산탄 프로테오믹스 자세하게 특성화 LERLIC-MS / MS 및 글루타민 정량 아스파라긴 탈 아미드

요약

여기서 우리는 긴 길이의 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LERLIC-MS / MS)에있어서의 단계적인 프로토콜을 제시한다. 이 산탄 총 단백질 체학에 의한 글루타민과 아스파라긴 탈 아미드 화 이소 형의 첫 번째 시간 정량화 및 특성화를 위해 할 수있는 새로운 방법입니다.

초록

단백질 탈 아미드 화의 특성은 인간의 병리 및 기타 생화학 적 맥락에서이 단백질 번역 후 변형 (PTM)의 역할 (들) 및 잠재력을 해독하는 것이 필수적이다. 단백질 탈 아미드의 특성화를 수행하기 위해, 최근 글루타민 (Gln의) 아스파라긴 아스파라긴 (Asn) 이성체를 분리 할 수있는 신규 한 긴 길이의 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LERLIC-MS / MS) 법을 개발 매우 복잡한 생물학적 샘플 모델 화합물의 탈 아미드 화의 제품. LERLIC-MS / MS 따라서,이다, Gln의의 탈 아미드 화의 동위 효소의 분리 및 정량에 대한 첫 번째 샷건 프로테오믹스 (proteomics) 전략. 우리는 또한 여기에 설명 된 샘플 처리 프로토콜은 LERLIC-MS / MS에 의해 그 특성을 허용 숙신이 미드 중간을 안정화 것을, 참신로 보여줍니다. 이 비디오 문서에서와 같이 LERLIC-MS / MS의 응용 프로그램은 현재 알 수없는 해명하는 데 도움이 될 수 있습니다단백질 탈 아미드 화의 N 분자 배열. 또한 LERLIC-MS / MS는 별개의 생물학적 배경에서 탈 아미드를 포함 효소 반응의 추가적인 이해를 제공한다.

서론

탈 아미드는 단백질의 번역 후 변형 아스파라긴 아스파라긴 (Asn) 및 / 또는 글루타민 (Gln의) 잔류 물 ^(1)의 변형을 통해 단백질 골격에 음전하를 도입 (PTM)이다. ² : 1의 비율에서 Asn 잔기에 영향을 미치는 변형하면서 공통 3에서 이성질체 제품 isoaspartic 산 (isoAsp) 및 N -aspartic 산 (ASP)를 생성한다. 그럼에도 불구하고,이 비율은 수리 효소 메틸화 된 L-isoaspartyl (PIMT) ^{(3), (4)의} 조작에 의해 변경 될 수있다. 마찬가지로, Gln의 잔기의 탈 아미드 화는 기대 (1)의 이성체 감마 글루탐산 (γ-Glu가) 및 알파 글루탐산 아형 (α-가 Glu)를 생성한다 : 7 비율 ^{3,5-을하지만,이} 비율의 작용에 의해 이동 될 수있다 유비쿼터스 효소 트랜스 글 루타 미나 제 (2)와 다른 transglutaminases, 트랜스 글 루타 미나 제를 포함 하나, 전자뇌 ⁶ 세....

프로토콜

1. 긴 길이의 음이온 교환 포장 (LAX) 모세관 컬럼

(참고 : LAX 열에서 가정 우리가이 프로토콜에 설명으로 포장 LAX 열은 또한 상업적으로 이용 가능하다 할 수 있지만, 자세한 내용은 재료 및 시약의 표 참조).

1. 슬러리를 준비하기 위해 버퍼 (표 1) 포장의 3.5 mL의 약한 음이온 교환 포장재 50mg을 일시.
2. 암형 - 암 피팅하는 물미와 암형 나사를 사용하여 - 모세관 컬럼 (200㎛ 인 내부 직경 (ID) 튜브 50cm 길이)의 단부를 조립한다. 암형 - 암 피팅 내부 스크린 1/16 "OD 기공 크기 1 미크론의 위 (주 :. 여기서 사용 된 스크린으로부터 물질의 누출을 방지하기위한 포장 재료의 입경보다 작은 기공 크기를 가지고 있어야 기둥).
3. 4,500 psi에서 작동되는 고압 펌프를 사용하여 슬러리 모세관 팩. (참고 : 기둥, 트러스, 빔 팩포장재까지 백만 열의 항목)에서 볼 수 있습니다.
4. 지점 120에 기재된 바와 같이 캐 필러 리 컬럼의 타 단부를 조립한다.

2. 시료 준비

결과

Gln의과에서 Asn 잔류의 탈 아미드 화는 여러 만성 및 치명적 질병 ^(14)에 연루 퇴행성 단백질 수정 (DPM)로 간주됩니다. 이 PTM은 인체와 유사한 생물 학적 배경 ^{(1), (15)에} 항체와 다른 분자의 반감기 및 degradative 상태를 예측할 수 있음을 입증하고있다. 단백질 탈 아미드 화의 중요성은, 사실, 따라서이 수정 ^{16, 17} 및 일부 연구는 그림의 정확한 연대 측정을 수행 할 때 탈 아미드 화의 가능성을 증명하고 다양한 프로테옴에 존재하고 고고학 ^{18, 19을} 유지, 생물 의학 문맥을 넘어.......

토론

이 비디오 - 문서에서 우리는 LERLIC-MS / MS ^(3)의 단계별 프로토콜을 제시하는 방법은 심층 특성화를 수행하고 정확하게 단백질의 탈 아미드 화,이 단백질 변형에 관여하는 효소 처리의 정도를 결정한다. LERLIC-MS / MS는 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 (ERLIC) ^(27)의 원리 하에서 긴 길이 (50cm) LAX의 사용에 기초한다. 연구 ^3에 도시 된 바와 같이, 긴 길이의 컬럼의 사용은 그들의 등전점에 따라 분리 된 ²⁷ 펩티드 ERLIC의 가능성을 최대화한다.

LERLIC-MS / MS는 새로운 산탄 일차원 분리 전략 복잡한 프로테옴에 최적의 결과를 얻기 위해 ^3에 나타낸 바와 같이이 1,200 분 구배 필요하지만 시.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PolyCAT 3 및 마이크로; m 100-Å (벌크 재료)	폴리엘씨 주식회사	특별 주문
: 긴 길이 이온 교환 모세관 컬럼 50cm - 200 & 마이크로; 엠아이디	PolyLC Inc.	특별 주문
PEEKsil 튜빙 1/16" OD x 200 &마이크로; m ID x 50cm 길이	Trajan Scientific Australia의 SGE 분석 과학	620050
1/16" OD 튜빙용 암-암 피팅	Upchurch Scientific	UPCHF-125
미세페룰용 암나사	Upchurch Scientific	UPCHP-416
미세페룰	Upchurch Scientific	UPCHF-132
압력 폭탄 NanoBaume	Western Fluids Engineering	SP-400
Shimadzu Prominence UFLC 시스템	Shimadzu	Prominence UFLC
불릿 블렌더	Next Advance	BBX24
Safe-lock 튜브	Eppendorf	T9661-1000EA
스테인레스 스틸 비즈. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. 비멸균.	다음 Advance	SSB14B
탁상용 원심분리기	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R
표준 디지털 가열 순환 욕조, 120VAC	PolyScience 8006 6L	8006A11B
Sep-pack c18 탈염 카트리지 50 mg	Waters	WAT020805
Vacumm 집중	Eppendorf	농축기 플러스 시스템
Dionex UltiMate 3000 UHPLC	다이오넥스	UltiMate 3000 UHPLC
Orbitrap Elite 질량분석기	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo Captive스프레이	주식회사 Michrom-Bruker	TCSI-SS2
인큐베이터 INCUCELL	MMM Group	INCUCELL111
염기서열분석 등급 변형 트립신	Promega	V5111
프로테아제 억제제 칵테일 정제	Roche	11836170001(ROCHE)
인산염 완충 용액 10x(1x로 희석)	Sigma-Aldrich	P5493
암모늄 아세테이트	Sigma-Aldrich	A1542
소듐 데옥시콜레이트	시그마-알드리치	D6750
디티오트레이톨	시그마-알드리치	D0632
요오도아세트아미드	시그마-알드리치	i6125
포름산	시그마-알드리치	F0507 (허니웰)
수산화암모늄	시그마-알드리치	338818 (허니웰)
아세토니트릴 HPLC 등급	시그마-알드리치	675415
이소프로판올 HPLC 등급	시그마-알드리치	675431
물 HPLC 등급	시그마-알드리치	14263

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