방법 논문

근육 조직이 직접 액체 질소에 몰입 할 때 이슈 결빙 멀티 홀 Cryovial 제거

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DOI:

10.3791/55616

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2017년 4월 6일

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1State Key Laboratory for Pig Genetic Improvement and Production Technology, Jiangxi Agricultural University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 액체 질소에 직접 급락으로 근육 조직을 동결하는 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 질소 가스의 "블랭킷 효과"를 방지 할 수있는 새로운 cryovial를 강조 할 때, 액체 질소 연락처 검체의 조직 표면.

초록

골격 근육의 생리에 대한 연구는 적절하게 명확하게 볼 세포질 구획으로 섹션을 얻기 위해 표본을 처리하는 기술적 과제에 직면 해있다. 또 다른 장애물은 주위 조직에 근섬유의 꽉 동격이다. 조직 고정 및 파라핀 매립 처리는 근섬유의 수축을 초래하기 때문에, 동결 절편을 위해 근육 조직 강화의 최적의 방법이다. 그러나, 일반적으로 발생하는 문제, 얼음 결정의 형성은, 때문에 근육의 높은 수분 함량의 동결 절편의 준비 기간 동안 발생합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 제 적절히 액체 질소에 침지하여 그 근육 조직을 동결하는 간단하고 효율적인 방법을 설명한다. 단독으로 액체 질소를 사용의 문제점은 다음 절연체로서 작용하고 조직의 냉각을 저해 조직에 질소 가스 배리어의 형성을 유발한다는 것이다. 하는 네브라스카이 "증기 담요 '효과를 방지하려면w cryovial은 조직 표면 주위의 액체 흐름 속도를 증가하기 위해 설계되었다. 이것은 병의 벽 (14 개)에 유입 구멍의 총 펀칭에 의해 달성 하였다. 버블 역학에 따르면, 작은 거품 적은 가능성의 액체 흐름의 결과의 높은 속도는 가스 배리어를 형성한다. 액체 질소가 유입 관통 구멍 cryovial로 유입되면, 조직 주변의 유속 가스 배리어를 제거하기에 충분히 빠르다. 미리 냉각 펜탄을 이용하여 근육 조직을 동결하는 방법에 비해,이 프로토콜은보다 간단하고 효율적이며 처리량하게 근육을 고정하기 위해 사용될 수있다. 또한,이 방법은 실온에서 가연성이 매우 이소 펜탄에 액세스 할 수없는 기관에 최적입니다.

서론

골격 근육은보기의 영양 및 처리 지점에서 고기를 생산하는 동물의 가장 중요한 구성 요소입니다. 근육 성장의 효율성과 결과 고기의 품질 : 육류 산업에서,이 개 특히 중요한 측면이있다. 근육의 주성분으로, 근육 섬유 성장 성능과 동물 1 신선한 고기의 품질에 직접적으로 관련이 있습니다. 예를 들어, 섬유의 총 수 (TNF)와 섬유의 단면적 (CSAF)은 주로 근육 질량과 고기의 품질을 결정; 또한, 섬유 유형 구성 (FTC)가 강하게 신선한 고기의 품질이 영향을 미칩니다. 따라서, 동물의 근육 섬유 특성의 조작은 코어 수익성 농장 1의 경쟁력을 높이기 위해 매우 효과적인 방법이다.

지금까지 여러 가지 고유 및 외부 요인은 근육 섬유 characterist를 조작 확인 된ICS 1. 이 조작은 돼지 5 소 3 미오 스타틴 유전자 양 4의 Callipyge 유전자 및 RYR1 IGF2 유전자와 같은 특정 유전자와 동물의 대상 선택을 통해 달성 될 수있다. 또한, 다이어트 제어 및 특정 호르몬 치료는 근육 섬유의 특성 (6)에 중요한 역할을한다. 따라서, 유전 및 영양 요소를 결합하는 방법은 살코기의 내용과 고기의 품질을 향상시킬 수 있습니다. 근육 섬유의 구조의 해명은 여전히 ​​도전이기 때문에, 근육 섬유에 대한 연구는 육류 산업에 제한됩니다.

근섬유 특성 등 미오신 triphosphatase 아데노신 (ATP 아제) 조직 화학 분석과 같은 방법을 사용하여 식별된다. 이 방법의 냉동 (6-8 μm의) 얇은 섹션에있는 효소는 사실에 의존근육 섬유는 화학적으로 특정 제품에 반응 할 수있다. 단, 근육의 수분 함량은 위치에 관계없이 (즉, 뒤, 복부 또는 뒷다리) (7), 돼지, 토끼, 마우스 및 인간의 75 % 이상이다. 이전에 8, 9를 설명한 바와 같이, 저온부의 준비 과정 - 유물을 동결 - 근육의 높은 수분 함량은 일반적으로 발생하는 문제가 발생합니다. 대부분의 경우, 적절하게 우리의 경험에 따르면, 도살장 생산 라인에서 근육 조직을 동결하는 것은 거의 불가능하다.

여기에 제시된 프로토콜은 높은 처리량 방식으로 냉동 절편을 위해 근육 조직을 동결하기 위해 실험실에서 사용 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 방법의 하이라이트는 액체 질소에 냉동 플래시 근육 조직 용으로 설계된 새로운 cryovial이다. 현재 워크 플로우 동시에 조직을 용이하게 할 수명확하게 표시 함과 세포질 주변 조직에 꽉 근섬유의 동격으로 우수한 근육 동결 절단 (Cryosections)에 대한 동결 처리. 액체 질소가 조직과 혼합되지 않기 때문에, 또한,이 프로토콜은 조직 분석 옵션의 다양한 배열에 적용될 수있다.

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프로토콜

현재의 방법은 확립 수확하고 실험실에서 조직 학적 염색법 1,000 근육 샘플들을 저장하는 검증되었다. 동물의 관리 및 사용과 관련된 모든 절차는 중국의 농업의 교육부에 의해 설립 된 지침을 따랐다.

샘플 수집 1. 장비

  1. 각 극저온 유리 병에 샘플 ID를 레이블.
    참고 : 극저온 병은 특별히 동결 절단 (Cryosections) 절차 (그림 1A)에 대한 신선한 조직 샘플을 동결하도록 설계되었습니다. 바이알 금형 공장 (도 1C)에 폴리 프로필렌으로 제조된다.
  2. 적절한 액체 질소 탱크에 액체 질소, 보안경 또는 안면 쉴드, 냉동기 장갑 10 개 cm 집게 25 개 cm 핀셋, 스티로폼 쿨러 (내부 치수 : 길이 20cm × 12 cm x 세로 135 cm 높이 아래의 장비를 구하는 ; 외형 치수 : 폭 X 15cm 상위 24 cm × 16 cm 길이), 플라스틱 필름 (폭 0.1 mm 두께 X 2.5 cm X 0.8 cm 길이)메스와 A4 PVC 바인딩 커버 (21cm X 29.5 cm) (도 1b).

근육 샘플의 제조 2

  1. 앞서 시료 채취의 액체 질소로 5 분 스티로폼 쿨러를 채운다.
    참고 : 액체 질소의 일부가 떨어져 종기와 신선한 샘플을 터치하면 가스로 전환하기 때문에 액체 질소의 큰 열이 필수적이다. 손실을 보충하기 위해 액체 질소의 전송의 빈도를 감소시키기 위해, 적절한 크기의 스티로폼 냉각기 샘플의 수에 따라 미리 획득해야한다.
  2. 검체가 획득되면, 부드럽게 A4 PVC 결합 덮개의 부분에 배치하고, 근육 섬유의 방향을 관찰한다.
    참고 : 여기, 우리는 돼지의 마지막 허리 뼈에 처음부터 등심의 도리스 근육의 단면을 사용했다. 시편은 약 12cm, 길이 8cm, 폭과 5cm 높다.
  3. 시편 난을 통해 두 개의 평행 한 절개를 만들기 위해 메스를 사용하여N 근육 섬유의 방향, 길이 약 3 cm 및 0.6 cm 이격. 약 0.6 cm x 세로 0.6 cm X 1.5 cm 높이 긴 사각형으로 절개 근육 낸다.
    주 : 근육 섬유의 단면적을 측정의 신뢰도는 주로 근육 절개의 섬유 배향에 의존한다.
  4. 부드럽게 막 (도 2A)의 긴 에지에 평행 한 절개 근육의 종축과, 플라스틱 필름의 조각에 시료를 넣어 10cm 집게를 사용한다.
    주 : 근육 섬유의 배향 인해 급속 동결을 시료에 균열을 방지하는 접착 기능을 고정하는 데 도움이 유지 기능 : 플라스틱 필름은 두 가지 기능을 갖는다.
  5. 집게를 사용하여, 단지 미소 구멍 사이 표지 저온 바이알의하면 중앙으로 근육 조직을 배치하고 단단히 바이알 (도 2B)를 모자.

3. 냉동 및 보관 근육 샘플에스

  1. 25cm 핀셋을 사용하여, 신속하게 액체 질소 (약 10-20 S)를 비등하지 않을 때까지 기다리고, 예비 냉각 스티로폼 쿨러에서 액체 질소의 전체 저온 바이알 잠수함.
    참고 : 액체 질소가 끓는 때 cryovial이 너무 신중하게 10 ~ 20 초 동안 끓는 액체 질소의 병을 담가 떠.
  2. 액체 질소 저장 탱크 또는 장기간 저장을 위해 -80 ° C에 냉동 근육 시료를 옮긴다.

4. 슬라이드 제조

  1. -20 ℃ 및 -22 ° C의 사이에 저온 유지 장치를 사전 냉각.
  2. 제거 이전 마이크로톰 블레이드 폐기의 저온 유지 장치에서 나이프 홀더 티롤 판을 닦아 저온 유지 장치에서 새 마이크로톰 블레이드를 설치하고, 8 μm의 절삭 두께를 설정.
  3. 액체 질소 저장 탱크로부터 저온 바이알에서 근육 샘플을 전송 또는 -80 ° C에 냉동 저온 유지 장치로, 액체 질소 나 드라이 아이스에 반송.
  4. 시료는 저온 유지 장치의 온도와 평형화 30 분을 기다린다.
    참고 : 높은 온도가 시편에서 얼음 결정의 형성을 일으킬 수 있기 때문에 표본을 만지지 수있는 장비는 사전 냉각해야합니다.
  5. 수용성 글리콜 및 수지 OCT ()의 최적 절단 온도 제제 하에서 시험편 홀더에 샘플을 탑재. 8 μm의 단면을 절단.
    주 : CSAF 근육 섬유의 단면적이기 때문에, 근육 섬유의 방향에 대해 수직으로 절단 각도를 조정한다.
  6. 방 온도하는 마이크로의 중심을 향해 절을 마운트합니다. 즉시 -80 ° C 냉장고에 슬라이드 상자에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 RT에서 건조하는 것을 허용하지 않습니다.

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결과

cryovial 그림 및 동결 절편의 준비 기간 동안 근육을 동결에 대한 일반적인 실험실 장비는 그림 1에 나타내었다. 크리오 바이알 (cryovial)는 금형 공장에서 폴리 프로필렌으로 만들어진다. 각 바이알은 입구 구멍 (14)의 총이있다 : 하나는 캡이고; 또 하단이고; 나머지 12 형태 4 개 개의 병렬 라인, 서로 90 °의 4 개 개의 구멍 각각. 이러한 흡입 구멍 때 "증기 블랭킷"효과를 액체 질소와 접촉 조직을 피하기 위해 조직을 다음 액체 질소의 유속을 빠르게 할 수있다. 따라서, 거의 얼음 결정은 냉동 샘플에서 형성한다. 중요한 것은, 이소 펜탄, 28 ° C에서 끓는점 매우 휘발성과 가연성 액체는이 절차에서 필요하지 않습니다.

더이 방법의 장점을 강조하기 위해, 우리는 등심의 dorsi...

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토론

여기서는 동결 근육 기능의 조직 학적 평가를 수행하는 근육 조직을 저장하는 새로운 다공 cryovial을 설명한다. 이 프로토콜의 핵심 변성 단계는 다공 cryovial의 샘플은 직접 액체 질소에 침지된다는 점이다. 우리의 지식에, 이것은 기존의 동결 방법 중 근육의 냉동 절편 우수한 냉동 샘플 (대표 결과를 참조)를 얻을 수있는 간단하고 rapidest 방법입니다.

근육 연구자들이 직면 한 기술적 과제는 얼음 결정이 절편을 위해 근육 조직을 강화하는 수단으로 동결 사용할 때 형성 할 가능성이 있다는 것입니다. 대표 결과에서 언급 한 바와 같이, 세 가지 요소는 적절한 차가운 소스를 선택하는 시료의 수분을 최소화하고 차가운 소스와 접촉 전체 표면의 비율을 증가 포함한 병리학 적 연구에 대한 적절한 근육 동결을 결정하는데 중요한 역할을한다. 먼저,동결의 비율은 절편의 냉동 조직의 준비 기간 동안 손상을 방지하는 것이 중요합니다. 동결이 느린 경우 큰 얼음 결정이 세포 외로 형성...

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공개 사항

관심 없음 충돌은 금융 또는 다른 저자에 의해 선언되지 않습니다.

감사의 글

이 프로젝트는 중국 국가 자연 과학 재단 (NSFC)에 의해 지원되었다 : 31301950 및 31671288입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
크라이오스탯 마이크로톰  라이카Leica CM1950
디지털 현미경 니콘니콘 DS-U3
  극저온 바이알    플라스틱 필름자체 설계
액체 질소Commomly 사용
메스Commomly - 사용
10cm 집게Commomly - 사용
25cm 핀셋Commomly 사용
안전 유리Commomly 사용
냉동 장갑일반적으로 사용됨

참고문헌

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