CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

요약

형광 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 겔 전기 영동, 모세관에 결합 여기에 설명 된 기술 유전자형은 뉴 클레아 제 매개 녹아웃 클론의 높은 처리량 유전자형을 허용한다. 그것은 다른 유전자형 기술에 의해 직면 한 한계를 우회하고 시퀀싱 방법보다 더 비용 효과적입니다.

초록

프로그램 게놈 편집 도구의 개발은 특정 게놈 서열이 세포 전체 유기체의 기능에서하는 역할을 이해하는 역 유전학의 사용을 촉진했다. 이 원인은 엄청나게 CRISPR의 최근 도입 연구자하기 위해, 다른 것들 중, 게놈과 전 사체를 조작 노크, 노크, 또는 표적 유전자에 노크 할 수 있습니다 / Cas9 시스템 - 다용도 도구의 도움되었습니다 방법. 유전자를 녹아웃의 목적을 위해, CRISPR / 이중 가닥 나누기 휴식 사이트에서 뉴클레오티드의 틀 이동을 유발하는 삽입 또는 삭제를 소개하는 비 동종 최종 합류 DNA 수리 경로를 모집 Cas9는 매개. 그러나, 개별 가이드 RNA가 바람직하지 않은 오프 대상 영향을 일으킬 수 있으며, 이들을 배제하기 위해, 여러 가이드의 RNA의 사용이 필요하다. 대상이 또한 다수의 클론 대량 선별이 교대 EF에서의 사용을 돌려서, 이는 요구되는 것을 의미녹아웃 클론 유전자형 높은 처리량 기술을 ficient. 현재 유전자형 기술 중 하나는 따라서 높은 처리량을 위해 적합하지 않다 렌더링, 본질적인 한계로 고통 또는 높은 비용이 발생. 여기서, 주형으로 조 세포 용 해물로부터 게놈 DNA를 사용하여 형광 PCR을 사용하고, 모세관 젤 전기 영동을 통해 PCR 단편을 해결하기위한 우리 상세히 프로토콜. 이 기법은 하나의 단편 간의 염기쌍의 차이를 구별하기에 충분히 정확하고, 따라서 표적 유전자의 코딩 서열의 프레임 이동의 유무를 나타내는에 적합하다. 이 정확한 지식을 효과적으로 확증 시퀀싱 단계의 필요성을 배제하고 사용자가 그 과정에서 시간과 비용을 절약 할 수 있습니다. 여기에 다른 곳에서와 같이 또한,이 기술은 다수의 유전자에 대한 가이드 RNA를 표적 다양한 조직 기원의 다양한 포유 동물 세포 유전형에 다양한 것으로 입증되었습니다.

서론

역방향 유전 방식은 과학자들이 셀 또는 전체 유기체의 게놈의 특정 변경의 효과를 규명 할 수있다. 예를 들어, 특정 유전자의 발현이 세포의 또는의 기능을 갖는다는 효과를 확인하기 위해 유전자 녹다운 ^{(1, 2)} (부분 감소) 또는 유전자 녹아웃 ^{(3), 4} (완전 제거)에 의해 감쇠 될 수있다 유기체의 개발.

유전자 녹아웃 (knockout) 실험은 징크 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성화 제와 같은 이펙터 클레아 (TALENs)와 같은 특정 프로그램 시퀀스 클레아의 도입 이후 쉽게되고있다. 그러나 정기적으로 짧은 회문 반복 (CRISPR)을 산재 클러스터 된의 상대적으로 최근의 특성화 / Cas9 시스템은 세대를 수행 할 수있는 전 세계 모든 실험실은 매우 간단했다전자 녹아웃 실험. 본질적으로, CRISPR / Cas9 시스템은 두 개의 필수 성분-A 인식 및 게놈의 특정 염기 서열에 상보성 단일 결합을 통해 가이드 RNA (sgRNA) 및 Cas9라고하는 효소로 구성된다. 게놈 DNA의 sgRNA-Cas9 복합체의 ....

프로토콜

1. CRISPR / Cas9-대상으로 단일 세포 클론을 얻기

1. 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 보충 된 항생제가없는 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 2 ㎖로 웰 당 500,000 개의 세포로 6 웰 플레이트에 시드 인 HepG2 세포. 37 ° C에서 24 시간 및 5 % CO ₂ 부화.
2. 와 형질 세포 플라스미드 공동 발현 제조업체의 지침에 따라 적절한 형질 전환 시약을 사용하여 Cas9 관심의 유전자에 대한 특정 sgRNA합니다.
   주 : 앞서 설명한 ⁽⁴⁾ 예를 들어, sgRNA는 pSpCas9 (BB) -2a-GFP 벡터로 클로닝 될 수있다.
3. 새로운 항생 배지 2 mL를 형질 감염 후 16 시간 - 배양 배지를 교체 4.
4. 형질 전환 후 48 시간이 세포 trypsinizing하여 단일 세포 현탁액을 수집한다.
   1. 0.25 % 트립신 EDTA 0.2 mL의 세포를 Trypsinize 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다. thoroughl 배지 1 ㎖를 첨가하고 재현 탁와이.
5. 이전 ¹² 바와 같이, GFP 양성 클론 세포를 정렬하고, 약 3,500 ....

결과

여기에 설명 된 PCR 형광 모세관 전기 영동 기술은 외래 DNA 전달하는 의무가 거의 모든 세포주에서 유전자 타겟팅 임의 영역에 적용될 것으로 기대된다. 우리는 이전에 대장 암 세포주 ¹² 세 유전자를 대상으로 자사의 응용 프로그램을 증명하고있다. 여기서, 우리는 CRISPR와 대상으로 간암 세포주 인 HepG2를 유전형에서의 효능 / Cas9 1 (NAP1L1) 유전자와 마찬가지로 뉴 클레오 단백질 조립 한 구성에 대해 도시한다. 사실, 우리는 성공적 수많은 다른 유전자 ^(12)를 대상으로 인간을 제외한 포유 동물 ^{세포주, (13)를} 포함하여 다양한 세포 유전형하는 형광 PCR 모세관 전기 영동 방법을 이용했다.

토론

선택의 모델 세포주에서 특정 유전자에서 노크는 유전자가 특정 세포 맥락에서하는 역할을 해명하기위한 일상이되었다. 사실, 여러 게놈 넓은 화면은 게놈 ^{14, 15, 16에} 거의 알려진 모든 인간의 유전자를 대상으로 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하는 현재 사용할 수 있습니다. 이러한 대규모의 화면 (또는 관심의 개별 유전자의 대상도 소규모)로, 설계와 같은 유전자의 다른 궤적을 대상으로 sgRNAs을 활용하는 것이 중요하다. 명백하게 유전자의 고갈의 실제 효과 항복 것이 사용되는 다른 sgRNAs 일관된 결과. 이와 같이, 하나 개의 유전자 타겟팅을 정확하게 사용 개별 sgRNA 각각으로부터 다수의 클론 유전자형 고용량 유전자형 단계를 필요로한다. 형광 PCR 모세관 전기 영동 기술은 그 설명정확하게이 작업을 수행 할 수 있습니다 다시.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HEPG2 세포	ATCC	HB-8065
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	SH30022.01
HyClone Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	SV30160.03
pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid	Addgene	PX458
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific
트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드	Thermo Fisher Scientific	25200056
트립신-EDTA (0.5%), 페놀 레드 없음	Thermo Fisher Scientific	15400054
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
HyClone Water, 분자생물학 등급	GE 헬스케어	SH30538.02
CRISPR sgRNA 삽입 올리고뉴클레오티드(감지)	AITbiotech	없음	서열: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'CRISPR
sgRNA 삽입 올리고뉴클레오티드(안티센스)	AITbiotech	없음	서열: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'
표지되지 않은 PCR 증폭 포워드 프라이머	AITbiotech	없음	서열: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; 이 프라이머는 PCR 증폭 대립유전자
6-FAM 표지 형광 PCR 전방 프라이머	AITbiotech	없음	염기서열: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'HEX
-표지 형광 PCR 전방 프라이머	AITbiotech	없음	염기서열: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
라벨링되지 않은 PCR 역방향 프라이머	AITbiotech	없음	서열: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'Taq
PCR 코어 키트	QIAGEN	201223
Hi-Di 포름아미드	Thermo Fisher Scientific	4311320
GeneScan 500 LIZ 염료 크기 표준	Thermo Fisher Scientific	4322682
MicroAmp Optical 96-Well 반응 플레이트	Thermo Fisher Scientific	4306737
3500xL Genetic 분석기	Thermo Fisher Scientific	4405633
3500 Series 2 program	Thermo Fisher Scientific	4476988
Gene Mapper 5 program	Thermo Fisher Scientific	4475073
Gentra Puregene Cell Kit	QIAGEN	1045696
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9282
NAP1L1 항체 ( N-term)	Abgent	AP1920b
Nuclear Matrix Protein p84 항체 [5E10]	GeneTex	GTX70220
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	515-035-003

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