이 작품은 동결 건조 베리 파우더에서 폴리 페놀이 풍부한 추출물을 준비하는 단계별 방법을 자세히 설명합니다. 또한 Vascular Smooth Muscle Cells (VSMCs)를 사용하여 펩타이드 호르몬 인 안지오텐신 II (Ang II)의 존재하에 세포 배양에서 이들 폴리 페놀이 풍부한 추출물을 사용하는 방법에 대한 철저한 설명을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
역학 조사에 따르면 플라보노이드 섭취가 증가하면 미국과 유럽에서 심혈관 질환 (CVD)으로 인한 사망률이 감소하는 것으로 나타났습니다. 딸기는 미국에서 광범위하게 소비되며 폴리 페놀 함량이 높습니다. 폴리 페놀은 많은 분자 표적과 상호 작용하고 항산화, 항염증제 및 심장 보호 효과를 비롯한 수많은 긍정적 인 생물학적 기능을 발휘하는 것으로 나타났습니다. 블랙 베리 (BL), 라즈베리 (RB) 및 블랙 라즈베리 (BRB)에서 분리 된 폴리 페놀은 안지오텐신 II (Ang II)에 대한 산화 스트레스와 세포 노화를 감소시킵니다. 이 작품은 동결 건조 딸기에서 폴리 페놀 추출물을 준비하는 데 사용되는 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 동결 건조 베리 분말로부터 폴리 페놀 추출을 80 % 수성 에탄올 및 초음파 보조 추출법을 사용하여 수행 하였다. 조 추출물을 추가로 정제하고 클로로포름 및 에틸 아세테이트를 사용하여 분획하고,각기. 원유 및 정제 추출물의 효과는 배양 된 혈관 평활근 세포 (VSMCs)에서 시험 하였다.
서론
폴리 페놀은 그 구조 중에 적어도 하나의 페놀 릭 고리를 함유하고 식물 왕국에 풍부하게 존재하는 화합물이다. 인간은 그러한 화합물의 존재를 의식하지 않고 약용 목적으로 수천 년 동안 식물을 먹고있다. 많은 과일과 채소에는 플라보노이드, 스틸 벤 (stilbenes), 페놀 릭산 (phenols acids) 3을 포함한 다양한 양의 폴리 페놀 화합물이 있습니다. 폴리 페놀은 다채로운 과일과 채소와 관련이 있지만 이는 사실이 아닙니다. 예를 들어, zeaxanthin과 xanthine은 양파와 마늘과 같이 매우 다채롭지 않은 채소에 존재하며, 이는 scallions 계열에서 비롯되며 수많은 건강상의 이점과 관련이 있습니다 4 . 폴리 페놀은 여러 가지 건강상의 효능과는 별도로 식물을 곤충에서 보호하여d 자외선 2 . 폴리 페놀은 일반적으로 인간의 식단에서 발견되며 반응성 산소 종 (ROS) 6 , 7 , 8을 제거 할 수 있기 때문에 강력한 항산화 물질로 간주됩니다. 그들은 또한 항염증제
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프로토콜
1. 시약의 준비
- 절대 에탄올 (분자 생물학 등급) 80 mL와 세포 배양 등급의 멸균 수 20 mL를 혼합하여 80 % 에탄올 (100 mL)을 준비한다.
- 폴리 페놀 추출물 (10mg / ml)을 준비하려면 CE 또는 PE 10mg을 취하십시오. 세포 배양 후드 아래에 일반 Dulbecco 수정 이글 매체 (DMEM) 1 ML을 추가합니다. 솔루션을 소용돌이 치게하십시오. 분주 량을 200 μL로 나누고 -20 ° C에서 보관하십시오.
- 용해 완충액을 준비하십시오.
- 1 M HEPES 원액 (pH 7.4, 최종 50 mM) 5 mL, 5 M NaCl 원액 1 mL (최종 50 mM), 0.5 M EDTA 원액 1 mL (최종 5 mM), 0.5 mL 2 mL M NaF 저장 용액 (최종 10 mM), 700 mM Na 3 VO 4 저장 용액 (최종 2 mM) 286 μL, 200 mM Na 4 P 2 O 7 스톡 용액 5 mL (최종 10 mM) 및 5 mL의 물 (최종 1 %)로 제조 된 20 % 트리톤 -X-100 스톡 용액. 물을 넣어 100 mL의 부피에 도달하십시오. 4 ° C에서 유지하십시오.
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결과
BL, RB 및 BRB로부터 분리 된 폴리 페놀 추출물이 Ang II 21 에 반응하여 VSMCs의 노화를 감소시키는 것이 이전에 입증되었다. 이러한 정제 된 폴리 페놀 추출물은 Akt, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) 및 ERK1 / 2의 인산화를 감소시킴으로써 Ang II 신호 전달을 조절한다는 것이 밝혀졌습니다. BL은 슈퍼 옥사이드 음이온을 생산하는 효소 인 NADPH 산화 효소 (Nox) 1의 발현을 감소시킴으로써 노화를 방지하고 Ang II에 의해 강력하게 상향 조절됩니다. 대조적으로, RB와 BRB는 항산화 효소 인 SOD1, SOD2 및 글루타티온 퍼 옥시 다제 1 (GPx-1)의 발현을 증가 시킴에 따라 Nox1 독립적 인 메커니즘에 의한 노화를 예방합니다. BL은 SOD2 발현을 증가시키지 못하지만, 추출물 중 어느 것도 Ang II
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토론
딸기에서 단리 된 폴리 페놀은 별개의 조성물을 함유하고있다. 여기에 기술 된 에탄올 기반의 추출 프로토콜은 BL의 조잡하고 정제 된 폴리 페놀 추출물에 존재하는 페놀 릭 산과 플라보노이드의 서로 다른 수준의 확인을 허용했다 ( 표 1 ). CE는 갈산, 훼 루릴 산, 4-O- 카페인 퀴 닉산 및 5-O- 카페인 퀴 닉산으로 농축되었다. 정제 공정은 갈산 및 p- 쿠마린 산의 수준을 크게 변화시키지 않았다. 그러나 3- O- 카페인 오일 퀸산의 농도는 170.5 - 235.3 ppm으로 증가하였고 케르세틴은 24.5 - 95 ppm으로 증가시켰다. 대조적으로, ferulic acid와 rutin은 CE 정제 과정에서 없어졌습니다.
50 - 500 μg / mL CE와 PE를 가진 VSMC의 처리는 두 추출물 모두 ERK1 / 2의 기초 인산화를 감소 시키는데 효과적이라는 것을 보여 주었다. 그러나, PE는 낮은 농도에서이 키나제의 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 미국 심장 협회 (14GRNT20180028)와 플로리다 주립 대학 연구 및 창의위원회 (COFRS)가 자금을 지원했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 안지오텐신 II | 시그마-알드리치, Inc. | A9525-10MG | VSMC& |
| 베타;-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | 기본 항체 (1:5000) |
| 블랙베리 과일 | Mercer Foods | 동결 건조 블랙베리 파우더 | |
| 카탈라아제 | Calbiochem | 219010 | 1차 항체 (1:1000) |
| Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | 정제 폴리페놀 추출물의 제조 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | VSMC |
| 에탄올 배양 (절대 분자 생물학 등급) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | 폴리페놀 추출물의 제조 |
| 에칠아세테이 | 트 시그마-알드리치, Inc. | 439169 | 정제된 폴리페놀 추출물 |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | 1차 항체 (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | 용해 완충액 |
| 동결 건조기 | Labconco | VirTis Benchtop K | 폴리페놀 추출물 준비 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1400-500 | 세포 배양 |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | 용해 완충액 |
| NaCl | EMD 밀리포어, Inc. | 7760 | 용해 완충액 |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | 용해 버퍼 |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | 용해 완충액 |
| Na4P2O7, decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | 용해 완충액 |
| 포스포 ERK1/2 | 세포 신호 기술, Inc. | 9101S | 1차 항체 (1:1000) |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | 용해 완충 |
| 액 단백질 분석 염료 시약 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | 단백질 농도 측정 |
| PVDF 전달막 | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | 웨스턴 블롯 |
| 회전 증발기 | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 | 폴리페놀 추출물 제조 |
| 멸균수 | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | 폴리페놀 추출물의 제조 |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | 세포 추출물 |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | 1차 항체 (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | 웨스턴 블롯 |
| Whatman #2 여과지 | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | 폴리페놀 추출물의 제조 |
참고문헌
- Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev.
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재인쇄 및 허가
