Method Article

산탄 프로테오믹스 자세하게 특성화 LERLIC-MS / MS 및 글루타민 정량 아스파라긴 탈 아미드

DOI:

10.3791/55626

⸱

April 9th, 2017

 ,  , 
1Division of Structural Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University

In This Article

Summary

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여기서 우리는 긴 길이의 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LERLIC-MS / MS)에있어서의 단계적인 프로토콜을 제시한다. 이 산탄 총 단백질 체학에 의한 글루타민과 아스파라긴 탈 아미드 화 이소 형의 첫 번째 시간 정량화 및 특성화를 위해 할 수있는 새로운 방법입니다.

Abstract

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단백질 탈 아미드 화의 특성은 인간의 병리 및 기타 생화학 적 맥락에서이 단백질 번역 후 변형 (PTM)의 역할 (들) 및 잠재력을 해독하는 것이 필수적이다. 단백질 탈 아미드의 특성화를 수행하기 위해, 최근 글루타민 (Gln의) 아스파라긴 아스파라긴 (Asn) 이성체를 분리 할 수있는 신규 한 긴 길이의 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LERLIC-MS / MS) 법을 개발 매우 복잡한 생물학적 샘플 모델 화합물의 탈 아미드 화의 제품. LERLIC-MS / MS 따라서,이다, Gln의의 탈 아미드 화의 동위 효소의 분리 및 정량에 대한 첫 번째 샷건 프로테오믹스 (proteomics) 전략. 우리는 또한 여기에 설명 된 샘플 처리 프로토콜은 LERLIC-MS / MS에 의해 그 특성을 허용 숙신이 미드 중간을 안정화 것을, 참신로 보여줍니다. 이 비디오 문서에서와 같이 LERLIC-MS / MS의 응용 프로그램은 현재 알 수없는 해명하는 데 도움이 될 수 있습니다단백질 탈 아미드 화의 N 분자 배열. 또한 LERLIC-MS / MS는 별개의 생물학적 배경에서 탈 아미드를 포함 효소 반응의 추가적인 이해를 제공한다.

Introduction

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탈 아미드는 단백질의 번역 후 변형 아스파라긴 아스파라긴 (Asn) 및 / 또는 글루타민 (Gln의) 잔류 물 (1)의 변형을 통해 단백질 골격에 음전하를 도입 (PTM)이다. 2 : 1의 비율에서 Asn 잔기에 영향을 미치는 변형하면서 공통 3에서 이성질체 제품 isoaspartic 산 (isoAsp) 및 N -aspartic 산 (ASP)를 생성한다. 그럼에도 불구하고,이 비율은 수리 효소 메틸화 된 L-isoaspartyl (PIMT) (3), (4)의 조작에 의해 변경 될 수있다. 마찬가지로, Gln의 잔기의 탈 아미드 화는 기대 (1)의 이성체 감마 글루탐산 (γ-Glu가) 및 알파 글루탐산 아형 (α-가 Glu)를 생성한다 : 7 비율 3,5-을하지만,이 비율의 작용에 의해 이동 될 수있다 유비쿼터스 효소 트랜스 글 루타 미나 제 (2)와 다른 transglutaminases, 트랜스 글 루타 미나 제를 포함 하나, 전자뇌 6 세....

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Protocol

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1. 긴 길이의 음이온 교환 포장 (LAX) 모세관 컬럼

(참고 : LAX 열에서 가정 우리가이 프로토콜에 설명으로 포장 LAX 열은 또한 상업적으로 이용 가능하다 할 수 있지만, 자세한 내용은 재료 및 시약의 표 참조).

  1. 슬러리를 준비하기 위해 버퍼 (표 1) 포장의 3.5 mL의 약한 음이온 교환 포장재 50mg을 일시.
  2. 암형 - 암 피팅하는 물미와 암형 나사를 사용하여 - 모세관 컬럼 (200㎛ 인 내부 직경 (ID) 튜브 50cm 길이)의 단부를 조립한다. 암형 - 암 피팅 내부 스크린 1/16 "OD 기공 크기 1 미크론의 위 (주 :. 여기서 사용 된 스크린으로부터 물질의 누출을 방지하기위한 포장 재료의 입경보다 작은 기공 크기를 가지고 있어야 기둥).
  3. 4,500 psi에서 작동되는 고압 펌프를 사용하여 슬러리 모세관 팩. (참고 : 기둥, 트러스, 빔 팩포장재까지 백만 열의 항목)에서 볼 수 있습니다.
  4. 지점 120에 기재된 바와 같이 캐 필러 리 컬럼의 타 단부를 조립한다.

2. 시료 준비

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Results

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Gln의과에서 Asn 잔류의 탈 아미드 화는 여러 만성 및 치명적 질병 (14)에 연루 퇴행성 단백질 수정 (DPM)로 간주됩니다. 이 PTM은 인체와 유사한 생물 학적 배경 (1), (15)에 항체와 다른 분자의 반감기 및 degradative 상태를 예측할 수 있음을 입증하고있다. 단백질 탈 아미드 화의 중요성은, 사실, 따라서이 수정 16, 17 및 일부 연구는 그림의 정확한 연대 측정을 수행 할 때 탈 아미드 화의 가능성을 증명하고 다양한 프로테옴에 존재하고 고고학 18, 19을 유지, 생물 의학 문맥을 넘어.......

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Discussion

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이 비디오 - 문서에서 우리는 LERLIC-MS / MS (3)의 단계별 프로토콜을 제시하는 방법은 심층 특성화를 수행하고 정확하게 단백질의 탈 아미드 화,이 단백질 변형에 관여하는 효소 처리의 정도를 결정한다. LERLIC-MS / MS는 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 (ERLIC) (27)의 원리 하에서 긴 길이 (50cm) LAX의 사용에 기초한다. 연구 3에 도시 된 바와 같이, 긴 길이의 컬럼의 사용은 그들의 등전점에 따라 분리 된 27 펩티드 ERLIC의 가능성을 최대화한다.

LERLIC-MS / MS는 새로운 산탄 일차원 분리 전략 복잡한 프로테옴에 최적의 결과를 얻기 위해 3에 나타낸 바와 같이이 1,200 분 구배 필요하지만 시.......

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Disclosures

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저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgements

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싱가포르 (NMRC이-OF-IRG-0003-2016) 및 NTU-NHG는 연구비 노화의 국립 의료 연구위원회 (:이 작품은 부분적으로 싱가포르 교육부 (부여 ARC9 / 15 등급 2)에서 보조금에 의해 지원되었다 그랜트 ARG / 14,017). 우리는 친절이 연구 가능 포장재을 우리에게 제공 박사 앤드류 알퍼트와 PolyLC 팀에 대한 우리의 감사와 가장 진심으로 감사의 말씀을드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PolyCAT 3 및 마이크로; m 100-Å (벌크 재료)폴리엘씨 주식회사특별 주문
: 긴 길이 이온 교환 모세관 컬럼 50cm - 200 & 마이크로; 엠아이디PolyLC Inc.특별 주문
PEEKsil 튜빙 1/16" OD x 200 &마이크로; m ID x 50cm 길이Trajan Scientific Australia의 SGE 분석 과학 620050
1/16" OD 튜빙용 암-암 피팅Upchurch ScientificUPCHF-125
미세페룰용 암나사Upchurch ScientificUPCHP-416
미세페룰Upchurch ScientificUPCHF-132
압력 폭탄 NanoBaumeWestern Fluids EngineeringSP-400
Shimadzu Prominence UFLC 시스템ShimadzuProminence UFLC
불릿 블렌더Next AdvanceBBX24
Safe-lock 튜브Eppendorf T9661-1000EA
스테인레스 스틸 비즈. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. 비멸균.다음 AdvanceSSB14B
탁상용 원심분리기 Hettich ZentrifugenRotina 380 R
표준 디지털 가열 순환 욕조, 120VACPolyScience 8006 6L8006A11B
Sep-pack c18 탈염 카트리지 50 mgWatersWAT020805
Vacumm 집중Eppendorf 농축기 플러스 시스템
Dionex UltiMate 3000 UHPLC 다이오넥스UltiMate 3000 UHPLC 
Orbitrap Elite 질량분석기Thermo Fisher Scientific Inc.ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo Captive스프레이 주식회사 Michrom-BrukerTCSI-SS2
인큐베이터 INCUCELL MMM GroupINCUCELL111
염기서열분석 등급 변형 트립신PromegaV5111
프로테아제 억제제 칵테일 정제Roche11836170001(ROCHE)
인산염 완충 용액 10x(1x로 희석)Sigma-AldrichP5493
암모늄 아세테이트Sigma-AldrichA1542
소듐 데옥시콜레이트시그마-알드리치D6750
디티오트레이톨시그마-알드리치D0632
요오도아세트아미드시그마-알드리치i6125
포름산시그마-알드리치F0507 (허니웰)
수산화암모늄시그마-알드리치338818 (허니웰)
아세토니트릴 HPLC 등급시그마-알드리치675415
이소프로판올 HPLC 등급시그마-알드리치675431
물 HPLC 등급시그마-알드리치14263
장치

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
  2. Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomeri....

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LERLIC MS MSGlutamine DeamidationAsparagine DeamidationShotgun ProteomicsProtein DeamidationSuccinimide IntermediateAnion Exchange ChromatographyPeptide SeparationProteome AnalysisPosttranslational Modification

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