Method Article

신경 시스템 재구성, 변조 및 모델링을 위해 해부학 적으로 영감을받은 3 차원 미세 조직 공학 신경 회로망

DOI:

10.3791/55609

⸱

May 31st, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Science, University of Pennsylvania, 2Center for Brain Injury & Repair, Department of Neurosurgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Center for Neurotrauma, Neurodegeneration & Restoration, Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center, 4School of Biomedical Engineering, Drexel University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고는 마이크로 조직 공학 신경 네트워크의 제작에 대해 자세히 설명합니다. 3 차원 크기의 마이크론 크기의 구조물은 관 모양의 하이드로 겔에 둘러싸인 집적 된 신경 세포군에 걸친 길쭉한 정렬 축색관으로 구성됩니다. 이러한 살아있는 비계는 신경 회로를 재구성하거나 조절하기위한 기능적 중계 역할을하거나 회색 - 흰색 물질 신경 조직학을 모방 한 생물 여과 테스트 베드 (bifidelic test-bed) 역할을 할 수 있습니다.

Abstract

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기능적 회복은 중추 신경계 (CNS) 내의 손상 또는 질병 유발 성 퇴행 후 억제 환경 및 신경 발생에 대한 제한된 용량으로 인해 드물게 발생한다. 우리는 손상된 CNS 내에서 신경 및 축삭 경로 손실을 동시에 처리 할 수있는 전략을 개발 중입니다. 이 원고는 마이크로 조직 공학 신경 네트워크 (micro-TENNs), 뉴런으로 구성된 이식 가능한 구조물 및 센티미터 (centimeters)를 확장 할 수있는 수백 마이크론의 직경을 가진 예비 형성된 하이드로 겔 실린더의 세포 외 매트릭스 (extracellular matrix, ECM) 길이. 신경원 집합체는 3 차원 인장의 극단으로 구분되며 축삭 투영으로 확장됩니다. Micro-TENNs는 CNS 재건을위한 전략으로 두뇌 connectome 세포 구조의 측면을 모방하고 잠재적으로 네트워크 대체 수단을 제공 할 수있는 유일한 자세를 취하고 있습니다. 노이ronal aggregates는 숙주 조직과 시냅스하여 누락되거나 손상된 회로를 복원 및 / 또는 조절하는 새로운 기능적 중계를 형성 할 수있다. 이러한 구조는 또한 세포 재생 및 축삭 경로 찾기를위한 발달 기작을 이용할 수있는 친 재생성 "살아있는 스캐 폴드"로 작용하여 재생 상태를 기반으로 시너지 구조 및 가용성 단서를 제공 할 수 있습니다. Micro-TENN은 액체 하이드로 겔을 종 방향 중심의 바늘이 들어있는 원통형 틀에 주입하여 제조됩니다. 일단 하이드로 겔이 겔화되면 바늘이 제거되어 중공 형 마이크로 컬럼이 남습니다. 루멘에 ECM 솔루션을 추가하여 신경 부착 및 축색 파 성장에 적합한 환경을 제공합니다. 해리 된 뉴런은 미세 기둥의 한쪽 또는 양쪽 끝 부분에 정확한 파종을 위해 기계적으로 응집됩니다. 이 방법론은 장기적으로 돌출 된 축삭 모양의 좁은 구조물을 안정적으로 생산하여 뇌 신경 조직의 특징을 재현 할 수 있습니다. 시냅스 렘unlabelling 및 유 전적으로 코딩 된 칼슘 지시약은 마이크로 TENN이 광범위한 시냅스 분포와 본질적인 전기적 활동을 가지고 있음을 암시합니다. 결과적으로 micro-TENN은 뇌 경로의 신경 외과 재 구축을위한 유망한 전략이며 , 생체 내에서 신경 생리 현상을 연구하기위한 biofidelic 모델로도 적용될 수 있습니다.

Introduction

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외상성 뇌 손상 (TBI), 척수 손상 (SCI), 뇌졸중, 알츠하이머 병 및 파킨슨 병과 같은 중추 신경계 (CNS)의 장애 및 질병의 일반적인 특징은 축삭 경로 및 신경 세포의 단절이다 손실 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . 예를 들어, 허혈성 뇌졸중이 치료되지 않으면 축삭이 분당 7 마일의 속도로 손실된다는 것이 추정됩니다. 미국에서만 약 170 만 명의 사람들이 매년 경험하는 TBI의 경우, 초기 손상이 장기간 신경 퇴행성 상태를 유발하기 때문에 축삭 변성이 외상 후 수년 후에도 계속 발생할 수 있습니다 4 . 이러한 유해한 영향을 악화시키는 중추 신경계는 심각한 카파중생을위한 도시 1 , 7 , 8 ,

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Protocol

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동물을 포함한 모든 절차는 펜실베이니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회와 마이클 J. 크레센츠 재향 군인 의료 센터 (American J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center)의 승인을 얻었으며 NIH 공중 보건 서비스 정책에 규정 된 지침에 따라 실험실의 인간애 관리 및 사용 동물 (2015).

1. 아가로 오스 하이드로 겔 (마이크로 TENN의 무 세포 성분)

  1. 아가로 오스 용액 준비
    1. biosafety 캐비닛 내에서 두 개의 10cm 페트리 접시 각각에 Dulbecco의 인산 버퍼 식염수 (DPBS) 20 ML을 전송하여 마이크로 컬럼을위한 저수지를 준비합니다. 뜨거운 비드 멸균기로 미세 포셉 및 마이크로 알펠을 소독하십시오.
    2. 아가로 오스 3g을 바이오 안전성 캐비닛 안의 멸균 비이커에 옮긴다. 3 % 중량 / 부피 (w / v)의 최종 농도를위한 100 mL의 DPBS를 첨가한다. 깨끗한 마그네틱 바를 포함하고 알류미로 비커를 덮으십시오.num 호입니다.
    3. 핫 플레이트 / 교반기로 100 ℃에서 비이커를 따뜻하게하고 120 ~ 200 rpm으로 저어서 아가로 오스를 완전히 녹이십시오 (용액이 흐....

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Results

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Micro-TENN은 위상차 현미경을 사용하여 모니터하여 세포 구조 및 축색 돌기를 평가했습니다 ( 그림 4 ). 단방향, 2mm 길이의 마이크로 -TENN 내에서, 뉴런 집합체는 마이크로 - 컬럼의 한쪽 말단으로 제한되고 내부 코어를 통해 축색 돌기가 투영되었다. Axons 은 체외에서 5 일 (DIV) ( 그림 4A ) 열의 전체 길이를 스팬. 축색 돌기가 3 DIV ( 그림 4B )에 의해 전체 마이크로 컬럼을 스팬하기 때문에 양방향 2 mm 길이의 마이크로 TENN에서 더 큰 초기 축삭 성장 속도가있었습니다. 5 DIV에 의해, 양방향 micro-TENNs는 마이크로 컬럼의 극단에서 유지 된 응집체를 연결하는 조밀 한 축삭 덩어리를 특징으로했다. 이 cytoarchitecture는 5-DIN micro-TENNs에서도 관찰되었으며 축색 돌기는 5-DIV로 .......

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Discussion

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CNS 손상 및 질병은 전형적으로 부수적 인 신경 세포 변성의 유무에 관계없이 뇌 결합체를 구성하는 장거리 축삭 경로의 손실 또는 기능 부전을 야기한다. 이것은 신경 발생 및 재생을 촉진하는 CNS의 제한된 용량에 의해 합성됩니다. 성장 인자, 세포 및 생체 물질 전달과 같은 수복 전략을 개별적 또는 조합 적 접근으로 추구 함에도 불구하고 이러한 기술은 신경 세포의 퇴행과 축삭 연결의 손실을 동시에 설명하지 못한다 14 , 22 . 이러한 기술 격차는 통제되고 지속적인 방식으로 신경망을 수리, 변경 및 조사하는 능력을 제한합니다. 따라서 마이크로 TENN 기술은 기존의 방법과 달리 신경 교체 및 긴 축삭 연결 재건을 용이하게하는 신경 치료 전략의 필요성을 해결하기 위해 개발되었습니다. 마이크ro-TENN은 숙주 신경 회로의 표적 재구성, 교체 및 변형을 위해 특별히 설계된 뇌 결합체의 시스템 수준 빌딩 블록에 접근하는 예비.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

재정 지원은 U01-NS094340 (컬린), T32-NS043126 (해리스), F31-NS090746 (카티 야), 마이클 J. 폭스 재단 (치료 파이프 라인 프로그램 # 9998 (컬린) (Cullen), 미국 과학 재단 (대학원 연구 동창 DGE-1321851 (Struzyna and Adewole)), Veterans Affairs (RR & D Merit Review # B1097-I (Cullen)), Penn Medicine 신경 과학 센터 파일럿 상 신경 외과 의사 및 신경 외과 의사 회의 (2015-2016 년 신경 외상 및 중환자 실에서의 코닥 개인 연구 (Petrov)) 및 미 육군 의학 연구 및 물질 명령 (# W81XWH-13-207004 (컬른) 및 W81XWH- 0466 (컬른)).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
레이저 절단기범용 레이저 시스템PLS4.75레이저 절단 마이크로 채널 금형을 제작하는 데 사용됩니다.
레이저 컷 마이크로 컬럼 제작 장치맞춤 제작--------------관심이 있으시면 당사 연구 그룹에 문의하십시오. 원고에 제공된 치수와 청사진.
나사----------------------------# 4-40 나사 직경 3.05 mm
너트----------------------------# 4-40 나사 직경 3.05 mm
침 (180 µ m 직경)Lhasa Medicalsj.16X40직경은 마이크로 컬럼 루멘의 원하는 크기에 따라 달라질 수 있습니다.
페트리 접시Fisher08772B
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)Invitrogen14200075
폴리스티렌 일회용 혈청학 피펫Fisher13-678-11D
AgaroseSigmaA9539-50G
모세관 (398 µ m 직경)Fisher21170D직경은 마이크로 컬럼 쉘의 원하는 크기에 따라 달라질 수 있습니다.
핫 플레이트FisherSP88857200
마그네틱 바Fisher1451352
MicropipetteSigmaZ683884-1EA
25mm 게이지 바늘Fisher14-826-49
MicroscalpelRoboz SurgicalRS-6270
가위미세 과학 도구14081-09
집게세계 정밀 기기501985
핫 비드 살균기시그마Z378550-1EA
입체 스코프니콘SMZ800N모든 해부 단계 및 마이크로 TENN 제작에 사용됩니다.
쥐 꼬리 유형 I 콜라겐코닝3542364 º에서 유지하십시오. C는 필요할 때만 제거합니다.  사용 중 온도를 유지하기 위해 얼음을 사용하십시오.
마이크로 원심 분리기 튜브Fisher02-681-256
마우스 라미닌Corning3542324 º에서 유지; C는 필요할 때만 제거합니다.  사용 중 온도를 유지하기 위해 얼음을 사용하십시오.
Neurobasal mediumInvitrogen21103049출생 전 및 배아 신경 세포 배양을 위한 기저 배지. 4º에 저장; C 및 37 º에서 따뜻하게; C 사용하기 전에.
수산화나트륨 (NaOH)FisherSS2661
염산 (HCl)FisherSA48-1
리트머스 종이Fisher09-876-18
Hank's Balanced Salt solution (HBSS)Invitrogen14170112Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTAInvitrogen25200056-20 º에 저장합니다. C 및 37 º에서 따뜻하게; C 사용하기 전에.
소 췌장 데옥시리보뉴클레아제(DNase) ISigma10104159001-20 º C 및 37 º에서 따뜻하게; C 사용하기 전에.
B-27 보충제Invitrogen12587010Supplement는 해마 및 피질 뉴런 배양을 위해 Neurobasal 배지에 추가되었습니다. -20 º에서 저장; C 및 37 º에서 따뜻하게; C 사용하기 전에.
L-글루타민 Invitrogen35050061-20 º의 매장; C 및 37 º에서 따뜻하게; C 사용하기 전에.
Sprague Dawley 배아 일 18 쥐Charles RiverStrain 001
파스퇴르 피펫Fisher22-042816
15 mL 원심 분리기 튜브EMESCO1194-352099
VortexFisher02-215-414
원심 분리기Fisher05-413-115
혈구계Fisher02-671-6
Objet30 3D 프린터Stratasys --------------피라미드 형 마이크로 웰 주형을 제작하는 데 사용됩니다.
3D 프린팅 피라미드 형맞춤 제작--------------관심이 있으시면 연구 그룹에 문의하십시오. 원고에 제공된 치수와 청사진.
폴리디메틸실록산(PDMS) 및 경화제FisherNC9285739엘라스토머 및 경화제가 포함된 키트로 제공됩니다. 화학 흄 후드 내부에서 사용하십시오.
깔때기Fisher10-348C
1ml 피펫 전구SigmaZ509035
마이크로 주걱FisherS50821
12웰 배양 플레이트EMESCO1194-353043
오븐Fisher11-475-154
인큐베이터Fisher13 998 076
AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40UPenn Vector Core36373-80ºC에 저장. GCaMP6f 칼슘 지시약이 있는 상업적으로 이용 가능한 아데노 관련 바이러스(AAV).
포름알데히드 40%FisherF77P-4포름알데히드는 발암성이 알려진 독성 화합물이며, 별도의 용기에 버려야 합니다. 
Triton X-100SigmaT8787세포막을 투과시키는 데 사용되는 비이온 계면활성제.
말 혈청Gibco16050-122
마우스 anti-Tuj-1/beta-III tubulin 1차 항체SigmaT8578-200UL-20ºC에서 보관.
토끼 항 시냅신 1 일차 항체Synaptic Systems106-001-20ºC에 저장.
당나귀 안티 마우스 568 2 차 항체InvitrogenA100374º C에 저장.
당나귀 항토끼 488 2차 항체InvitrogenA212064ºC에 저장.
Hoechst 33342, TrihydrochlorideInvitrogenH3570Store at 4ºC.  Hoechst는 발암 물질로 취급되어야 하는 알려진 돌연변이 유발 물질입니다.  따라서 별도의 용기에 폐기해야 합니다.
A1RSI 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 Nikon--------------표지된 구조체의 컨포칼 재구성을 수행하는 데 사용됩니다.
Eclipse Ti-S 현미경 Nikon--------------위상차 이미지를 촬영하는 데 사용됩니다.  Nikon Elements Basic Research 소프트웨어(4.10.01)와 인터페이스된 QiClick 카메라를 사용한 디지털 이미지 획득.
고속 형광 현미경Nikon--------------Nikon Eclipse Ti 현미경은 칼슘 이미징을 위해 ANDOR Neo/Zyla 카메라와 페어링됩니다.
NIS Elements AR 4.50.00 소프트웨어Nikon Instruments--------------고속 형광 현미경으로 촬영한 기록물에서 칼슘 과도 현상을 식별하는 데 사용됩니다. 
면역

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10 (5), 679-685 (2015).
  2. Tallantyre, E. C., Bø, L., et al.

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