방법 논문

신경 시스템 재구성, 변조 및 모델링을 위해 해부학 적으로 영감을받은 3 차원 미세 조직 공학 신경 회로망

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DOI:

10.3791/55609

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2017년 5월 31일

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1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Science, University of Pennsylvania, 2Center for Brain Injury & Repair, Department of Neurosurgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Center for Neurotrauma, Neurodegeneration & Restoration, Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center, 4School of Biomedical Engineering, Drexel University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 원고는 마이크로 조직 공학 신경 네트워크의 제작에 대해 자세히 설명합니다. 3 차원 크기의 마이크론 크기의 구조물은 관 모양의 하이드로 겔에 둘러싸인 집적 된 신경 세포군에 걸친 길쭉한 정렬 축색관으로 구성됩니다. 이러한 살아있는 비계는 신경 회로를 재구성하거나 조절하기위한 기능적 중계 역할을하거나 회색 - 흰색 물질 신경 조직학을 모방 한 생물 여과 테스트 베드 (bifidelic test-bed) 역할을 할 수 있습니다.

초록

기능적 회복은 중추 신경계 (CNS) 내의 손상 또는 질병 유발 성 퇴행 후 억제 환경 및 신경 발생에 대한 제한된 용량으로 인해 드물게 발생한다. 우리는 손상된 CNS 내에서 신경 및 축삭 경로 손실을 동시에 처리 할 수있는 전략을 개발 중입니다. 이 원고는 마이크로 조직 공학 신경 네트워크 (micro-TENNs), 뉴런으로 구성된 이식 가능한 구조물 및 센티미터 (centimeters)를 확장 할 수있는 수백 마이크론의 직경을 가진 예비 형성된 하이드로 겔 실린더의 세포 외 매트릭스 (extracellular matrix, ECM) 길이. 신경원 집합체는 3 차원 인장의 극단으로 구분되며 축삭 투영으로 확장됩니다. Micro-TENNs는 CNS 재건을위한 전략으로 두뇌 connectome 세포 구조의 측면을 모방하고 잠재적으로 네트워크 대체 수단을 제공 할 수있는 유일한 자세를 취하고 있습니다. 노이ronal aggregates는 숙주 조직과 시냅스하여 누락되거나 손상된 회로를 복원 및 / 또는 조절하는 새로운 기능적 중계를 형성 할 수있다. 이러한 구조는 또한 세포 재생 및 축삭 경로 찾기를위한 발달 기작을 이용할 수있는 친 재생성 "살아있는 스캐 폴드"로 작용하여 재생 상태를 기반으로 시너지 구조 및 가용성 단서를 제공 할 수 있습니다. Micro-TENN은 액체 하이드로 겔을 종 방향 중심의 바늘이 들어있는 원통형 틀에 주입하여 제조됩니다. 일단 하이드로 겔이 겔화되면 바늘이 제거되어 중공 형 마이크로 컬럼이 남습니다. 루멘에 ECM 솔루션을 추가하여 신경 부착 및 축색 파 성장에 적합한 환경을 제공합니다. 해리 된 뉴런은 미세 기둥의 한쪽 또는 양쪽 끝 부분에 정확한 파종을 위해 기계적으로 응집됩니다. 이 방법론은 장기적으로 돌출 된 축삭 모양의 좁은 구조물을 안정적으로 생산하여 뇌 신경 조직의 특징을 재현 할 수 있습니다. 시냅스 렘unlabelling 및 유 전적으로 코딩 된 칼슘 지시약은 마이크로 TENN이 광범위한 시냅스 분포와 본질적인 전기적 활동을 가지고 있음을 암시합니다. 결과적으로 micro-TENN은 뇌 경로의 신경 외과 재 구축을위한 유망한 전략이며 , 생체 내에서 신경 생리 현상을 연구하기위한 biofidelic 모델로도 적용될 수 있습니다.

서론

외상성 뇌 손상 (TBI), 척수 손상 (SCI), 뇌졸중, 알츠하이머 병 및 파킨슨 병과 같은 중추 신경계 (CNS)의 장애 및 질병의 일반적인 특징은 축삭 경로 및 신경 세포의 단절이다 손실 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . 예를 들어, 허혈성 뇌졸중이 치료되지 않으면 축삭이 분당 7 마일의 속도로 손실된다는 것이 추정됩니다. 미국에서만 약 170 만 명의 사람들이 매년 경험하는 TBI의 경우, 초기 손상이 장기간 신경 퇴행성 상태를 유발하기 때문에 축삭 변성이 외상 후 수년 후에도 계속 발생할 수 있습니다 4 . 이러한 유해한 영향을 악화시키는 중추 신경계는 심각한 카파중생을위한 도시 1 , 7 , 8 , 9 . 손상 후, 먼 표적에 대한 유도 지침의 부족, 신경 돌기 성장을 방해하는 미엘린 - 관련 억제제의 존재 및 반응성 성상 교세포 8 , 10 , 11 , 12 에 의한 신경 교뇌 흉터의 형성을 특징으로하는 억제 환경이 발병한다. glial 흉터는 chondroitin sulfate proteoglycans와 같은 분자가 축삭 돌기를 방해하는 생화학 적 및 물리적 장벽으로 작용합니다 8 , 11 . 또한 신경 줄기 세포가 성인 CNS에서 발견 되더라도 신경 발생의 일관된 증거가 후각 구, 해마에서만 발견되어 새로운 신경 세포의 생성이 제한적이다입방 영역, 뇌실 주위 및 척수의 중심 도관 13 , 14 . 이러한 장애물은 상해 또는 질병에 따른 손실 된 뉴런 및 백질 구조의 기능적 회복을 방해하여 종종 이러한 조건의 삶을 변화시키고 연장 된 결과를 초래합니다.

성인 CNS의 재생 능력이 부족 함에도 불구하고 적절한 환경 신호가 호스트 뉴런 15 , 16 , 17 , 18에 제공 되면 축삭 재생이 가능하다는 것이 입증되었습니다. 연구자들은 성장 인자 ( 예 : 신경 성장 인자, 표피 성장 인자, glial 의존 성장 인자 및 신경 영양 인자 3) 및 가소성 및 축색 재생을 자극하는 다른 유도 분자를 전달 및 조작하려고 시도했다 14 ,18 , 19 . 비록 이러한 연구가 성체 축삭 돌기가 성장 인자에 반응 할 수 있다는 것을 확인했지만, 이러한 전략은 혈액 뇌 장벽의 낮은 침투력과 재생을 촉진시키는 데 필요한 특정 공간적, 시간적 변화에 의해 제한된다 14 , 18 , 19 . 다른 접근법은 중추 신경계 뉴런에서 재생 관련 전사 인자의과 활성화에 의존해왔다. 예를 들어, Stat3 전사 인자의 과발현은 시신경에서 축삭 재생을 자극했다. 그럼에도 불구하고, 전사 인자의 생체 분자 전달 및 과발현은 손실 된 연결 집단을 대체하지 못한다. 세포 기반 전략은 주로 신경 줄기 세포 (NSC)를 중추 신경계에 이식하는 것에 중점을두고 있으며, CNS 뉴런을 대체 할 수있는 능력을 활용하고 영양 계수를 방출하며,부상 후 발생하는 신경 발생에 대한 시도를지지한다. 그럼에도 불구하고 이식 된 신경 세포가 생존하고 숙주와 통합되며 상처 부위 6 , 14 , 17 , 21에 공간적으로 제한된 채로 남아있는 방해받는 능력을 포함하여이 접근법을 방해하는 도전 과제가 여전히 남아 있습니다. 또한, 세포 전달만으로 손상되거나 손상된 축삭 경로의 세포 구조를 복원 할 수 없다. 세포 및 약물 / 화학 물질 전달 전략이 직면 한 문제를 해결할 수있는 대체 방법은 이러한 접근법을 생체 물질 14 , 22 , 23 의 사용과 결합하는 것입니다. 하이드로 겔과 같은 생체 재료는 세포 외 매트릭스 (ECM)의 생화학 적 및 물리적 특성을 에뮬레이션 할 수 있으며, 세포 전달을 돕습니다.손상 부위 내에서의 유지, 방출 조절이 가능한 성장 인자 및 기타 생체 활성 물질 전달 22 . 이러한 생체 재료 기반 전략의 매력적인 특성은 발병 지역 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 에 비계를 이식 한 후 생체 내 축삭 재생의 증거를 가져 왔습니다. 그러나, 무 세포 생체 재료 전략은 잃어버린 연결 인구를 대체하지 않는다; 신경 세포, 신경 교세포 또는 신경 전구체 세포의 전달 비히클로 사용될 때, 생체 재료는 장거리 축색 망을 재구성 할 수 없다. CNS 손상 및 질병과 관련된 축삭 경로의 퇴행 및 신경 세포 손실 모두를 다루는 접근법을 개발하는 과제는 여전히 31.

우리 연구 그룹은 이전에 아가로 오스 하이드로 겔 -ECM 마이크로 칼럼의 한쪽 또는 양쪽 끝으로 제한되는 신경 세포 몸체로 구성된 "살아있는 비계 (scaffold)"형태의 이식 가능한 미세 조직 공학 신경 네트워크 (마이크로 TENN)의 개발을보고했다 이 3 차원 (3D) 수용체 1 , 10 , 31 , 32 의 내부 전체에 걸쳐 정렬 된 축색 영역이있다. 이 기법과 이전의 접근법의 가장 큰 차이점 중 하나는 micro-TENNs 의 세포 구조 가 in vitro에서 완전히 생성 되어 이후 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 ,sup class = "xref"> 39 , 40 , 41 . In vitro 제작은 세포 표현형 및 배향, 기계적 / 물리적 특성, 생화학 적 신호 및 외인성 인자에 대한 광범위한 공간 및 시간 제어 기능을 제공하여 임플란트 후 이러한 인공 지지체를 숙주와 통합하는 데 효과적입니다. Micro-TENN은 해부학 적으로 영감을받습니다. 뇌의 신경 기능을 모방하기 때문에 뇌의 다른 기능 영역을 연결하는 것과 유사한 축삭 영역을 보이기 때문입니다 ( 그림 1A ) 1 . 따라서이 전략은 병변 부위에 이식 한 후 잃어버린 백질 물질과 뉴런을 물리적으로 대체 할 수 있습니다. 이 기술은 또한 방사상의 glial 세포와 개척 축삭에 의해 형성된 "natural living scaffolds"가 세포의 길 찾기 가이드 역할을하는 발달 기작으로부터 영감을 얻습니다subventricular zone과 axonal outgrowth에서의 이동 43 . 이러한 메커니즘은 신경 세포 이동 및 축삭 - 중재 축삭 돌기 ( 그림 1C ) 43에 의한 축삭 재생을위한 살아있는 경로를 제시 할 수있는 마이크로 TENNs의 정렬 axonal 영역에서 recapitulated 있습니다. 또한이 전략은 마이크로 TENN 뉴런과 기본 회로 사이의 시냅스 통합을 활용하여 기능적 복구 ( 그림 1B ) 43 에 기여할 수있는 새로운 릴레이를 형성합니다. 시냅스 형성 용량은 또한이 접근법에 네트워크 피드백에 따라 CNS를 조절하고 숙주 조직에 반응하는 능력을 부여 할 수있다. 예를 들어, 살아있는 발판의 optogenetically 활성 뉴런은 시냅스 상호 작용을 통해 호스트 뉴런을 변조 자극 수 있습니다 ( 그림 1D ).

또한, 생체 재료 기반 관상 면상 구마이크로 TENN의 작용은 세포 부착, 성장, 신경 돌기 확장 및 신호 전달을위한 적절한 환경을 제공하는 반면, 구조물의 미니어처 차원은 잠재적으로 최소 침습성 이식을 허용하고 부분적으로 격리 된 미세 환경을 제공하여 뇌에 점진적으로 통합시킵니다. 사실, 최근의 연구 결과는 쥐의 뇌에 이식 된 이후에 신경 경로를 모방 할 수있는 마이크로 TENN의 잠재력을 보여주었습니다. stereotaxic microinjection 후, 우리는 이전에 마이크로 TENN의 연결의 생존, axonal tract 건축의 유지 및 생체 내 에서 적어도 1 개월까지의 숙주 피질로의 신경 돌기 연장을보고했다. 또한, synapsin으로 라벨링은 원시 조직과의 시냅스 통합의 조직 학적 증거를 제공했다. 전반적으로 마이크로 TENN은 손상된 부분을 재구성하고 변조하는 데 적합 할 수 있습니다CNS는 잃어버린 뉴런을 교체하고, 숙주 회로와 시냅스 적으로 통합하고, 축삭 세포 구조를 잃어버린 채로 복원하며, 경우에 따라 축삭 재생 축삭에 적절한 길 찾기 신호를 제공함으로써 가능합니다.

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그림 1 : 마이크로 조직 공학 신경 네트워크 (마이크로 TENN) 개발의 원리와 영감 ( A ) Micro-TENN은 기능적으로 구별되는 영역이 단방향 (적색, 녹색) 또는 양방향 (파란색) 방식으로 길고 정렬 된 축색 영역에 의해 연결되는 brain connectome (자주색)의 세포 구조를 모방합니다. 예를 들어, micro-TENNs는 대뇌 피 질 및 흑질 선 경로에서, 또는 entorhinal cortex에서 해마에 이르는 경로에서 분실 된 연결을 재구성 할 수있다 (Struzyna et al. , 2015). ( B ) 단방향의 다이어그램l 및 양방향 micro-TENN (각각 빨간색과 파란색)을 사용하여 병변의 양쪽 끝 사이의 기능 중계 역할을하는 호스트 회로 (자주색)와 통합됩니다. ( C ) micro-TENN이 상호 작용하는 표적을 향한 축색 돌기 (보라색)의 축삭 촉진 재생을위한 가이드 역할을하는 단 향성 마이크로 TENN (녹색)의 축삭 덩어리의 개략도. ( D ) 흥분성 또는 억제 성 뉴런과의 시냅스 통합을 이용하여 신경 조절기로서의 광학 유전 학적으로 활성 인 마이크로 TENNS의 사용에 대한 개념도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

현재의 원고는 배아 적으로 추출 된 대뇌 피질 뉴런을 사용하여 마이크로 TENN을 제조하는 데 사용 된 방법론을 상세히 설명합니다. 주목할 만하게, micro-TENNs는 다른 종류의 신경 세포로 만들어 질 수있다. 예를 들어충분한, 마이크로 TENN 개발 성공의 초기 보고서는 지느러미 뿌리 신경절 (DRG) 뉴런을 특징으로합니다 32 . 하이드로 겔 미세 기둥은 주문 제작 된 레이저 컷 원통형 채널 어레이 또는 모세 혈관 튜브에 액체 아가로 오스를 추가하여 생성 할 수 있습니다 ( 그림 2A ). 바늘은 내강을 형성하고 미세 기둥의 내경 (ID)을 결정하는 반면 모세관 ID 및 레이저 절단 장치의 기둥 직경은 구조체의 외경 (OD)을 결정합니다. OD 및 ID는 장치 / 모세관 및 침침 바늘에 각각 다른 직경을 선택하여 원하는 용도에 따라 선택할 수 있습니다. 미세 기둥의 길이 또한 다양 할 수 있습니다. 지금까지 우리는 길이가 20mm 인 마이크로 TENN의 건설을보고했으며, 더 긴 길이를 적극적으로 추구하고 있습니다. 아가로 오스 겔과 침술 후Eedles를 제거하면 일반적으로 I 형 콜라겐과 라미닌으로 구성된 ECM 용액을 구조물의 루멘에 첨가합니다 ( 그림 2C ). ECM 코어는 신경 세포 접착 및 축색 돌기를지지하기위한 지지체를 제공한다. 초기에, 일차 쥐 대뇌 피질 뉴런은 해리 된 세포 현탁액 10 , 31 , 32 를 사용하여 마이크로 칼럼에 도금되었다. 그러나,이 접근법은 모든 경우에 표적 세포 구조를 생성하지 않았는데, 이는 뉴 칼럼의 말단에 한정된 신경 세포 몸체로 정의되었고, 중심 루멘은 순수한 정렬 된 축삭 영역으로 구성되었다. 그 이후 강제적 인 신경 집계 방법 (Ungrin et al .의 프로토콜을 기반으로 함)을 사용하여 이상적인 구조 ( 그림 2B )로 마이크로 TENN을보다 안정적이고 일관되게 제작할 수있었습니다. 전류를 설명하는 것 외에도방법론에서,이 기사는 시간이 지남에 따라 axonal tracts의 형성을 증명하는 micro-TENN의 대표적인 위상 - 대조 및 공 촛점 이미지뿐만 아니라 최종 표적 세포 구조를 보여줄 것이다. 이 원고는 프로토콜의 중요한 측면과 마이크로 TENN 기술의 향후 과제 및 향후 방향으로 확장 될 것입니다.

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그림 2 : 3 단계 마이크로 TENN 제조 공정의 개략도. ( A ) 아가로 오스 하이드로 겔의 개발 : (i) 처음에는 직경이 180-350 μm 인 작은 침침이 맞춤형 레이저 컷 몰드 또는 모세관 튜브의 원통형 채널에 삽입된다. , 직경 380-700 μm). 다음 단계에서, DPBS의 액상 아가로 오스가 원통형 채널 또는 모세관에 도입된다. (ii) 아가 로스 젤 후, 바늘을 제거하고주형을 분해하여 중공 아가 로스 미세 기둥을 수득한다. (iii) 이들 구조체는 DPBS에 살균되고 저장된다. ( B ) 일차 뉴런 문화와 집계 방법 : (1) 뉴런 집합은 12 잘 배양 접시의 우물에 맞는 3D 인쇄 금형에서 캐스팅 피라미드 형 마이크로 우물 어레이에서 수행됩니다. (ii) Micro-TENN은 배아 일 -18 쥐의 태아 두뇌에서 해리 된 일차 쥐 뉴런을 포함한다. 트립신 -EDTA 및 DNase I로 조직 해리시킨 후, 1.0-2.0 x 106 세포 / mL의 밀도를 갖는 세포 용액을 제조 하였다. (iii)이 용액 12 μL를 피라미드 마이크로 웰 어레이의 각 웰로 옮긴다. 이러한 마이크로 우물을 포함하는 플레이트를 원심 분리하여 세포 응집체를 생성한다. (iv) 이들을 마이크로 칼럼에서 도금하기 전에 밤새 배양한다. ( C ) ECM 코어 제작 및 세포 파종 : (i) 세포 파종 전에, 1 mg / mL 타입 I 콜라겐 및 1 mg / mL를 함유하는 ECM 용액라미닌은 마이크로 TENN의 내부로 전달되어 중합 될 수있다. (ii) 단방향 또는 양방향 micro-TENN이 제조되는지 여부에 따라, 응집체는 마이크로 컬럼의 한쪽 또는 양쪽 극단에 각각 위치한다. (iii) 접착을 촉진하기위한 배양 기간 후, micro-TENNs를 보충 된 배아 뉴론 기저 배지로 침수시킨 페트리 접시에서 배양한다. (iv) 배양 3 ~ 5 일 후, 최종 마이크로 -TENN 구조는 마이크로 - 칼럼의 극단에서 세포 집합체를 보여야하며, 길이에 걸친 축삭 영역이 있어야한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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프로토콜

동물을 포함한 모든 절차는 펜실베이니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회와 마이클 J. 크레센츠 재향 군인 의료 센터 (American J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center)의 승인을 얻었으며 NIH 공중 보건 서비스 정책에 규정 된 지침에 따라 실험실의 인간애 관리 및 사용 동물 (2015).

1. 아가로 오스 하이드로 겔 (마이크로 TENN의 무 세포 성분)

  1. 아가로 오스 용액 준비
    1. biosafety 캐비닛 내에서 두 개의 10cm 페트리 접시 각각에 Dulbecco의 인산 버퍼 식염수 (DPBS) 20 ML을 전송하여 마이크로 컬럼을위한 저수지를 준비합니다. 뜨거운 비드 멸균기로 미세 포셉 및 마이크로 알펠을 소독하십시오.
    2. 아가로 오스 3g을 바이오 안전성 캐비닛 안의 멸균 비이커에 옮긴다. 3 % 중량 / 부피 (w / v)의 최종 농도를위한 100 mL의 DPBS를 첨가한다. 깨끗한 마그네틱 바를 포함하고 알류미로 비커를 덮으십시오.num 호입니다.
    3. 핫 플레이트 / 교반기로 100 ℃에서 비이커를 따뜻하게하고 120 ~ 200 rpm으로 저어서 아가로 오스를 완전히 녹이십시오 (용액이 흐려지면서 투명하게 변합니다). 나중에 겔화를 방지하기 위해 가열 및 교반을 유지하고 아가로 오스가 연소되지 않도록 가열 온도를 변경하십시오.
      참고 : 레이저 절단 장치와 모세관 튜브를 사용한 제작은 아래 1.2 및 1.3 절에서 각각 설명합니다. 하위 섹션에 설명 된 단계를 완료 한 후 1.4 절로 진행하십시오. 두 가지 마이크로 컬럼 제조 방법의 경우, 아가로 오스가 식을 때 급속히 응고 될 때 액체 아가 로스를 신속하게 첨가하십시오. 다음 단계에서 오토 클레이브로 멸균 할 때는 유리 제품에 적용된 표준 조건을 사용하십시오.
  2. 레이저 컷 장치를 사용한 미세 기둥 준비
    참고 : 레이저 절단 장치는 상용 CO2 레이저 커터를 사용하여 투명 아크릴로 절단합니다. 파브리레이저 절단을 통한 구조 및 장치의 양이온은 다양한 엔지니어링 및 연구 응용 분야에 잘 설명되어 있습니다 45 , 46 , 47 . 이 금형 ( 그림 3 )은 직경이 398 μm이고 길이가 6.35 mm 인 5 개의 원통형 채널이 배열되어 있습니다. 이들 원통형 어레이는 그 길이를 따라 하반부 (길이 : 25.4㎜, 폭 : 6.35㎜, 높이 : 6.0㎜)와 상반부 (길이 : 31.5㎜, 폭 : 6.35㎜, 높이 : 12.7㎜ ( 도 3a 및 도 3b 에 각각 도시 됨). 두 개의 반쪽은 그림 3C (길이 : 31.5mm, 폭 : 6.35mm, 높이 : 12.7mm)에서 볼 수 있는 전방 및 후방 캡에 의해 함께 고정 될 수 있으며, 위쪽 및 아래쪽 각각에 2 개의 구멍과 일치하는 4 개의 정렬 구멍이 있습니다 조각으로 고정하면 모든 부품을 고정시킬 수 있습니다. 이 모자는 또한 inc원통형 채널과 동심 인 5 개의 구멍으로 마이크로 - 칼럼의 루멘을 형성하기 위해 침침을 삽입 할 수있다.
    1. 알루미늄 호일과 고압 증기 멸균기로 덮어서 그림 3 의 장치를 소독하십시오. 전방 및 후방 캡을 아래쪽 절반 부분에만 맞추고 아래쪽 정렬 구멍에 두 개의 4-40 나사와 너트 (나사 직경 : 3.05 mm)로 세 부분을 고정하여 그림 3D 와 같이 장치를 조립하십시오.
    2. 침술 바늘 (직경 : 180 μm, 길이 : 30 mm)을 장치의 앞쪽 또는 뒤쪽 캡에있는 바늘 구멍에 완전히 삽입하십시오 ( 그림 3D ). 마이크로 피펫을 사용하여 아래쪽 절반 조각에 충분한 액체 아가로 오스 (5 개 채널에 대해 ~ 1 mL)를 부어 각 원통형 채널 반을 완전히 채 웁니다.
    3. 즉시 장치의 상단 절반을 하단 절반에 놓고 단단히 고정 될 때까지 압력을가하십시오원통형 채널을 완성하기위한 장소 (마개와 상단 피스 사이의 마찰로 후자가 제 위치에 유지됩니다). 장치의 채널 내부의 겔화를 허용하기 위해 아가로 오스를 첨가 한 후 실온에서 5 분간 기다립니다.
    4. 장치의 뚜껑에있는 각 구멍에서 바늘을 수동으로 뽑아냅니다. 나사를 제거하고 두 뚜껑과 상단 절반을 하단 절반 조각에서 수동으로 분리합니다. 이때 절반은 하이드로 겔 마이크로 컬럼을 보유합니다.
    5. 미세한 집게를 사용하여 아래쪽 절반 조각의 채널에서 마이크로 컬럼을 부드럽게 제거하고 DPBS가 들어있는 이전에 준비된 페트리 접시에 넣으십시오 (1.1.1 단계). 마이크로 컬럼 제조의 또 다른 라운드를 위해 장치를 재사용하십시오. 1.4 절로 가십시오.
  3. 모세관을 이용한 미세 기둥 제조
    1. 바이오 캐비닛 내부에 유리 모세관 (직경 : 398.78 μm, 길이 : 32 mm)을 옮깁니다. 수동으로긴 튜브를 2.0-2.5 cm 조각으로 채우고 각 조각 ( 그림 2A )에 하나의 침침 (직경 180 μm, 길이 30 mm)을 완전히 삽입합니다.
    2. 비이커에서 액체 아가로 오스 1 ML을 빈 페트리 접시의 표면에 전송합니다. 모세관 튜브와 주입 바늘을 잡고 튜브의 한쪽 끝을 액체 아가로 오스 풀과 접촉시켜 모세관 작용으로 채 웁니다. 모세 혈관 상승을 촉진하기 위해 튜브를 자극하십시오.
      참고 : 모세관 현상이 허용하는 한 높은 액체 아가로 오스로 모세관을 채 웁니다. 이후, 이러한 마이크로 컬럼은 원하는 길이에 따라 더 작은 구조물로 절단 될 수있다. 아가 로스가 냉각되고 빠르게 젤화되어 모세관 현상이 추가로 방지되므로 1-mL 아가로 오스 풀은 일반적으로 하나의 튜브에만 사용됩니다.
    3. 액체가 더 이상 뜨지 않으면 수영장에서 모세관을 꺼내 페트리 접시 표면에 수평으로 놓습니다. 튜브 내부에 아가로 오스 젤을 넣기 위해 5 분 동안 기다리십시오.
    4. 엄지 손가락과 집게 손가락을 튜브 양쪽에 놓고 눌러서 누릅니다. 다른 손으로 엄지 손가락과 집게 손가락을 사용하는 동안 바늘을 빨리 잡아 당겨 미세 기둥 자체가 튜브에서 빠져 나오지 않도록하십시오. 모세관에 30 게이지 바늘을 삽입하여 마이크로 컬럼을 DPBS가 들어있는 접시에 천천히 밀어 넣습니다 (1.1.1 단계).
  4. 마이크로 칼럼 트리밍 및 멸균
    1. 섬세한 집게를 사용하여 DPBS에서 빈 접시로 한 마이크로 컬럼을 섬세하게 옮깁니다. 건조를 방지하기 위해 마이크로 피펫과 함께 마이크로 컬럼의 상단에 DBPS 10 μL를 추가합니다. 시각적 인 지침을 위해 stereoscope 아래에 후자의 요리를 놓으십시오.
      참고 : 프로토콜 전체에서 미세 기둥 건조 또는 탈수 함은 이러한 구조의 일반적인 수화 된 외관과 시각적으로 구별되는 구겨진 구조의 획득을 의미합니다. 탈수 마이크로 - 칼럼은 페트리 접시의 표면에 단단히 부착되고 c수화 된 구조물은 포셉으로 조작 된 후에 표면을 가로 질러 미끄러지는 경향이있는 반면, 쉽게 움직일 수있다. 완전히 건조 된 마이크로 - 칼럼의 위상 - 대조 이미지가 도 8a 에 도시되어 있다 .
    2. 원하는 길이 (여기서는 2 ~ 5 mm)로 줄이기 위해 마이크로 칼럼으로 마이크로 컬럼을 자릅니다. 잘게 집게로 손질 된 마이크로 칼럼을 1.1.1 단계에서 준비한 다른 DPBS 페트리 접시로 옮긴다.
    3. 가공 된 각 마이크로 컬럼에 대해 1.4.1 및 1.4.2 단계를 반복하십시오.
    4. 자외선 (UV) 빛 아래 DPBS 함유 페트리 접시의 마이크로 컬럼을 1 시간 동안 멸균하십시오. ECM 첨가 및 세포 도금 전에 4 ° C에서 페트리 접시를 저장하십시오.

2. 일차 뉴런 배양과 강제 세포 응집 방법

  1. 피라미드 마이크로 웰 어레이의 준비
    참고 :이 섹션에서는 원통형베이스 (직경 : 2.2cm, 높이 : 7.0mm)로 구성된 3D 인쇄 금형을 사용합니다그림 3E 와 같이 3 x 3 어레이로 구성된 9 개의 정사각형 피라미드 (상단 길이 (측면 길이 : 4.0 mm, 경사 각도 : 60 °). 상용 3D 프린터를 사용하는 첨가제 제조 공정은 잘 문서화되어 있습니다. 몰드 설계에 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 그 결과 생성 된 디자인 파일을 3D 프린터의 도구 경로로 디지털 변환 할 수 있습니다. 각 프린터의 사양은 다르므로 3D 프린터 설정 및 작동 지침이 그에 따라 다릅니다.
    1. 10cm 페트리 접시의 뚜껑을 중심으로 4 x ​​4 배열 (측면 길이 : 4 cm, 구멍 분리 : 1 cm)에 16 개의 구멍을 뚫기 위해 3/32 "드릴 비트를 사용하십시오. 화학 흄 후드 내부에는 27 g의 폴리 디메틸 실록산 (polydimethylsiloxane) (PDMS)과 3 g의 경화제 (1:10 비율)의 무게를 측정하기 위해 페트리 접시의 바닥 조각. 마이크로 - 주걱으로 저어 약산을 균등하게 분산시킨다.
    2. PDMS / 경화제를 구멍이 뚫린 뚜껑으로 덮으십시오. 호스의 한쪽 끝을 진공관에 연결하십시오.m 입구에 넣고 다른 쪽 끝을 깔대기 (줄기 직경 10cm, 줄기 길이 3cm, 줄기 직경 1.5cm)의 줄기에 넣습니다.
    3. 1 mL 피펫 전구의 상단에 3/32 "드릴 비트로 개구부를 만들고 1,000 μL 마이크로 피펫 팁을 입구에 삽입하십시오 (뾰족한 끝을 위쪽으로 향하게하십시오). 전구와 팁을 호스에 넣고 당겨서 벌브가 호스를 깔대기의 줄기 안으로 밀봉 할 때까지 호스를 위로 올리십시오.
    4. 구멍이 뚫린 접시 뚜껑에 깔때기를 놓고 사용 가능한 견고한 지지대로 호스를 고정시킵니다. 진공 밸브를 5 분간 열어 흡착시키고 표면에 기포를 가져온다.
    5. 밸브를 닫고 깔때기를 제거한 후 페트리 접시를 퓸 후드의 표면에 대고 3 ~ 4 번 눌러 남아있는 공기 방울을 터뜨립니다.
    6. 피라미드 모양의 3D 인쇄 된 금형을 피라미드가 위로 향하도록 12- 웰 배양 판에있는 각 웰에 놓습니다. 각 우물이 나올 때까지 금형 위에 PDMS / 경화제를 붓습니다.그는 접시가 가득 찼다. 12- 웰 플레이트를 뚜껑으로 덮고 60 ° C에서 1 시간 동안 오븐으로 옮겨 건조시킵니다.
    7. 조심스럽게 마이크로 주걱으로 플레이트에서 각 PDMS 마이크로 어레이 ( 그림 3F )를 제거하십시오. PDMS 어레이를 알루미늄 호일로 덮고 고압 증기 멸균으로 멸균하십시오. biosafety 캐비닛 내부에 하나의 마이크로 웰 어레이를 12 웰 플레이트 ( 그림 2B )의 각 웰에 삽입하십시오.
  2. 쥐 태아에서 두피 신경 세포 분리
    1. 바이오 안전성 캐비닛 안의 4 ~ 6 개의 10cm 페트리 접시 (각 해부 된 조직에 하나씩)에 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) ~ 20mL를 추가합니다. 이러한 요리를 해부 후드로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 뜨거운 구슬 소독기로 미세 칼날, 가위 및 포셉과 같은 해부기구를 소독하십시오.
    2. 예열 전 배아 뉴런 기저 배지 + 2 % 무 혈청 보충제 + 0.4 mM L- 글루타민 ( "배양 배지"라고 함)r)와 0.25 % trypsin + 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)를 첨가하여 37 ℃에서 2 시간 동안 배양 하였다. Deoxyribonuclease (DNase) I을 실온에 방치하여 해동시킨다. HBSS에 0.15 MG / ML DNAse I 용액 1.5 ML을 준비하고 얼음에 솔루션을 유지합니다.
    3. 배아 일 18 마리의 임신 한 태아를 이산화탄소 흡입으로 안락사시키고 목이 잘 빠져 죽을 지 확인하십시오. 시체를 멸균 해부 후드로 옮기고 배 쪽을 위로 눕혀 라. 70 % 에탄올로 복부를 완전히 헹구십시오.
    4. 자궁을 열고 가위로 양막 주머니에서 태아 (일반적으로 ~ 11)를 제거하고 48 절에서 설명한대로 감기 HBSS가 들어있는 페트리 접시로 집게로 옮깁니다. 입체경 아래에 차가운 (-20 ° C) 화강암 블록을 놓습니다. 해부 절차 전반에 걸쳐 HBSS의 낮은 온도를 보존하기 위해 감기 블록의 표면에 페트리 접시를 놓습니다.
    5. HBSS 주위를 스윙하여 새끼를 씻어 다음 깨끗한 접시로 전송HBSS 함유. 입체경과 해부기구의 도움으로, 순차적으로 머리, 대뇌 반구 및 태아의 피질을 제거하고 각 해부 48 후 새로운 HBSS 채워진 접시에 집게로 각 조직을 전송하십시오.
    6. 파스퇴르 피펫으로 피질만을 흡인하고 조직을 멸균 15 mL 원심 튜브에 넣으십시오. 다른 해부 된 조직은 폐기하십시오. 순차적으로 serological 피펫과 HBSS ~ 5 ML을 추가하고 제거하여 cortices 세 번 씻어. 사용하지 않을 때는 튜브를 얼음 위에 놓으십시오.
    7. 미리 데워진 트립신 - EDTA (트립신 - EDTA 5 ML 당 4-6 cortices)가 포함 된 15 ML 튜브에 파스퇴르 피펫으로 cortices을 전송하십시오. 수동으로 튜브를 한번 흔들어 37 ° C에 놓습니다. 조직이 뭉치지 않도록 3 분마다 튜브를 뒤집습니다.
    8. 파스퇴르 피펫으로 조직을 제거하고 깨끗한 15 mL 원심 분리기로 옮겨 ~ 10 분 후 트립신 노출을 중단하십시오튜브. 피펫으로 튜브에 0.15 MG / ML DNase I 용액 (1.5 ML)을 추가합니다.
    9. 파스퇴르 피펫을 사용하여 수동으로 조직 덩어리를 분해 한 다음 용액이 균질 해 보이고 액체에 남아있는 조직 조각이 없어 질 때까지 와동 (~ 30 초)하십시오. 용액을 완전히 균질화 할 수 없다면, 파스퇴르 피펫의 끝 부분으로 당겨서 불용성 조각을 추출하십시오.
    10. 단계 2.2.9에서 얻은 균질 세포 용액을 200 xg에서 3 분간 원심 분리한다. 펠렛 세포를 방해하지 않도록주의하면서 파스퇴르 피펫으로 상층 액을 제거합니다. 혈청 피펫과 vortex와 세포를 resuspend로 문화 매체 2 ML을 추가합니다.
    11. hemocytometer를 사용하여 단계 2.2.10에서 준비한 용액의 세포 수를 세십시오. 예상 수율은 3.0-5.0 x 106 세포 / 피질 반구이다. 1.0-2.0 x 106 세포 / mL의 밀도로 배양 배지에서 세포 현탁액 1 mL 이상을 준비합니다.
  3. 신경 세포 집합체의 형성
    1. micropipette와 PDMS 배열 (단계 2.1.7에서 접시에 배치)의 각 마이크로 우물에 1.0-2.0 X 10 6 / ML 세포 현탁액 12 μL를 추가합니다.
      참고 : 세포 농도는 마이크로 컬럼 ID 및 원하는 세포 응집체 크기에 따라 조정할 수 있습니다. 농도가 높을수록 큰 응집체가 생성되기 때문입니다.
    2. micro-wells ( 그림 2B )의 바닥에 세포의 응집을 강제로 5 분 200 XG에서 접시를 원심 분리기. 조심스럽게 각 PDMS 배열의 상단에 ~ 2 ML의 배양액을 넣어 모든 응집 된 마이크로 우물을 덮고 응집 된 세포를 방해하지 않도록주의하십시오.
    3. 세포가 바이러스 성 벡터로 형질 감염되지 않을 경우, 37 ℃에서 5 % CO2로 12-24 시간 동안 배양 한 다음 3 장으로 진행하십시오. 응집체가 형질 도입 될 경우 부화를 건너 뛰고 2.4 절로 진행하십시오 .
  4. 트란칼슘 시그널링을 관찰하기위한 바이러스 벡터와의 결합
    참고 :이 단계는 유전자 암호화 된 칼슘 지시약 (GECI)을 포함하는 바이러스 벡터로 뉴런을 변환하기 위해 수행됩니다. 이 논문에서 제시된 결과는 녹색 형광 단백질 (GFP), 칼 모둘린 (CaM) 및 M13 펩타이드로 구성된 빠른 속도론을 갖는 GECI 인 GCaMP6f를 갖는 상업적으로 이용 가능한 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) (혈청 형 1) 인간 Synapsin I 프로모터에 의해 구동된다. 바이러스 벡터 솔루션은 주식 솔루션의 농도에 따라, 변환 전에 멸균 DPBS에 희석을 요구할 수 있습니다. 세포 건강 / 형태 및 GCaMP6f 신호 강도는 일정한 벡터 농도 범위에서 시간 경과에 따라 관찰되어야합니다. 이 최적화 절차는 각 세포 배양에 적합한 적정량을 결정하기 위해 각 조사자가 수행해야합니다. 전형적인 GCaMP6f 발현 시간은 st에서 수행 된 배양 중에 일어나는 형질 도입 후 7-8 일이다ep 2.4.2.
    1. 마이크로 피펫을 사용하여 배양액에 바이러스 벡터 용액 (최종 농도 약 3.0 x 10 9 개 집합체)을 배양액에 넣고 필요한 양의 바이러스 벡터 용액을 첨가합니다. 천천히 위아래로 피펫 팅하여 벡터 용액이 배양 배지 전반에 걸쳐 균일하게 분포되도록하십시오.
    2. GCaMP6f의 바이러스 성 형질 도입을 허용하도록 37 ° C와 5 % CO 2 에서 24 시간 동안 시드 피라미드 형 마이크로 우물과 플레이트를 품어.

3. 마이크로 TENNs의 세포 구성 요소의 개발

  1. ECM 코어 제작
    1. 총 부화 후, ECM 솔루션을 준비하는 microcentrifuge 튜브에 문화 매체 (각각 1 밀리그램 / ML의 농도에 대한)에 타입 I 콜라겐과 laminin를 추가합니다. 실온에서 3.1.2-3.1.4 단계를 수행하고, 조기 겔화를 방지하기 위해 사용하지 않을 때는 얼음 위의 ECM으로 튜브를 유지하십시오.
      참고 : 일반적인 비용은 각 마이크로 컬럼 (길이 : 5 mm, ID : 180 μm)에 대해 4 μL의 ECM 솔루션입니다.
    2. 리터머스 종이에 1-2 μL를 옮겨 ECM에 1 N 수산화 나트륨 (NaOH) 및 / 또는 1 N 염산 (HCl) 1 μL를 첨가하여 초기 pH를 확인하고, pH가 7.2-7.4가 될 때까지 반복한다. 기포 형성을 피하면서 위 / 아래로 pipetting하여 ECM 용액의 균질화를 확인하십시오.
    3. 1.4.3 단계의 접시에서 멸균 집게로 마이크로 칼럼을 35 또는 60mm 빈 페트리 접시에 옮긴다. 탈수를 방지하기 위해 한 번에 4-5 마이크로 컬럼을 작업하십시오. 마이크로 피펫에 1,000μL 팁에 부착 된 10μL 팁을 부착하십시오. 시각적 안내를 위해 입체경을 사용하여 팁을 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 놓고 흡인하여 잔여 DPBS 및 공기 방울을 루멘에서 추출합니다.
    4. micropipette에 4-5 μL의 ECM을 빠르게 작성하십시오. 관찰 아래에서 ste현미경을 사용하여 미세 기둥의 끝 부분에 micropipette의 팁을 놓고 루멘을 채우기에 충분한 ECM을 배출합니다. ECM을 통한 축색 돌기를 억제 할 수 있으므로 루멘의 기포가 없음을 확인하십시오. 기포가있는 경우 3.1.3 단계에서 설명한대로 ECM을 제거하고 ECM을 다시 추가하십시오.
    5. 탈수를 방지하기 위해 각 마이크로 컬럼 주위에 ~ 2 μL의 ECM을 추가하십시오. 페트리 접시에서 37 분 C와 5 % CO 2 에서 25 분 동안 하이드로 겔 / ECM 마이크로 컬럼을 부화시킨다. 부화 후 즉시 세포 파종에 진행하십시오.
      참고 : 단계 3.1.5의 잠복기는 마이크로 컬럼 내부 콜라겐과 라미닌의 중합 시간을 허용하기위한 것입니다.
  2. 미세 기둥의 신경 세포 시딩
    참고 : 변환 된 집합체의 배양 배지를 변경하려면 플레이트를 기울이고 마이크로 피펫을 사용하여 웰 벽에 쌓인 배지를 제거한 다음 천천히 ~ 1 mL를벽 (피라미드 형 마이크로 우물에서 응집체를 방해하지 않기 위해). 이 매체 변경을 다시 한 번 반복하십시오.
    1. 단계 3.1.5에서 잠복기 다음, 마이크로 컬럼을 들고 페트리 접시에 두 개의 무료 영역으로 약 10-20 μL 문화 매체를 전송합니다. micropipette을 사용하여 개별적으로 구조를 포함하는 페트리 접시에 집계를 전송하고 세포 건강을 보존하기 위해 작은 매체 풀 중 하나에 집게로 그들을 이동합니다.
    2. 입체경에서 관찰하면서 양방향 마이크로 TENN의 경우 마이크로 컬럼의 각 끝에 집계를 삽입하고 집게를 사용하여 단방향 아키텍처의 경우 한쪽 끝에 집계를 삽입하십시오. 입체경을 사용하여 마이크로 컬럼 내부에 집합체의 위치를 ​​확인하십시오. 포셉을 사용하여 탈수를 피하고 전체 건강을 보존하기 위해 시드 마이크로 컬럼을 다른 작은 배양 배지로 이동하십시오.
    3. 37 ° C 및 5 % CO 2 에서 45 분 동안 품어집계가 ECM을 따르도록합니다. 입체경을 사용하여 응집체가 마이크로 칼럼의 끝에 남아 있는지 확인하십시오. 세포 응집체를 재 도입하고 필요에 따라 배양 단계를 반복하십시오.
    4. 조심스럽게 혈청 피펫을 사용하여 마이크로 TENNs가 들어있는 페트리 접시를 배양 매체 (각각 35 또는 60mm 페트리 접시의 경우 3 또는 6mL)로 가득 채우십시오. 37 ° C와 5 % CO 2의 배양기에 장기간 배양하십시오.
    5. 배지로 2 일마다 하프 미디어 변경을 수행하십시오. 조심스럽게 피펫으로 오래된 매체의 절반을 제거하고 마이크로 TENNs을 흡입하지 않도록 시각적 안내를 위해 입체경을 사용하십시오. 신선한, 미리 데워진 매체를 피펫으로 천천히 추가하여 교체하십시오.
    6. PDMS 마이크로 우물 배열을 reutilize하려면, 문화 매체를 제거하고, 30 분 탈 이온수에 배열을 종기하고, 골재 형성 및 문화의 또 다른 라운드에 대한 오토 클레이브에서 소독.
      참고 : 원하는 시간대에서미세 TENNs의 세포 구조는 위상차 현미경을 사용하여 검증 할 수 있습니다. 여기서 5-8ms 및 10X (0.64 μm / 픽셀) 및 20X (0.32 μm / 픽셀) 대물 렌즈의 노출 시간을 사용하여 위상 대비 이미지를 캡처했습니다. 바이러스로 변환 된 마이크로 TENNs에서 칼슘 농도 변화와 관련된 형광은 50ms 노출 시간, 10X 대물 렌즈 (0.64 μm / 픽셀) 및 ~ 480의 대역 통과 필터를 갖는 고체 상태 광을 사용하여 고속 형광 현미경을 사용하여 캡처했습니다 GCaMP6f 형광 신호를 시각화하기 위해 각각 여기 및 방출에 대해 ~510nm 및 ~ 510nm.

4. In vitro 실험을위한 면역 세포 화학

참고 : 여기에 표시된 이미지의 경우 다음과 같은 기본 항체가 사용되었습니다 : 축삭과 사전의 라벨에 대한 마우스 항 Tuj - 1 / 베타 - III의 tubulin (1시 500 분)와 토끼 안티 synapsin - 1 (1시 500 분) - 시냅스 부용제. 2 차 항체는 당나귀- 마우스 568 (1 : 500)과 당나귀 - 토끼 488 (1 : 500). 포름 알데히드, 말 혈청 및 세제 용액의 부피뿐만 아니라 준비된 1 차 및 2 차 항체 용액의 필수 부피는 구조물을 완전히 덮기 위해 필요한 부피에 달려있다. 이러한 볼륨은 각 마이크로 컬럼을 둘러싸는 영역을 제한하기 위해 소수성 장벽 펜을 사용하여 최소화 할 수 있습니다.

주의 :이 절에서는 포름 알데히드와 Hoechst를 사용합니다. 포름 알데히드는 발암 성이있는 것으로 알려진 독성 화합물이며 Hoechst는 알려진 돌연변이 유발 물질입니다. 따라서 이러한 화합물은 적절한 폐기 용기에 폐기해야합니다. 실험실 외투, 안전 안경 및 장갑과 같은 적절한 개인 보호 장비를 사용하면서 항상 화학 흄 후드에서 취급하십시오.

  1. 화학 흄 후드 내부의 1x 인산염 완충 식염수 (PBS)에 4.0 % 부피 / 부피의 포름 알데히드 용액을 준비합니다.
  2. 배양 접시에서 배양 배지를 제거하십시오.micro-TENN을 마이크로 피펫으로 채 웁니다. 포름 알데히드 용액을 접시에 충분히 넣어 마이크로 TENN을 완전히 덮으십시오. 18-24 ° C에서 35 분 동안 포름 알데히드 용액에 마이크로 TENN을 담그고 마이크로 컬럼 내에서 세포를 고정시킵니다.
  3. 페트리 접시로 4.0 % 포름 알데히드 용액을 제거하고 적절한 위험 물질 처리 지침에 따라 버립니다.
  4. 고정 된 마이크로 TENNs를 완전히 커버하기 위해 충분한 PBS를 추가하고 피펫으로 PBS를 제거하여 두 번의 빠른 린스를 수행하십시오. 10 분 동안 PBS에 구조물을 담가 두어 세 번째로 긴 헹굼을 수행하십시오.
    주의 : 헹굼에 사용 된 PBS는 흔히 포름 알데히드가 포함 된 것으로 폐기하십시오.
  5. PBS로 4 % v / v 말 혈청에서 비이 온성 세제의 0.3 % v / v 용액을 준비한다. 고정 마이크로 TENNs가 들어있는 페트리 접시에서 PBS를 제거하고 구조를 커버하는 0.3 % 세제 솔루션의 충분한 볼륨을 추가합니다. 18-24 및 60 분에 60 분 동안 담그십시오.176 ℃에서 세포를 투과시킨다.
  6. 피펫으로 세제 용액을 제거하십시오. PBS를 넣고 뺀 다음 두 번 빨리 헹구십시오. 그 후에, 각 헹구기 동안 5 분 동안 PBS에 구조물을 담가서 세 번의 긴 헹굼을 수행하십시오.
  7. 4 % 말 혈청에서 1 차 항체를 희석하십시오. 고정 및 permeabilized 마이크로 TENNs을 포함하는 페트리 접시에서 PBS를 제거합니다. 완전히 커버하기 위해 마이크로 컬럼에 충분한 1 차 항체 용액을 첨가하십시오. 증발을 막기 위해 파라 필름으로 페트리 접시를 밀봉하고 4 ° C에서 밤새 (12-16 시간) 배양하십시오.
  8. 접시에서 일차 항체 용액을 제거하고 4.6 단계에서 설명한대로 헹구십시오. 어둠 속에서 4.0 % 말 혈청에서 2 차 항체 용액을 준비하십시오. 충분한 이차 항체 솔루션을 추가하여 구조물을 완전히 커버하고, 알루미늄 호일로 접시를 덮고 18-24 ° C에서 2 시간 동안 배양하십시오.
  9. 핵을 얼룩이 PBS에 Hoechst 솔루션 (1 : 10,000)을 준비합니다.
  10. 2 차 항체 용액을 제거하고 18-24 ℃에서 10 분 동안 Hoechst 용액에서 micro-TENNS를 배양합니다. 5 ~ 10 분간 PBS로 5 회 헹군다. 얼룩진 마이크로 TENNs을 커버하기 위해 PBS로 페트리 접시를 홍수, 알루미늄 호일에 접시를 포장하고 이미징이 수행 될 때까지 4 ° C에서 저장하십시오.
    참고 : immunolabeled 마이크로 TENNs에 대한 이미지는 2,048 (~ 8 초 / 프레임), 10X 대물 렌즈 (0.64 μm / 픽셀), 487 nm 여기 및 ~ 525 nm 방출 파장의 해상도를 가진 레이저 공 촛점 현미경으로 촬영했습니다. 녹색 형광, 561 nm 여기 및 적색 형광에 대해서는 ~ 595 nm 방출 파장, z 스택에 대해 평균 ~ 60 슬라이스로 ~ 3.22 μm / 슬라이스.

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결과

Micro-TENN은 위상차 현미경을 사용하여 모니터하여 세포 구조 및 축색 돌기를 평가했습니다 ( 그림 4 ). 단방향, 2mm 길이의 마이크로 -TENN 내에서, 뉴런 집합체는 마이크로 - 컬럼의 한쪽 말단으로 제한되고 내부 코어를 통해 축색 돌기가 투영되었다. Axons 은 체외에서 5 일 (DIV) ( 그림 4A ) 열의 전체 길이를 스팬. 축색 돌기가 3 DIV ( 그림 4B )에 의해 전체 마이크로 컬럼을 스팬하기 때문에 양방향 2 mm 길이의 마이크로 TENN에서 더 큰 초기 축삭 성장 속도가있었습니다. 5 DIV에 의해, 양방향 micro-TENNs는 마이크로 컬럼의 극단에서 유지 된 응집체를 연결하는 조밀 한 축삭 덩어리를 특징으로했다. 이 cytoarchitecture는 5-DIN micro-TENNs에서도 관찰되었으며 축색 돌기는 5-DIV로 ...

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토론

CNS 손상 및 질병은 전형적으로 부수적 인 신경 세포 변성의 유무에 관계없이 뇌 결합체를 구성하는 장거리 축삭 경로의 손실 또는 기능 부전을 야기한다. 이것은 신경 발생 및 재생을 촉진하는 CNS의 제한된 용량에 의해 합성됩니다. 성장 인자, 세포 및 생체 물질 전달과 같은 수복 전략을 개별적 또는 조합 적 접근으로 추구 함에도 불구하고 이러한 기술은 신경 세포의 퇴행과 축삭 연결의 손실을 동시에 설명하지 못한다 14 , 22 . 이러한 기술 격차는 통제되고 지속적인 방식으로 신경망을 수리, 변경 및 조사하는 능력을 제한합니다. 따라서 마이크로 TENN 기술은 기존의 방법과 달리 신경 교체 및 긴 축삭 연결 재건을 용이하게하는 신경 치료 전략의 필요성을 해결하기 위해 개발되었습니다. 마이크ro-TENN은 숙주 신경 회로의 표적 재구성, 교체 및 변형을 위해 특별히 설계된 뇌 결합체의 시스템 수준 빌딩 블록에 접근하는 예비...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

재정 지원은 U01-NS094340 (컬린), T32-NS043126 (해리스), F31-NS090746 (카티 야), 마이클 J. 폭스 재단 (치료 파이프 라인 프로그램 # 9998 (컬린) (Cullen), 미국 과학 재단 (대학원 연구 동창 DGE-1321851 (Struzyna and Adewole)), Veterans Affairs (RR & D Merit Review # B1097-I (Cullen)), Penn Medicine 신경 과학 센터 파일럿 상 신경 외과 의사 및 신경 외과 의사 회의 (2015-2016 년 신경 외상 및 중환자 실에서의 코닥 개인 연구 (Petrov)) 및 미 육군 의학 연구 및 물질 명령 (# W81XWH-13-207004 (컬른) 및 W81XWH- 0466 (컬른)).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
레이저 절단기범용 레이저 시스템PLS4.75레이저 절단 마이크로 채널 금형을 제작하는 데 사용됩니다.
레이저 컷 마이크로 컬럼 제작 장치맞춤 제작--------------관심이 있으시면 당사 연구 그룹에 문의하십시오. 원고에 제공된 치수와 청사진.
나사----------------------------# 4-40 나사 직경 3.05 mm
너트----------------------------# 4-40 나사 직경 3.05 mm
침 (180 µ m 직경)Lhasa Medicalsj.16X40직경은 마이크로 컬럼 루멘의 원하는 크기에 따라 달라질 수 있습니다.
페트리 접시Fisher08772B
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)Invitrogen14200075
폴리스티렌 일회용 혈청학 피펫Fisher13-678-11D
AgaroseSigmaA9539-50G
모세관 (398 µ m 직경)Fisher21170D직경은 마이크로 컬럼 쉘의 원하는 크기에 따라 달라질 수 있습니다.
핫 플레이트FisherSP88857200
마그네틱 바Fisher1451352
MicropipetteSigmaZ683884-1EA
25mm 게이지 바늘Fisher14-826-49
MicroscalpelRoboz SurgicalRS-6270
가위미세 과학 도구14081-09
집게세계 정밀 기기501985
핫 비드 살균기시그마Z378550-1EA
입체 스코프니콘SMZ800N모든 해부 단계 및 마이크로 TENN 제작에 사용됩니다.
쥐 꼬리 유형 I 콜라겐코닝3542364 º에서 유지하십시오. C는 필요할 때만 제거합니다.  사용 중 온도를 유지하기 위해 얼음을 사용하십시오.
마이크로 원심 분리기 튜브Fisher02-681-256
마우스 라미닌Corning3542324 º에서 유지; C는 필요할 때만 제거합니다.  사용 중 온도를 유지하기 위해 얼음을 사용하십시오.
Neurobasal mediumInvitrogen21103049출생 전 및 배아 신경 세포 배양을 위한 기저 배지. 4º에 저장; C 및 37 º에서 따뜻하게; C 사용하기 전에.
수산화나트륨 (NaOH)FisherSS2661
염산 (HCl)FisherSA48-1
리트머스 종이Fisher09-876-18
Hank's Balanced Salt solution (HBSS)Invitrogen14170112Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTAInvitrogen25200056-20 º에 저장합니다. C 및 37 º에서 따뜻하게; C 사용하기 전에.
소 췌장 데옥시리보뉴클레아제(DNase) ISigma10104159001-20 º C 및 37 º에서 따뜻하게; C 사용하기 전에.
B-27 보충제Invitrogen12587010Supplement는 해마 및 피질 뉴런 배양을 위해 Neurobasal 배지에 추가되었습니다. -20 º에서 저장; C 및 37 º에서 따뜻하게; C 사용하기 전에.
L-글루타민 Invitrogen35050061-20 º의 매장; C 및 37 º에서 따뜻하게; C 사용하기 전에.
Sprague Dawley 배아 일 18 쥐Charles RiverStrain 001
파스퇴르 피펫Fisher22-042816
15 mL 원심 분리기 튜브EMESCO1194-352099
VortexFisher02-215-414
원심 분리기Fisher05-413-115
혈구계Fisher02-671-6
Objet30 3D 프린터Stratasys --------------피라미드 형 마이크로 웰 주형을 제작하는 데 사용됩니다.
3D 프린팅 피라미드 형맞춤 제작--------------관심이 있으시면 연구 그룹에 문의하십시오. 원고에 제공된 치수와 청사진.
폴리디메틸실록산(PDMS) 및 경화제FisherNC9285739엘라스토머 및 경화제가 포함된 키트로 제공됩니다. 화학 흄 후드 내부에서 사용하십시오.
깔때기Fisher10-348C
1ml 피펫 전구SigmaZ509035
마이크로 주걱FisherS50821
12웰 배양 플레이트EMESCO1194-353043
오븐Fisher11-475-154
인큐베이터Fisher13 998 076
AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40UPenn Vector Core36373-80ºC에 저장. GCaMP6f 칼슘 지시약이 있는 상업적으로 이용 가능한 아데노 관련 바이러스(AAV).
포름알데히드 40%FisherF77P-4포름알데히드는 발암성이 알려진 독성 화합물이며, 별도의 용기에 버려야 합니다. 
Triton X-100SigmaT8787세포막을 투과시키는 데 사용되는 비이온 계면활성제.
말 혈청Gibco16050-122
마우스 anti-Tuj-1/beta-III tubulin 1차 항체SigmaT8578-200UL-20ºC에서 보관.
토끼 항 시냅신 1 일차 항체Synaptic Systems106-001-20ºC에 저장.
당나귀 안티 마우스 568 2 차 항체InvitrogenA100374º C에 저장.
당나귀 항토끼 488 2차 항체InvitrogenA212064ºC에 저장.
Hoechst 33342, TrihydrochlorideInvitrogenH3570Store at 4ºC.  Hoechst는 발암 물질로 취급되어야 하는 알려진 돌연변이 유발 물질입니다.  따라서 별도의 용기에 폐기해야 합니다.
A1RSI 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 Nikon--------------표지된 구조체의 컨포칼 재구성을 수행하는 데 사용됩니다.
Eclipse Ti-S 현미경 Nikon--------------위상차 이미지를 촬영하는 데 사용됩니다.  Nikon Elements Basic Research 소프트웨어(4.10.01)와 인터페이스된 QiClick 카메라를 사용한 디지털 이미지 획득.
고속 형광 현미경Nikon--------------Nikon Eclipse Ti 현미경은 칼슘 이미징을 위해 ANDOR Neo/Zyla 카메라와 페어링됩니다.
NIS Elements AR 4.50.00 소프트웨어Nikon Instruments--------------고속 형광 현미경으로 촬영한 기록물에서 칼슘 과도 현상을 식별하는 데 사용됩니다. 
면역

참고문헌

  1. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10 (5), 679-685 (2015).
  2. Tallantyre, E. C., Bø, L., et al. Clinico-pathological evidence that axonal loss underlies disability in progressive multiple sclerosis. Mult. Scler. 16 (4), 406-411 (2010).
  3. Cheng, H. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical Progression in Parkinson Disease and the Neurobiology of Axons. Ann. Neurol. 67 (6), 715-725 (2010).
  4. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp. Neurol. 246, 35-43 (2013).
  5. Hinman, J. D. The back and forth of axonal injury and repair after stroke. Curr. Opin. Neurol. 27 (6), 615-623 (2014).
  6. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37 (8), 1105-1129 (2012).
  7. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407 (6807), 963-970 (2000).
  8. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
  9. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34 (13), 4443-4444 (2014).
  10. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21 (21-22), 2744-2756 (2015).
  11. Huebner, E. a, Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  12. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons' Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67 (9), 1148-1165 (2007).
  13. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  14. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3 (2), 115-122 (2016).
  15. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296 (11), 150-152 (1982).
  16. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214 (4523), 931-933 (1981).
  17. Shoichet, M. S., Tate, C. C., Baumann, M. D., LaPlaca, M. C. Strategies for Regeneration and Repair in the Injured Central Nervous System. Indwelling Neural Implant. Strateg. Contend. with Vivo Environ. , at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK3941/ (2008).
  18. Lu, P., Tuszynski, M. H. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration. Exp. Neurol. 209 (2), 313-320 (2008).
  19. Curinga, G., Smith, G. M. Molecular/genetic manipulation of extrinsic axon guidance factors for CNS repair and regeneration. Exp. Neurol. 209 (2), 333-342 (2008).
  20. Mehta, S. T., Luo, X., Park, K. K., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. Hyperactivated Stat3 boosts axon regeneration in the CNS. Exp. Neurol. 280, 115-120 (2016).
  21. Elliott Donaghue, I., Tam, R., Sefton, M. V., Shoichet, M. S. Cell and biomolecule delivery for tissue repair and regeneration in the central nervous system. J. Control. Release. 190, 219-227 (2014).
  22. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 169-188 (2014).
  23. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H., Pfister, B. J. Neural Tissue Engineering for Neuroregeneration and Biohybridized Interface Microsystems In vivo (Part 2). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 243-262 (2011).
  24. Han, Q., Jin, W., et al. The promotion of neural regeneration in an extreme rat spinal cord injury model using a collagen scaffold containing a collagen binding neuroprotective protein and an EGFR neutralizing antibody. Biomaterials. 31 (35), 9212-9220 (2010).
  25. Suzuki, H., Kanchiku, T., et al. Artificial collagen-filament scaffold promotes axon regeneration and long tract reconstruction in a rat model of spinal cord transection. Med. Mol. Morphol. 48 (4), 214-224 (2015).
  26. Silva, N. A., Salgado, A. J., et al. Development and Characterization of a Novel Hybrid Tissue Engineering-Based Scaffold for Spinal Cord Injury Repair. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 45-54 (2009).
  27. Moore, M. J., Friedman, J. A., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27 (3), 419-429 (2006).
  28. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J. Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
  29. Chen, B. K., Knight, A. M., et al. Axon regeneration through scaffold into distal spinal cord after transection. J. Neurotrauma. 26 (10), 1759-1771 (2009).
  30. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27 (3), 497-504 (2006).
  31. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13 (1), 16019-16037 (2016).
  32. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18 (21-22), 2280-2289 (2012).
  33. Tate, M. C., Shear, D. A., Hoffman, S. W., Stein, D. G., Archer, D. R., LaPlaca, M. C. Fibronectin promotes survival and migration of primary neural stem cells transplanted into the traumatically injured mouse brain. Cell Transplant. 11 (3), 283-295 (2002).
  34. Denham, M., Parish, C. L., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Front. Cell. Neurosci. 6 (11), (2012).
  35. Fawcett, J. W., Barker, R. A., Dunnet, S. B. Dopaminergic neuronal survival and the effects of bFGF in explant, three dimensional and monolayer cultures of embryonic rat ventral mesencephalon. Exp. Brain Res. 106 (2), 275-282 (1995).
  36. Mine, Y., Tatarishvili, J., Oki, K., Monni, E., Kokaia, Z., Lindvall, O. Grafted human neural stem cells enhance several steps of endogenous neurogenesis and improve behavioral recovery after middle cerebral artery occlusion in rats. Neurobiol. Dis. 52, 191-203 (2013).
  37. Ren, H., Chen, J., Wang, Y., Zhang, S., Zhang, B. Intracerebral neural stem cell transplantation improved the auditory of mice with presbycusis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 6 (2), 230-241 (2013).
  38. Sinclair, S. R., Fawcett, J. W., Dunnett, S. B. Dopamine cells in nigral grafts differentiate prior to implantation. Eur. J. Neurosci. 11 (12), 4341-4348 (1999).
  39. Tate, C. C., Shear, D. A., Stein, D. G., Tate, M., LaPlaca, M. C., Archer, D. R. Laminin and fibronectin scaffolds enhance neural stem cell transplantation into the injured brain. J. Tissue Eng. Regen. Med. 3 (3), 208-217 (2009).
  40. Yoo, S. J., Kim, J., Lee, C. -S., Nam, Y. Simple and novel three dimensional neuronal cell culture using a micro mesh scaffold. Exp. Neurobiol. 20 (2), 110-115 (2011).
  41. Chen, H. I., Jgamadze, D., Serruya, M. D., Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H. Neural Substrate Expansion for the Restoration of Brain Function. Front. Syst. Neurosci. 10, (2016).
  42. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V. N., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 201-240 (2011).
  43. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18 (6), 308-318 (2014).
  44. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3 (2), (2008).
  45. Dahotre, N. B., Harimkar, S. Laser fabrication and machining of materials. , Springer Science & Business Media. (2008).
  46. Kutter, J. P., Klank, H., Snakenborg, D. Microstructure fabrication with a CO2 laser system. J. Micromechanics Microengineering. 14 (2), (2004).
  47. Spicar-Mihalic, P., Houghtaling, J., Fu, E., Yager, P., Liang, T., Toley, B. CO2 laser cutting and ablative etching for the fabrication of paper-based devices. J. Micromechanics Microengineering. 23 (6), (2013).
  48. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  49. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  50. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15 (7), 1677-1685 (2009).
  51. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regan. Med. , (2016).
  52. Howard, M. A., Baraban, S. C. Synaptic integration of transplanted interneuron progenitor cells into native cortical networks. J. Neurophysiol. 116 (2), 472-478 (2016).
  53. Wernig, M., Benninger, F., et al. Functional Integration of Embryonic Stem Cell-Derived Neurons In Vivo. J. Neurosci. 24 (22), 5258-5268 (2004).
  54. Ganguly, K., Poo, M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).
  55. Dancause, N. Extensive Cortical Rewiring after Brain Injury. J. Neurosci. 25 (44), 10167-10179 (2005).
  56. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  57. Adewole, D. O., Serruya, M. D., et al. The Evolution of Neuroprosthetic Interfaces. Crit. Rev. Biomed. Eng. 44 (1-2), 123-152 (2016).
  58. Cullen, D. K., Patel, A., Doorish, J. F., Smith, D. H., Pfister, B. J. Developing a tissue-engineered neural-electrical relay using encapsulated neuronal constructs on conducting polymer fibers. J. Neural Eng. 5 (4), 374-384 (2008).
  59. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  60. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5 (3), 333-341 (2008).
  61. Morrison, B. I., Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  62. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11 (6), 1155-1165 (2009).
  63. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35 (5), 835-846 (2007).
  64. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. , (2010).
  65. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain. Nat. Protoc. 10 (9), 1362-1373 (2015).

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