판에 첨가하여 색상을 만듭니다 (~ 15 분). OD _690nm 에서 읽으십시오.
   5. ¹² 에서 설명한대로 Michaelis-Menten 방정식을 사용하여 분석하십시오.

결과

본 연구에서 목적 단백질의 특성화는 충분한 양의 재조합 B. cereus bc1531 (rBC1531) 단백질을, 바람직하게는 수 밀리그램 이상으로 제조함으로써 시작되었다. BC1531 단백질을 코딩하는 DNA 단편은 B. cereus 의 게놈 DNA를 주형으로 사용하는 PCR 법으로 ba1554와 동일한 orthologous gene을 포함하고 있으므로 준비 하였다. rBC1531은 대장균 에서 가용성 단백질로 과발현되었다. rBC1531 단백질은 6x- 히스티딘 태그 및 그의 N- 말단 ¹² 에서 트롬빈 절단 부위로 발현되었다. 정제의 첫 번째 단계로서 rBC1531을 니켈 친 화성 크로마토 그래피 ( 그림 1A )로 정제했습니다. 다음으로 트롬빈 소화 시험을 수행하여 rBC1531 ( 도 1A )로...

토론

실제 병원체에 대한 연구는 안전 제한 및 규정으로 인해 제한적입니다. 대안적으로, 진화적으로 관련된 비병원체 또는 덜 병원성 종을 사용하여 병원체를 연구할 수 있습니다. ba1554 유전자는 B. anthracis에서 중요한 유전자로 간주됩니다. 다행스럽게도 비임상 B. cereus 에는 동일한 유전자가 존재합니다.따라서 심각한 안전성 문제 없이 재조합 BC1531 단백질을 생물물리학 및 효소학적 특성화에 사용할 수 있습니다. 여기에서는 유전자에서 정제된 재조합 단백질로 이동하는 자세한 절차를 설명했습니다. 재조합 단백질을 사용하여 생물물리학적 특성 분석을 수행하여 사량체 rBC1531이 NTP 가수분해를 NMP 및 PPi로 촉매한다는 것을 밝혔습니다.

SEC는 rBC1531과 크기가 다른 세포 용해물에서 파생된 단백질 오염 물질을 제거하기 위해 단백질 정제의 마지막 단계로 사용되었습니다. 사량체인 rBC1531의 올리고머화 상...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Bacillus cereus ATCC14579	Korean Collection for Tissue Culture	3624
게놈 DNA 준비 키트	GeneAll	106-101	게놈 DNA 준비
Forward primer	Macrogen	GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA	BamHI site에 밑줄이 그어짐
Reverse primer	Macrogen	CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG	SalI 사이트에 밑줄이 그어져 있습니다.
nPfu-Forte	Enzynomics	P410	PCR polymerase
BamHI	Enzynomics	R003S
SalI	Enzynomics	R009S
pET49b 발현 벡터	Novagen	71463	친화력 태그와 BamHI/SalI sites10
T4 DNA ligase	Enzynomics	M001S
Dialysis memebrane	Thermofisher	18265017
Dry block heater	JSR	JSBL-02T
LB broth (Luria-Bertani)	LPS solution	LB-05
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)를	Becton, Dickinson and Company
Kanamycin	LPS 솔루션	KAN025
Mini-prep kit	Favorgen		FAPDE300 Plasmid DNA preparation
BL21(DE3) Competent cell	Novagen	69450-3CN
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Fisher BioReagents	50-213-378
염화나트륨	대정	7548-4100	PBS 재료
염화칼	대정	6566-4405	PBS 재료
인산칼	Bio Basic Inc	PB0445	PBS 재료
인산나트륨	Bio Basic Inc	S0404	PBS 재료
Imidazole	Bio Basic Inc	IB0277
Sonicator	Sonics	VCX 130
Ni-NTA agaros	Qiagen	30210	니켈 비드
로테이터	Finepcr	AG
Precision Plus 단백질 이중 색상 표준	Bio-rad	1610374	SDS-PAGE 단백질 표준
Coonmassie Brilliant Blue R-250	Fisher BioReagents	BP101-25	Coomassie 염색 용액
메틸 알코올	삼천 화학 물질	M0585	Coomassie 염색 용액
아세트산	Daejung	1002-4105	Coomassie 염색 용액
투석 memebrane	Thermofisher	68035
2-Mercaptoethanol	Sigma-aldrich	M6250
Thrombin	Merckmillipore	605157-1KUCN	20 &mu의 부분 표본을 준비합니다. L (&mu 당 1 단위; L) 70°C에서 보관합니다. 사용 전 C 및 해동
Superdex 200 16/600	General Electric	28989335	크기 제외 크로마토그래
겔 여과 표준	Bio-rad	151-1901
원심 필터	Amicon	UFC800396
Crystralization plates	Hampton research	HR3-083	96-well sitting drop plate
JCSG 코어 스위트 I-IV	Qiagen	130924-130927	결정화 secreening 용액
현미경	Nikon	SMZ745T
Cryschem 플레이트	Hampton Research	HR3-158	24-well sitting drop plate
무기 피로포스파타제	시그마	10108987001
암모늄 몰리브덴산염 용액	시그마	13106-76-8
L-아스코르브산	Sigma	50-81-7
NTP 기판	Startagene	200415-51
분광 광도계	Biotek	SynergyH1	마이크로 플레이트 리더
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