Method Article

산탄 프로테오믹스 자세하게 특성화 LERLIC-MS / MS 및 글루타민 정량 아스파라긴 탈 아미드

DOI:

10.3791/55626

⸱

April 9th, 2017

 ,  , 
1Division of Structural Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서 우리는 긴 길이의 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LERLIC-MS / MS)에있어서의 단계적인 프로토콜을 제시한다. 이 산탄 총 단백질 체학에 의한 글루타민과 아스파라긴 탈 아미드 화 이소 형의 첫 번째 시간 정량화 및 특성화를 위해 할 수있는 새로운 방법입니다.

Abstract

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단백질 탈 아미드 화의 특성은 인간의 병리 및 기타 생화학 적 맥락에서이 단백질 번역 후 변형 (PTM)의 역할 (들) 및 잠재력을 해독하는 것이 필수적이다. 단백질 탈 아미드의 특성화를 수행하기 위해, 최근 글루타민 (Gln의) 아스파라긴 아스파라긴 (Asn) 이성체를 분리 할 수있는 신규 한 긴 길이의 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LERLIC-MS / MS) 법을 개발 매우 복잡한 생물학적 샘플 모델 화합물의 탈 아미드 화의 제품. LERLIC-MS / MS 따라서,이다, Gln의의 탈 아미드 화의 동위 효소의 분리 및 정량에 대한 첫 번째 샷건 프로테오믹스 (proteomics) 전략. 우리는 또한 여기에 설명 된 샘플 처리 프로토콜은 LERLIC-MS / MS에 의해 그 특성을 허용 숙신이 미드 중간을 안정화 것을, 참신로 보여줍니다. 이 비디오 문서에서와 같이 LERLIC-MS / MS의 응용 프로그램은 현재 알 수없는 해명하는 데 도움이 될 수 있습니다단백질 탈 아미드 화의 N 분자 배열. 또한 LERLIC-MS / MS는 별개의 생물학적 배경에서 탈 아미드를 포함 효소 반응의 추가적인 이해를 제공한다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

탈 아미드는 단백질의 번역 후 변형 아스파라긴 아스파라긴 (Asn) 및 / 또는 글루타민 (Gln의) 잔류 물 (1)의 변형을 통해 단백질 골격에 음전하를 도입 (PTM)이다. 2 : 1의 비율에서 Asn 잔기에 영향을 미치는 변형하면서 공통 3에서 이성질체 제품 isoaspartic 산 (isoAsp) 및 N -aspartic 산 (ASP)를 생성한다. 그럼에도 불구하고,이 비율은 수리 효소 메틸화 된 L-isoaspartyl (PIMT) (3), (4)의 조작에 의해 변경 될 수있다. 마찬가지로, Gln의 잔기의 탈 아미드 화는 기대 (1)의 이성체 감마 글루탐산 (γ-Glu가) 및 알파 글루탐산 아형 (α-가 Glu)를 생성한다 : 7 비율 3,5-을하지만,이 비율의 작용에 의해 이동 될 수있다 유비쿼터스 효소 트랜스 글 루타 미나 제 (2)와 다른 transglutaminases, 트랜스 글 루타 미나 제를 포함 하나, 전자뇌 6 세포 외 소포와 관련된으로 nzyme 최근 확인했다.

탈 아미드의 원점 (여러 만성 더욱 Gln의의 transamidation의 내용과 그 의미 3 참조 전자는 transglutaminases 다른 효소 transamidation 통해 인터 / 분자 내 가교 결합을 매개하는 Gln의 잔기에 특히 일반적이고, 자발적 또는 효소 중 하나 일 수 있고 치명적인 인간의 질병). 따라서, 탈 아미드가 영향 분자 4, 7, 8의 중요한 구조에 파급 및 기능을 갖고, 9 노화의 서비스를 분자 시계 등의 다양한 생화학 적 결과에 비추어 심층 화학적 특성 (3)을 필요로하는 PTM은 .

의 ASN 잔류의 탈 아미드 화는되어 있지만 비교적 상향식 샷건 프로테오믹스가 잘 특성화 1, 10, Gln의 잔기의 탈 아미드 여전히 전자 계 라디칼 분열 (11)에 의한 모델 화합물의 도전 분석 이후 적절한 특성화 방법이 없다. 최근 하나의 분석에서 복잡한 생물학적 샘플과 모델 화합물로부터 탈 아미드가 Asn 및 Gln의 이성체의 분리를 가능하게하는 신규 한 측정 샷건 프로테오믹스 전략 (LERLIC-MS / MS) (3)을 개발 하였다. LERLIC-MS / MS는 긴 길이 (50cm) 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 (ERLIC) 모드에서 작동 이온 교환 컬럼 (LAX)를 사용 트립신 분해 펩티드의 분리에 기초하여 탠덤 질량 분석법에 결합된다 (LC- MS / MS). 이 새로운 분석 전략의 특성과 상대적으로 인간의 뇌 조직에서 각 탈 아미드 잔류의 정도를 정량하는 데 사용되었습니다F "> 3. 그럼에도 불구하고, 여기에 설명 된 프로토콜은 관심의 생화학 적 맥락에서 단백질 탈 아미드 화의 특수성을 연구하는 것을 목표로 LERLIC-MS / MS의 비디오 영상을 제공 할 것입니다.

윤리 선언문

이 프로토콜의 모든 절차는 싱가포르의 난양 기술 대학의 제도적 검토위원회에 의해 승인되었습니다 및 제도적 지침에 따라 수행되고있다.

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Protocol

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1. 긴 길이의 음이온 교환 포장 (LAX) 모세관 컬럼

(참고 : LAX 열에서 가정 우리가이 프로토콜에 설명으로 포장 LAX 열은 또한 상업적으로 이용 가능하다 할 수 있지만, 자세한 내용은 재료 및 시약의 표 참조).

  1. 슬러리를 준비하기 위해 버퍼 (표 1) 포장의 3.5 mL의 약한 음이온 교환 포장재 50mg을 일시.
  2. 암형 - 암 피팅하는 물미와 암형 나사를 사용하여 - 모세관 컬럼 (200㎛ 인 내부 직경 (ID) 튜브 50cm 길이)의 단부를 조립한다. 암형 - 암 피팅 내부 스크린 1/16 "OD 기공 크기 1 미크론의 위 (주 :. 여기서 사용 된 스크린으로부터 물질의 누출을 방지하기위한 포장 재료의 입경보다 작은 기공 크기를 가지고 있어야 기둥).
  3. 4,500 psi에서 작동되는 고압 펌프를 사용하여 슬러리 모세관 팩. (참고 : 기둥, 트러스, 빔 팩포장재까지 백만 열의 항목)에서 볼 수 있습니다.
  4. 지점 120에 기재된 바와 같이 캐 필러 리 컬럼의 타 단부를 조립한다.

2. 시료 준비

이 프로토콜은 모델 프로테옴 인간 뇌 조직을 분석 LERLIC-MS / MS의 응용 프로그램을 설명합니다. (주의 : 다른 조직 또는 프로테오믹스 샘플을 사용하는 경우, 샘플 준비 과정이 채택되어야한다.)

  1. 조직의 균질화 :
    에이. 회 5 분 동안 1X 인산 완충 용액으로 세척 뇌 조직 (50 내지 100 mg).
    비. 1 : 1의 조직 균질화 2.5 조직 / 금속 비즈 / SDC 균질화 완충액 (표 2) 비율 (w / W / V) 조직 균질화기를 사용하여 최대 강도 안전 잠금 튜브에서 39 ° C에서 5 분. (참고 : SDC 균질화 버퍼, 프로테아제 저해제를 포함 할 수있다 (3) 이전에 표시된)
    기음. 아프로 얻어진 조직 파쇄 액을 원심 분리10,000 × g에서 10 분간 4 ℃에서 이전의 단계를, M, 및 1.5 mL의 새 튜브로 상청액을 수집한다.
    디. 나머지 펠렛 BC 단계를 반복하고 더 펠릿이 관찰되지 않을 때까지 필요에 따라 여러 번 상층 액을 결합한다. (참고 :이 2 배 이상 기원전 단계를 반복해야하는 경우, 원심 분리 단계에서 샘플의 손실을 방지하기 위해 새로운 안전 잠금 튜브에 샘플과 구슬을 이동).
    이자형. Bicinchoninic 산성 분석 (BCA) 12에 의해 얻어진 균질 액의 단백질 농도를 정량화.
  2. 나트륨 데 옥시 콜레이트 (SDC)는 뇌 균질의에서-솔루션 트립신 소화 13 -assisted.
    에이. 단백질 디설파이드 결합의 환원을 개시 얻어진 파쇄 액에 (표 3 용액 5에 나타낸 원액을 사용) 10 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT)의 최종 농도를 추가한다.
    비. 욕조에서 30 분 동안 균질을 품어60 ℃에서 예비가 세트.
    기음. 균질 표 4 용액 7에 나타낸 원액을 사용하는 20 mM의 요오도 아세트 아미드 (IAA)의 최종 농도를 추가한다.
    디. 45 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 IAA 함유 균질 인큐베이션.
    이자형. 뇌 균질 희석액을 사용하여 두 - 겹 (표 3 용액 6) 희석.
    에프. 37 ° C에서 30 분 동안 제 2 감속 단계 동안 시료를 인큐베이션.
    지. (w / w)의 단백질을 효소 비 1:50 표 2의 2 액에 용해 시퀀싱 등급 변성 트립신 추가.
    시간. 30 ℃에서 밤새 배양하여 트립신 균질 다이제스트.
    나는. 포름산 (FA)의 0.5 % 최종 농도 첨가하여 다음날 효소 소화 담금질. (참고 : FA의 첨가가 산성 조건 하에서 SDC 염의 침전을 야기한다.)
    J. 부드럽게 SDC의 precipi를 함유하는 샘플을 와동tates.
    케이. 12,000 × g에서 10 분 동안 4 ℃에서 샘플을 원심 분리하여 SDC 염을 펠렛.
    엘. 상층 액을 수집하고 깨끗한 새 튜브에 액체를 전송합니다. (참고 : SDC 펠릿에서 염을 다시 중단하지 않습니다이 단계의 피펫 팅시주의 및 / 또는 수집합니다.)
    엠. 1 분 동안 격렬하게 볼 텍싱하에 SDC 다시 용해 완충액 (표 5)의 SDC 펠렛을 재용.
    엔. 단계를 반복 두 번 침전 된 펩티드를 복구하고 상층 액을 결합하는 JL. (참고 :. 참조 세라 등에 대한 자세한 내용은 2016 (13)을 트립신 소화 프로토콜이 여기 적응에-솔루션 SDC-지원.)
  3. 트립신의 탈염 샘플을 소화.
    에이. 1g C-18 카트리지를 사용한 시료의 탈염 소화를 수행한다. (참고 : 큰 부피 카트리지 (5 ㎖ 사용)을 독립적으로 얻어진 단백질 보장 샘플에 남아 SDC 염의 적절한 세척 량의 사전LC-MS / MS로 주입).
    비. 아세토 니트릴 5 ㎖ (ACN)와 1g C-18 카트리지의 조절을 수행한다.
    기음. 남아있는 유기 용매를 제거하기 위해 조절 1g C-18 카트리지로 정리 완충액 (표 6) 5 mL를 통과한다.
    디. 1g C-18 카트리지 샘플로드.
    이자형. 정리 완충액 5 mL의 각 단계를 이용하여 1g C-18 칼럼에서 시료 5에 정리 단계 - 3을 수행한다.
    에프. 용출 완충액 5 ㎖ (표 7)를 이용하여 1g C-18 카트리지에서 탈염 펩티드를 용출시켰다.
    지. 진공 농축기에서 용출 된 펩타이드 건조.
    기음. 용출 완충액 200 μL의 최종 부피로 건조 된 샘플을 재구성한다. (주 :. 사용 (격렬한 길이> 30 분 동안 초음파 욕 후속 초음파이어서 10 분) 텍싱 완전히 다시 일시 주사 버퍼 건조 된 펩티드)
    디. 아나 LERLIC-MS / MS에 대한 샘플의 주입량을 조절μg의 단백질 1~3 사이를 lyze.

3. 한 차원 LERLIC-MS / MS 분리

  1. 액체 크로마토 그래피 조건 :
    모바일 단계 :
    A : 물, 0.1 % FA (표 8).
    B : 0.1 % ACN FA에서 (표 9)
    유속 : 0.4 μL / 분
    칼럼 : LAX 모세관 컬럼 (50cm 길이 - 200 ㎛의 ID)
    에이. 45 분 동안 3 % B - 434 분 동안 85 % B, 85 - - 522 분 동안 70 % B 70 - 124 분 동안 35 % B, 35 40 분 95 95 % B : 다음 1,200 분 구배 사용 5 분 동안 3 % B, (3)에서 등용 - 7 분에 걸쳐 95 % B 및 23 분 동안 95 % B로 등용 매 있었다.
    비. 세라 및 Gallart-팔라우 외에 나타낸 바와 같이 LAX 모세관을 사용하여 펩티드의 분리를 수행한다. 3 초, 고압 액체 크로마토 그래피.
  2. 질량 분석기 구성 :
    에이. 데이터 수집 교류 betwe을 수행하기 위해 스캔 이벤트 세부 구성EN 전체 푸리에 변환 질량 분석 (FT-MS) 및 푸리에 변환 - 탠덤 질량 분광법 (FT-MS / MS)를 다음 매개 변수 :
    A.1. 데이터 수집 모드 : 긍정적
    FT-MS 매개 변수 A.2 :
    질량 범위 : 350 - 2,000m / z
    해상도 : 60,000
    Microscans : 스펙트럼 당
    자동 이득 제어 : 1 × 10 (6)
    FT-MS / MS 매개 변수 A.3 :
    분할 모드 : 고 에너지 충돌하는 해리 (HCD)
    A.4 질량 범위 : 150 - 2,000m / z
    A.5 해상도 : 30,000
    A.6 상위 N 이온 : 10
    Microscans : 스펙트럼 당
    상태를 충전> 2 +
    절연 폭 : 2 다
    A.7 자동 이득 제어 : 1 × 10 (6)
    비. 1.5 kV로에서 작업 nanoelectrospray 이온 소스를 구비 한 orbitrap 질량 분광계를 사용하여 3에 나타낸 바와 같이, 펩티드의 질량 분석 검출을 수행.

4. 데이터 분석

  1. 보호 자전거를 수행LERLIC-MS / MS에 대한 데이터베이스 검색에서 특정 프로 테오 믹 소프트웨어를 사용하여 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 데이터를 얻을 : (참고 : 자세한 내용은 3을 참조하십시오.)
    에이. 이온 허용 오차 : 10 PPM
    비. 조각 이온 허용 오차 : 0.05 다
    기음. 거짓 검색 속도 (FDR) : 1 %
    디. 데이터베이스 : UniProt 인간 데이터베이스
    이자형. 고정 수정 : 시스테인에서 Carbamydomethylation
    에프. 변수 수정 (소프트웨어에 의해 필요한 경우) : 산화 (메트로), 탈 아미드 화 (가 Asn 및 Gln의).
  2. 자신감 특성화 및 LERLIC-MS / MS 데이터의 이성체 탈 아미드 제품의 정량화 :
    에이. 분석을위한 spreedsheet 소프트웨어 LERLIC-MS / MS에서 내보내기 데이터베이스 검색 결과.
    비. 찾기 및 탈 아미드 펩티드와 그 이외의 탈 아미드 대응의 전체 목록을 추출합니다.
    기음. 참고로 얻어진 펩타이드의 목록을 이용하여 질량 공차 5ppm의 appropiate에서 소프트웨어를 사용하여 이러한 펩티드의 이온 크로마토 그램 (XICs)를 추출한다. (노트:XICs의 추출에 사용되는 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 3을 참조하십시오.)
    디. 시각 3 바와 같이 이성질체 생성물의 분리 된 이중 피크 용출 식별 수득 XICs 검사. (참고 : 쉽게 데이터베이스 검색 결과에 서로 다른 두 체류 시간의 존재에 의해 유도 찾을 수 MS / MS 레벨에서 식별 된 것과 펩티드 이성질체 제품).
    이자형. 각 사이트 탈 아미드 / 펩타이드의 이성체 제품의 상대적 정량 얻어진 XICs 각 식별 체의 피크 면적에 기초하여 수행되어야한다.

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Results

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Gln의과에서 Asn 잔류의 탈 아미드 화는 여러 만성 및 치명적 질병 (14)에 연루 퇴행성 단백질 수정 (DPM)로 간주됩니다. 이 PTM은 인체와 유사한 생물 학적 배경 (1), (15)에 항체와 다른 분자의 반감기 및 degradative 상태를 예측할 수 있음을 입증하고있다. 단백질 탈 아미드 화의 중요성은, 사실, 따라서이 수정 16, 17 및 일부 연구는 그림의 정확한 연대 측정을 수행 할 때 탈 아미드 화의 가능성을 증명하고 다양한 프로테옴에 존재하고 고고학 18, 19을 유지, 생물 의학 문맥을 넘어...

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Discussion

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이 비디오 - 문서에서 우리는 LERLIC-MS / MS (3)의 단계별 프로토콜을 제시하는 방법은 심층 특성화를 수행하고 정확하게 단백질의 탈 아미드 화,이 단백질 변형에 관여하는 효소 처리의 정도를 결정한다. LERLIC-MS / MS는 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 (ERLIC) (27)의 원리 하에서 긴 길이 (50cm) LAX의 사용에 기초한다. 연구 3에 도시 된 바와 같이, 긴 길이의 컬럼의 사용은 그들의 등전점에 따라 분리 된 27 펩티드 ERLIC의 가능성을 최대화한다.

LERLIC-MS / MS는 새로운 산탄 일차원 분리 전략 복잡한 프로테옴에 최적의 결과를 얻기 위해 3에 나타낸 바와 같이이 1,200 분 구배 필요하지만 시...

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Disclosures

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저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

싱가포르 (NMRC이-OF-IRG-0003-2016) 및 NTU-NHG는 연구비 노화의 국립 의료 연구위원회 (:이 작품은 부분적으로 싱가포르 교육부 (부여 ARC9 / 15 등급 2)에서 보조금에 의해 지원되었다 그랜트 ARG / 14,017). 우리는 친절이 연구 가능 포장재을 우리에게 제공 박사 앤드류 알퍼트와 PolyLC 팀에 대한 우리의 감사와 가장 진심으로 감사의 말씀을드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PolyCAT 3 및 마이크로; m 100-Å (벌크 재료)폴리엘씨 주식회사특별 주문
: 긴 길이 이온 교환 모세관 컬럼 50cm - 200 & 마이크로; 엠아이디PolyLC Inc.특별 주문
PEEKsil 튜빙 1/16" OD x 200 &마이크로; m ID x 50cm 길이Trajan Scientific Australia의 SGE 분석 과학 620050
1/16" OD 튜빙용 암-암 피팅Upchurch ScientificUPCHF-125
미세페룰용 암나사Upchurch ScientificUPCHP-416
미세페룰Upchurch ScientificUPCHF-132
압력 폭탄 NanoBaumeWestern Fluids EngineeringSP-400
Shimadzu Prominence UFLC 시스템ShimadzuProminence UFLC
불릿 블렌더Next AdvanceBBX24
Safe-lock 튜브Eppendorf T9661-1000EA
스테인레스 스틸 비즈. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. 비멸균.다음 AdvanceSSB14B
탁상용 원심분리기 Hettich ZentrifugenRotina 380 R
표준 디지털 가열 순환 욕조, 120VACPolyScience 8006 6L8006A11B
Sep-pack c18 탈염 카트리지 50 mgWatersWAT020805
Vacumm 집중Eppendorf 농축기 플러스 시스템
Dionex UltiMate 3000 UHPLC 다이오넥스UltiMate 3000 UHPLC 
Orbitrap Elite 질량분석기Thermo Fisher Scientific Inc.ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo Captive스프레이 주식회사 Michrom-BrukerTCSI-SS2
인큐베이터 INCUCELL MMM GroupINCUCELL111
염기서열분석 등급 변형 트립신PromegaV5111
프로테아제 억제제 칵테일 정제Roche11836170001(ROCHE)
인산염 완충 용액 10x(1x로 희석)Sigma-AldrichP5493
암모늄 아세테이트Sigma-AldrichA1542
소듐 데옥시콜레이트시그마-알드리치D6750
디티오트레이톨시그마-알드리치D0632
요오도아세트아미드시그마-알드리치i6125
포름산시그마-알드리치F0507 (허니웰)
수산화암모늄시그마-알드리치338818 (허니웰)
아세토니트릴 HPLC 등급시그마-알드리치675415
이소프로판올 HPLC 등급시그마-알드리치675431
물 HPLC 등급시그마-알드리치14263
장치

References

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