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방법 논문

만성 외상성 뇌증 모델링을위한 새로운 방법

8.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55602

⸱

2017년 7월 4일

 , 
1Division of Neuropathology, Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine

이 논문에서

요약

여기, 우리는 Drosophila melanogaster 에서 닫힌 머리 외상성 뇌 손상을 일으키는 새로운 접근법을 설명합니다. 우리의 방법은 조정 가능한 강도로 반복적 인 충격을 머리에 직접 전달하는 장점이 있습니다. 무척추 동물 시스템의 추가 탐구는 만성 외상성 뇌증의 병인을 밝히는 데 도움이 될 것입니다.

초록

만성 외상성 뇌병증 (CTE)은 반복적 인 경미한 외상성 뇌 손상 (mTBI)에 대한 노출과 밀접하게 관련된 확립 된 신경 퇴행성 질환입니다. 복잡한 병리학 적 변화를 초래하는 기전은 신경 병리학 적 기준을 정의하는 최근의 합의에도 불구하고 크게 애매하다. 여기에서 우리는 Drosophila melanogaster ( Drosophila )에서 CTE 모델을 개발하여 뇌에서 특유의 과산화 된 타우 축적 및 신경 세포 죽음을 유도하는 핵심 유전자와 경로를 확인하려는 새로운 방법을 설명합니다. 경미한 닫힌 상처를 입히기 위해 조정 가능한 강도의 충격이 헤드를 급 가속 및 감속하도록하여 플라이 헤드에 직접 전달됩니다. 우리의 방법은 다른 Drosophila mTBI 모델에 내재 된 잠재적 문제를 제거합니다 ( 예 : 동물의 죽음은신체의 다른 부위 또는 내부 장기). 적은 노동력과 비용 집약적 인 동물 관리, 짧은 수명 및 방대한 유전 도구로 인해 CTE 병인을 연구하고 게놈 전반에 걸친 전방 유전자 및 약리학 적 스크리닝을 수행하는 것이 이상적입니다. 우리는 모델의 지속적인 특성화가 질병 예방 및 치료 방법에 대한 중요한 기계 론적 통찰력을 창출 할 것으로 기대한다.

서론

만성 외상성 뇌병증 (CTE)은 최근 알츠하이머 병과 같은 다른 타우 병증과 별개로 별개의 신경 퇴행성 장애로 인정 받고 있습니다. 가장 중요한 위험 요소가 나이와 치매의 가족력이있는 알츠하이머 병 및 다른 일반적인 타우 병증과는 달리 CTE는 그 이름에서 알 수 있듯이 접촉 스포츠 선수들에게서 볼 수있는 뇌 외상의 병력과 밀접한 관련이 있으며, 사각 팬티, 축구 선수, 군대 참전 용사 2 , 3 , 4 , 5 등이 있습니다. 그것은 반복적으로 뇌에 뇌졸중과 뇌졸중을 가하는 것으로 시작된다고 생각됩니다. 환자는 알츠하이머 병, 전두 측두엽과 유의 한 중복되는인지 장애, 기분 및 행동 변화, 운동 장애와 같은 증상 및 징후를 나타낼 수 있습니다치매, 레위 몸 치매, 파킨슨 병 6 . 대조적으로, 뇌 조직의 사후 검사는 다른 퇴행성 질환에서 관찰되지 않는 병리학 적 특징 인 피질 상피의 깊이에서 작은 혈관을 둘러싼과 인산화 된 타우 축적의 뚜렷한 패턴을 나타낸다. 그러나 지금까지 질병 발현으로 이어지는 병인에 대해서는 거의 알려지지 않았다. 이것은 충실한 동물 모델이 부족하여 많은 부분을 차지합니다 - 단지 최근에 설치류 모델이 생성되었습니다 ( 5 , 8) . 이러한 모델 생물은 비용 집중 치료와 상대적으로 긴 수명의 단점을 가지고 있으며 신경 퇴행성 질환 연구에 적합하지 않습니다.

포유류 대조 물과 비교하여, Drosophila 와 같은 무척추 동물은 비용 효율적인 유지 관리와 함께 훌륭한 대안이며,유전 적 결정 요인 해부를위한 광범위한 도구 및 상대적으로 짧은 수명 9 . 놀랍게도, 파리와 인간의 두뇌는 진화 적으로 보존 된 분자 및 세포 경로뿐만 아니라 해부학 적 유사성을 공유한다 10 , 11 , 12 . 외상성 뇌 손상을 연구하기위한 두 개의 독창적 인 초파리 모델이 이전에 13 , 14 번 보고되었습니다. Katzenberger와 동료가 고안 한 최초의 "고 충격 손상"(HIT) 장치는 금속 스프링 13 , 15 의 자유 단에 연결된 플라스틱 바이알에 자유롭게 움직이는 파리가 들어있었습니다. 플라스틱 병이 수직으로 기울어 졌을 때 폴리 우레탄 패드를 치고 파리 벽에 부딪쳐 튀어 나와 반발했다. 대조적으로, Barekat과 동료들은 다른 전달 방법을 설계했습니다.Omni Bead Ruptor-24 호 모지 나이저 플랫폼 14 . 파리는 이산화탄소로 무력화되어 호 모지 나이저에 고정되고 사전 프로그램 된 진탕 조건에 적용되는 2 mL 스크류 캡 튜브에 두었다. 조직 균질 기 시스템을 사용하는 한 가지 이점은 실험자가 상해의 강도, 상해의 지속 시간 및 부상의 횟수를 조절할 수 있다는 것입니다. 그러나 두 정권 모두 동일한 단점을 갖고있다 : 머리에 대한 일차적 인 상해는 충격 위치와 힘의 측면에서 무작위로 가해진 다. 또한, 두 가지 방법 모두 신체 및 내부 기관의 다른 부분에 불가피한 부수적 인 손상으로 인해 상당한 사망률을 초래했습니다. 여기, 우리는 과일 파리에서 mTBI를 유도하는 새로운 방법을 설명합니다. 우리의 장치는 가스 추진 탄도 충격기로 구성되어 있습니다. 기존의 Drosophila 모델 14 , 15에 비해 우리의 방법은 meas자유롭게 움직일 수있는 플라이 헤드에서만 지시되는 유랑 충격 (lrable impact)은 충격 강도, 충격 사이의 시간 간격 및 지속 된 충격의 총 횟수와 같은 다양한 요인을 정확하게 제어 할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 스트라이크 장치의 조립 ( 그림 1 )

  1. 1mL 투베르쿨린 주사기에서 플런저를 제거합니다. 배럴을 1 mL 표시로 자릅니다.
  2. 200 μL 피펫 팁에서 에어로졸 장벽 (높이 3 mm x 4 mm)을 제거하고 임팩터로 사용하십시오. 충격 장치를 시린지 배럴 안에 놓으십시오. 천천히 배럴을 탭하여 임팩터를 팁 끝으로 움직이십시오. 평평한면이 노즐 입구를 덮습니다.
  3. Drosophila 마취 스테이션의 이산화탄소 (CO2) 유량 조절기에 연결된 플라스틱 튜빙에 배럴 팁 끝을 연결하십시오.
  4. 배럴을 수직으로 잡고 표준 클램프 홀더 스탠드에 끼워서 충격 장치가 통의 바닥에 머 무르도록하십시오.
  5. 플라이 홀더를 만들기 위해 200 μL 피펫 팁을 수정하십시오.
    1. 끝에서 4mm를 잘라 0.8mm 지름의 구멍을 만들어 플라이 헤드 만 노출되게하십시오.
      참고 : tho뗏목 및 파리 몸의 다른 모든 부분은 피펫 팁 안에 머물 것입니다.
  6. 커넥터를 만들기 위해 1,000 μL 피펫 팁과 1 mL 주사기 바늘 캡을 수정하십시오.
    1. 팁의 입구에서 44mm 떨어져 자릅니다. 1 ML 주사기 바늘 캡의 6mm 길이를 가지고 1,000 μL 피펫 팁의 나머지 세그먼트에 단단히 밀어.

2. 스트라이크 장치의 작동

  1. 플라이 패드 (fly pad)에서 CO 2 를 사용하여 2 일 된 성인 여성 플라이에게 마취를하십시오.
  2. 미세한 브러시로 플라이 홀더로 부드럽게 옮깁니다. 플라이 헤드가 팁 끝 외부에 보이도록 홀더를 부드럽게 두드립니다. 가요 성 코의 가위가 팁 외부에 노출 된 경우, 천천히 1 mL 주사기 바늘로 팁 안쪽으로 다시 넣습니다.
    참고 : Fly proboscope를 홀더 안에 넣어야합니다. 그렇지 않으면, 파리는 빠는 코의 부상으로 사망 할 수 있습니다.
  3. 플라이 호를 조이십시오.플라이 헤드가 아래쪽을 향하도록 커넥터가있는 주사기 배럴에 연결하십시오.
  4. 가스 압력을 100 kPa로 설정하십시오. 실험 설계에 따라 유속을 조정하십시오.
  5. 임팩트 터가 플라이 헤드를 한 번 치기 위해 유량 조절기 토글 스위치를 빠르게 켜고 끕니다.
  6. 플라이 홀더를 들어 올려 플라이 패드 위로 옮깁니다. 플라이 홀더를 뒤집고 가볍게 측면을 가볍게 두 드리십시오. 빈 유리 병에 파리를 넣어 복구하십시오.

3. 비디오 지원 이동 추적

  1. 추적 경기장을 만들기 위해 투명 실리콘 엘라스토머가있는 6cm 직경의 페트리 접시를 채 웁니다. 파리와 파리 사이에 3mm의 간격을 두어 파리가 자유롭게 걷고 날 수 없게하십시오.
  2. 매번 샴 또는 치료 그룹에서 4 개의 파리를 마취하여 경기장에 배치하십시오. 파리를 22 ° C에서 1 시간 동안 방치하십시오.
  3. 경기장 위에 CCD (Charge Coupled Device) 카메라를 배치하고 5 분 동안 기록합니다.
  4. Ctrax 소프트웨어 (Caltech에서 무료로 구할 수 있음)를 사용하여 기록 된 운동 궤도를 분석하십시오. 추적 된 데이터를 프로그래밍 언어 (예 : Matlab) 호환 형식으로 내보내고 프레임 당 이동 한 거리를 기반으로 데이터를 분석합니다. 각 비행에 대한 평균 도보 거리를 계산하고 다른 모든 기록 된 파리 / 그룹과 결합하여 같은 그룹의 파일 집단이 이동 한 평균 누적 거리를 얻습니다.

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결과

성인 Drosophila를 사용하여 CTE 모델을 구축하기 위해 단일 폐쇄 머리 손상을 가할 때 우리 장치의 효율성을 결정했습니다. 유전자형, 성별 또는 나이와 관련된 변이를 없애기 위해 우리는 2 일 된 Canton-S WT 암컷 파리를 실험에 사용했습니다. 우리는 100 kPa의 일정한 가스 압력에서 CO 2 의 유량을 조절함으로써 임팩터의 강도를 쉽게 제어 할 수 있습니다. 가장 높은 유속 (15 L / min)에서 단일 타격에 노출 된 파리는 최소한의 외부 결함을 나타 냈습니다 ( 그림 2 ). 외부 눈과 입 냄새가 모두 보였다. 그럼에도 불구하고 우리는 15 L / min의 유속이 치명적이며 24 시간 내에 10 % 미만의 생존율을 나타냄을 발견했습니다 ( 그림 3A ). 대조적으로, 10 또는 7.5 L / 분의 스트...

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토론

신경 생리 학적 변화, 신경 병리학 적 특징, 신경 행동 적 결함을 포함하여 CTE 특성을 충실하게 모델링 한 동물 모델은 질병 기전을 밝히고 진단 및 치료 목표를 개발하는 데 필수적입니다. 인간 질병의 동물 모델이 임상 적으로 관련된 모든 종말점을 모방 할 때 완벽한 것은 아니라는 것을 이해할 수 있습니다. 그러나 우리는 견고한 CTE 모델이 다음 세 가지 요구 사항을 충족해야한다고 생각합니다. (1) 충격은 두피 및 두개골 보호가 손상되지 않은 머리에 직접 적용되어야합니다. (2) 충돌 노출 동안 헤드가 고정되어서는 안되며 따라서 빠른 가속 - 감속 및 회전 및 선형 헤드 이동이 허용됩니다. (3) 실험 디자인은 단일 및 반복적 인 정권을 포함해야하며, 충격 결과는 조직 부종, 타박상 또는 솔직한 출혈과 같은 눈에 보이는 손상을주지 않으면 서 본질적으로 경미해야한다.

오우과일 파리 모델은 파리 13,14,15에서 외상성 뇌 손상을 일으키는 다른 방법과 구별됩니다. Bead...

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공개 사항

이 작품은 존스 홉킨스 대 의과 대학 창립 자금 인 LC

감사의 글

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
에어로졸 장벽USA Scientific1120-8810임팩터로 사용
200 μ L 피펫 팁USA Scientific1111-0706플라이 헤드 홀더로 사용
1000 μ L 피펫 팁USA Scientific1122-1830커넥터로 사용
1mL 투베르큘린 주사기Becton Dickinson309625
60mm 페트리 접시Fisher ScientificFB0875713A추적 경기장으로 사용
유량 조절기Genesee Scientific59-122WC
표준 클램프 홀더/스탠드EISCO ScientificCH0688
파인 브러시Genesee Scientific59-204
플라이패드Genesee Scientific59-114
Sylgard 실리콘 엘라스토머Dow Corning4019862
CCD 카메라Microsoft HD-5000
Ctrax 워킹 플라이 트래커CaltechCtrax 0.2.11
MATLAB Image Processing ToolboxMATLABR2015b

참고문헌

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