Multiparameter fluorescence immunohistochemistry는 종양의 미세 환경에서 면역 세포 집단의 수, 상대 분포 및 위치를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 원고는 구강 인두 암에서 T 세포 subpopulation을 분석하는이 기술의 사용을 설명합니다.
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방법 논문
포르말린 - 고정, 파라핀 - 임베디드 인간 구강 성 편평 세포 암종 샘플에서의 T 세포 아군의 4 색 형광 면역 조직 화학
이 논문에서
요약
초록
4 색 형광 immunohistochemistry (IHC) 기술은 조직의 상대 분포와 위치를 고려하면서 관심있는 세포 집단을 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 다양한 종양 유형에서 면역 침윤을 연구하기 위해 광범위하게 적용되었습니다. 종양 미세 환경은 종양 부위에 끌리는 면역 세포에 의해 침투된다. 다른 면역 세포 집단은 종양의 미세 환경에서 다른 역할을하고 질병의 결과에 다른 영향을주는 것으로 밝혀졌습니다. 이 원고는 oropharyngeal 편평 세포 암 (OPSCC)에 대한 다중 매개 변수 형광 IHC의 사용을 예로 설명합니다. 이 기술은 관심있는 다른 조직 샘플 및 세포 유형으로 확장 될 수 있습니다. 제시된 연구에서, 우리는 큰 OPSCC 코호트 (n = 162)의 상피 및 간질 구획을 분석했다. 우리는 총 T 림프구 (CD3 + ), 면역 억제 조절간질에서 종양 상피를 구별하기 위해 핵 역지사를 사용하여 T 세포 (Tregs, 즉 FoxP3 + ) 및 T 헬퍼 17 (Th17) 세포 ( 즉, IL-17 + CD3 + 종양 내 IL-17 + 비 T 세포의 수가 적은 환자에서 높은 수의 T 세포가 무병 생존율의 개선과 상관 관계가있는 것으로 나타났다. 이는 IL-17 + non-T 세포가 OPSCC의 면역 반응이 좋지 않음을 암시하며 이는 IL-17과 암 환자의 생존율이 낮은 경우의 상관 관계와 일치한다. 현재, 새로운 다중 매개 변수 형광 IHC 기술은 최대 7 개의 형광 색소를 사용하여 개발되고 있으며, 종양 미세 환경에서 면역 세포의보다 정확한 특성 분석 및 국소화를 가능하게 할 것입니다.
서론
Oropharyngeal 편평 세포 암 (OPSCCs)은 구강 인두에서 기인 한 편평 세포 암의 이질적인 그룹입니다. OPSCC의 위험 요소에는 HPV (human papillomavirus) 감염과 알코올 및 담배 사용이 포함됩니다 1 , 2 . 면역 반응의 역할과이를 임상 환경에서 사용하는 방법이 이제 막 연구되기 시작했습니다. 종양 미세 환경은 암세포에 끌리는 면역 세포에 의해 침투됩니다. 높은 CD8 + 세포 독성 T 세포 주파수 OPSCC 환자 3 향상된 생존율과 상관 하였지만, Tregs와 Th17 세포를 포함하는 다른 T 세포 서브 세트의 역할은 아직 불분명 4. 받은 Th1과 Th17 세포가 면역 반응 대상으로 종양 세포에 도움을 해야하는 반면, Tregs는 다른 T 세포 (5)의 활동을 억제하는 자신의 능력에 대한 알려져있다. 그러나, T의 존재regs는 서로 다른 종양 유형에서 호의적 인 반응과 바람직하지 않은 반응과 상관 관계가있는 것으로 밝혀졌습니다 6 . 혈액에 존재하는 모든....
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프로토콜
환자 샘플은 네덜란드 생명 과학 사회 연합 (www.federa.org)의 인체 조직의 적절한 부차적 사용을위한 행동 강령에 설명 된 의료 윤리 지침에 따라 처리되었습니다.
1. 슬라이드 준비
- 절제 된 물질을 사용할 수있는 의료 윤리위원회의 허가를 얻은 후 병리과에서 절제 된 조직 물질 (모든 종류의 조직)을 얻습니다.
참고 : 현재 실험을 위해, 전처리 종양 샘플 (N = 162) (13) 전 기술로 선정, 라이덴 대학 의료 센터, 라이덴, 1970 년과 2011 년 사이에 네덜란드에서 진단 차 인두 종양에서 얻었다. 조직의 크기는 종양 내부에 4 개의 현미경 이미지를 안정적으로 취할 수있는 충분한 양의 종양 조직에 대한 요구 사항에 의해서만 제한되었습니다. - 최소 12 시간 동안 4 % 완충 포르말린에 조직을 고정. ag에서 조직 탈수에탄올의 습격 시리즈. 자일 렌으로 씻고 자동 티슈 프로세서를 사용하여 파라핀 왁스에 묻습니다.
- 마이크로톰을 사용하여 유리 슬라이드에 4 μm 두께의 포르말린 고정, 파라핀 내장 (FFPE) 조직 절편을 자릅니다. 표준 절차를 사용하여 조직 블록을 마이크로 톤 조직 홀더에 놓습니다.<....
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결과
상기 프로토콜을 사용하여 염색 하였다 (N = 162)을 이전에 기재된 13 바와 같이 라이덴 의료원 라이덴 1970 년과 2011 년 사이 네덜란드 진단 차 인두 종양에서 얻은 FFPE 예비 처리 종양 샘플의 일련의 선택. 각 슬라이드의 1 ~ 4 개의 임의 이미지가 분석되었습니다 ( 그림 1 ). 일부자가 형광 세포가 표시되며 이는 완전한 노란색 외관으로 명확하게 구분할 수 있습니다. 진정으로 이중 또는 삼중 양성 세포는 예상되는 국소화에서 특정 항체에 대해 양성이며 세포막 또는 핵에 존재한다. 음성 대조군 슬라이드는 백그라운드 조직자가 형광보다 높은 특이적인 염색을 보이지 않았으며 ( 그림 2 및 그림 4 ), 모든 신호가 1 차적으로 인식 된 표적에 특이하다는 .......
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토론
설명 된 프로토콜에 대해 가장 중요한 단계 중 하나는 사용 된 1 차 항체의 정확한 희석을 결정하는 것입니다. 이러한 특정 알레시 - 라벨 항체의 제조 업체가 권장하는 바와 같이, 표지 2 차 항체의 희석은 1 : 200이었다. 일차 항체의 희석은 바람직하게는 의도 된 조직 유형 (이 경우, OPSCC)의 2 개의 상이한 샘플을 사용하여 연속 희석에 의해 결정되어야한다. 최적의 작업 희석은 배경 잡음이없고 동일한 농도의 음성 대조군에 대한 신호가없는 명확한 신호가 얻어지는 희석입니다. 이용 가능한 현미경 유형 및 연구자의 선호도에 따라, 2 차 항체 및 장착 매질의 유형에 관한 수정이 이루어질 수있다. 의도 한 결과가 달성되지 않으면 배경 신호에 문제를 일으키는 것으로 알려진 유리 슬라이드 유형을 조사하는 것이 좋습니다 특별한 종류의 염색 용액 ( 예, Perma Blue). 둘째, 일부 항원은 열 유도 항원 결정 인자 검색을 사용하여 혼란을 일으킬 수 있습니다. 이 경우, 연구원은 버퍼의 가열 단계.......
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공개 사항
저자는 상업적 또는 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
Simone Punt는 Dutch Cancer Society의 허가 UL2010-4801에 의해 지원되었습니다. Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter 및 Sjoerd van이 JoVE 프로토콜을 기반으로 한 원저자의 모든 공동 저자들에게 감사드립니다. der Burg.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone 및 Histostar | 자동화 조직 프로세서 | |
| Histostar | Thermo Scientific | 조직 블록 임베딩 기계 | |
| 포름알데히드 | 베이커 | ||
| Xylol | Merck | ||
| 에탄올 | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| 파라핀 왁스/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| 마이크로톰 티슈 홀더 | Leica | RM225 | |
| Flex IHC 사이드 | Dako | 티슈 슬라이드 | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | 시그마 | A9647 | |
| 토끼 항 CD3 | Abcam | ab828 | 적정 필요 항체 희석 |
| 마우스 IgG1 항 FoxP3 | Abcam | ab20034 | 적정 필요 항체 희석 |
| 염소 IgG 항 IL-17 | R & D Systems | AF-317-NA | 적정 필요 항체 희석 |
| Rabbit Ig isotype control 항체 | Abcam | ab27472 | |
| Mouse IgG1 isotype control 항체 | 사용 Abcam ab91353 | anti-FoxP3 | |
| Goat IgG isotype control 항체 | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | 다음과 동일한 최종 농도에서 사용 anti-IL-17 |
| 당나귀 anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | 1% BSA/PBS |
| 당나귀 anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | 1% BSA/PBS |
| 당나귀 anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | 을 함유한 1% BSA/PBS VectaShield에 1:200 희석 |
| LSM700 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | 버전 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | 버전 4.2.0.121 | www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html 에서 다운로드 할 수 있습니다. |
| SPSS | IBM 주식 회사 | 버전 20.0 | |
| ImageJ | 버전 1.50i | http://rsb.info.nih.gov/ij 에서 다운로드할 수 있습니다. |
참고문헌
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al.
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재인쇄 및 허가
