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방법 논문

단백질 분석을위한 Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays

9.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55638

⸱

2017년 6월 21일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physical Chemical Biology, Center for Biological Research (CIB-CSIC), Spanish National Research Council (CSIC), 2Department of Immunology, Complutense University School of Medicine, 3Abvance Biotech srl

이 논문에서

요약

프로토콜은 tRNA (UUU)의 생산 및 효소 TcdA와 복합체로 된 tRNA (UUU)의 분석을 아가로 오스 겔 지연 분석법을 통해 제시합니다.

초록

우리는 Escherichia coli 에서 tRNA (UUU)의 발현과 정제를위한 방법과 tRNA (UUU)와 N6- threonylcarbamoyladenosine (t6 A) 탈수 효소 인 TcdA의 결합에 대한 겔 지연 분석에 의한 분석을 시연한다. threonylcarbamoyl cyclic t6 A (ct6 A)에 tRNA의 anticodon stem loop (ASL)에서 A37에 부착 된 측쇄. tRNA (UUU)를 암호화하는 합성 유전자의 전사는 1 ​​mM 이소 프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 갖는 대장균 에서 유도되고 tRNA를 함유하는 세포는 유도 후 24 시간에 수확된다. RNA 분획은 산성 페놀 추출법을 사용하여 정제한다. 순수한 tRNA는 소형 tRNA 분자를 더 큰 손상되지 않은 핵산 또는 조각난 핵산에서 효율적으로 분리하는 겔 여과 크로마토 그래피에 의해 얻어집니다. tRNA (UUU)에 대한 TcdA 결합을 분석하기 위해 TcdA를 tRNA (UUU)와 혼합하고 4 ℃에서 천연 아가 로스 겔로 분리한다.TcdA-tRNA (UUU) 복합체는 젤의 염색시 관찰 할 수있는 이동성 지연을 겪는 반면, 자유 tRNA (UUU)는 더 빠르게 이동합니다. 우리는 TcdA가 tRNA (UUU) 결합 효소임을 입증합니다. 이 겔 지연 분석은 TcdA 돌연변이 체와 첨가제 및 기타 단백질이 결합에 미치는 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

겔 지연 분석 1 (전기 이동성 이동 분석, EMSA라고도 함)은 단백질 - 핵산 상호 작용을 연구하고 특성화하기 위해 고안된 전기 영동 방법입니다. 단백질 - RNA 상호 작용뿐 아니라 정제 된 성분 또는 단백질 ( 예 : 세포 용 해물) 또는 핵산 ( 예 : tRNA)의 복잡한 혼합물을 사용하여 tRNA와 tRNA 결합 단백질 간의 상호 작용뿐만 아니라 단백질 -DNA의 분석도 가능합니다 수영장). 우리는 정제 된 tRNA (UUU)와 anticodon stem loop (ASL)에서 A37에 부착 된 threonylcarbamoyl 측쇄를 고리 화하는 N 6 - threonylcarbamoyladenosine (t 6 A) 탈수 효소 인 TcdA 사이의 상호 작용 연구에 겔 지연 분석을 적용했습니다. tRNA의 cyclic t 6 (ct 6 A) 2 , 3 로의 전환. TcdA는 또한 CsdL 3 ,tcdA / csdL 유전자는 csdA 와 csdE 유전자를 갖는 클러스터를 형성하는데, 시스테인 탈황 효소와 시스테인 술핀 데스 탈 루핀 (CSD) 시스템의 황 수용체를 암호화하고 생체 내에서 TcdA 기능을 유지해야한다.

겔 지연 분석법의 근거는 유리 핵산 분자가 큰 음전하 때문에 아크릴 아마이드 또는 아가로 오스 겔의 앞쪽으로 빠르게 이동하지만 동일한 핵산의 단백질 복합체의 전기 영동 이동도가 크게 감소한다는 것입니다. 이동성의 감소는 핵산 - 단백질 복합체에서 "이동"으로 시각화되어 개별 밴드로 분해됩니다. 양전하를 띠고 큰 핵산 - 단백질 복합체는 겔상에서보다 큰 이동도 또는 이동도 감소를 나타낸다.

복합체의 전하 중화는 보편적 인 현상이므로단백질 - 핵산 복합체의 경우, 겔 지연 분석은 광범위한 복합체 및 핵산 유형에 적용될 수 있습니다. 이 방법은 간단하고 저렴하며 최소한의 장비로 실험실에서 수행 할 수 있습니다. 소량의 단백질과 tRNA 만 있으면됩니다. 이것은 대체로 더 많은 양의 표본을 소비하는 대체 생물 물리 기술보다 유리합니다.

겔 지연 분석은 전사 인자 연구에 널리 사용되었습니다. 이 분석법은 많은 다른 DNA 서열에 대한 전사 인자의 결합 동역학, 강도 및 특이성을 분석하는 데 사용되었습니다. 이 분야에서 실제로 EMSA가 처음 개발 된 것은 6 , 7 이었다. RNA 8 , 9 , 10 , 11 및 tRNA 분자를 이용한 겔 지연 분석도 리보솜 연구에 사용되었습니다우리가 여기에서와 같이 전사 후 tRNA 뉴 클레오 시드를 변형시키는 효소를 분석 할 수 있습니다.

다양한 매개 변수가 온도, 단백질 및 tRNA 샘플의 품질, 결합 강도와 같은 겔 지연 분석의 결과에 영향을 미칩니다. 실험의 신중한 계획과 실행은 유리 핵산과 단백질 결합 종의 결과 해석에 중요합니다. 여기에서, 프로모터가 Shine-Dalgarno 리보솜 결합 부위가 결여 된 발현 벡터에 클로닝 된 tRNA (UUU)를 코딩하는 합성 유전자를 사용하여 다량의 tRNA 2 의 합성을 유도 하였다. 이 상세한 프로토콜은 일반적인 실수를 피하면서 tRNA 겔 지연 실험을 수행하기위한 명확한 안내서를 제공하기위한 것입니다.

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프로토콜

주의 : 사용하기 전에 관련된 모든 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 프로토콜에 사용 된 화학 물질 중 일부는 독성과 부식성이 있습니다. 흄 후드 및 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 긴 바지, 닫힌 발가락 신발 등 )의 사용을 포함하여 페놀을 사용하여 tRNA 추출을 수행 할 때 적절한 방법을 사용하십시오. 이 프로토콜은 무독성 핵산 얼룩을 사용합니다. 대체 얼룩의 사용은 독성 및 / 또는 발암 성 ( 예 : ethidium bromide)이있는 경우 염색제의 추가 예방 조치 및 특수 처분이 필요할 수 있습니다.

1. 아가로 오스 겔의 제조

  1. 아가로 오스 2g을 달아 유리 병에 넣고 2 % w / v 아가 로스 겔을 만든다.
  2. 아가로 오스 함유 병에 1X 트리스 - 보레이트 - 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (TBE) 러닝 버퍼 100 ML을 추가합니다. 전자 레인지에서 가열하여 녹입니다. 30 초 간격으로 내용물을 혼합하여 혼합하십시오아가로 오스가 완전히 용해 될 때까지이 단계를 반복하십시오. 아가 로스 용액을 약 50-60 ° C로 식힌다.
  3. 겔 쟁반의 열린 가장자리를 테이프로 곰팡이를 만들고 적절한 빗을 넣어 우물을 만들고 용융 된 아가로 오스를 넣습니다. 거품 형성을 피하고 실온에서 응고 시키십시오.
  4. 응고되면 겔 트레이를 전기 영동 장치에 넣고 겔이 완전히 덮일 때까지 TBE 완충액으로 채 웁니다.

2. tRNA의 제조

  1. 대장균 에서 Express tRNA (UUU)
    1. 아침에 낮은 염 Luria Broth (LB)를 줄기 위해 발현 벡터 pET23d-EcUUU 2 ( 대장균 tRNA (UUU)를 코딩하는 유전자가 있음)로 형질 전환 된 냉동 E. coli BL21 (DE3) 100 μg / mL 암피실린을 보충 한 플레이트. 식민지가 나타날 때까지 접시를 뒤집고 37 ° C 배양기에 넣으십시오 (늦은 오후oon).
    2. 5 ML LB + 100 μg / ML 암피실린에 잘 자란 단일 식민지를 접종하고 37 220 ML에서 밤새 성장 ° C.
    3. 다음날 아침에 펠렛 세포 (4 ℃에서 10 분 동안 6,500 xg)를 5 ㎖ 신선한 LB + 100 ㎍ / mL 암피실린으로 재현 탁하고 재현 탁한다. 이 현탁액을 사용하여 200 mL LB와 100 μg / mL 암피실린을 접종하십시오. 37 ℃에서 220 rpm으로 5 시간 동안 성장시킨다.
    4. 590 nm (OD 590 )에서 배양 물의 광학 밀도가 0.6 - 0.8에 도달 할 때, 1 mM IPTG를 배양 물에 첨가하여 tRNA (UUU) 유전자의 발현을 촉발시켰다. 37 ° C에서 3 시간 동안 배양하십시오.
    5. 4 ° C에서 10 분 동안 6,500 xg에서 문화를 centrifuging하여 세포를 수확.
  2. 용해 및 추출
    1. 5 ML의 용해 버퍼 (0.3 M 나트륨 아세테이트, 10 MM EDTA)에 세포 펠렛을 Resuspend. 이 시점부터 오토 클레이브 된 완충액을 사용하고 4 ℃에서 모든 tRNA- 함유 시료를 유지하여 tRNA 분해.
    2. 흄 후드에 resuspended 세포 펠렛에 산성 페놀 (산도 4.3) 1 볼륨을 추가합니다. inversion에 의해 1 분간 혼합하여 세포를 용해시키고 10,000 xg (10 분, 4 ℃)에서 원심 분리한다.
    3. 유기 (바닥) 단계를 대기음하지 않도록주의하면서 피펫을 사용하여 가용성 tRNA (UUU) (그리고 다른 tRNA 풀의 작은 농도)를 포함하는 상단 수성 단계를 수집하십시오. 유기층과 세포 잔해로 구성된 펠렛을 적절한 용기에 버리십시오.
    4. 4 ° C에서 1 시간 동안 inversion하여 2.5 volume 100 % v / v 에탄올로 용해성 (수성) 상을 완전히 혼합하여 tRNA를 침전시킨다. 혼합물을 15,000 xg (30 분, 4 ° C)에서 원심 분리하십시오.
    5. 뜨는을 조심스럽게 버리고 4 ML 겔 여과 버퍼 (20 MM 인산 나트륨 또는 인산 칼륨, 산도 7.4, 0.1 MM EDTA)에 tRNA가 풍부한 펠렛을 resuspend. 2 % w / v 아가로 오스 젤에 resuspended tRNA 풀 5 μL를 실행합니다.
      노트:좋은 품질의 tRNA는 단일 밴드 (50-100 bp 사이의 분자 크기)로 나타납니다.
  3. tRNA (UUU)의 정제
    1. 표준 크로마토 그래피 실습 12 에 따라 겔 여과 버퍼에서 미리 평형화 된 고해상도 분 취용 겔 여과 컬럼 (크기 : 16 x 600 mm, 베드 용적 : 120 mL, 분해능 범위 : 1,000 - 70,000 Da)에 재현 탁된 tRNA (UUU) (이동상). 샘플을 용리시키기 위해 유속을 1 mL / min으로 설정하십시오.
      참고 : tRNA (UUU) 피크는 대략 75.5 mL에서 용리됩니다. 전형적으로, 배양 물의 0.5 내지 1.0 mg / L 수율의 tRNA가 수득 될 수있다.
    2. 2 % w / v 아가로 오스 겔에서 각 시료 5 - 10 μL를 전기 영동하여 대표 용리 부피에서 시료를 분석하십시오.

3. 샘플 준비

  1. Lopez-Estepa et al .에 따라 TcdA를 표현하고 정제하십시오. 2 .
    참고 : 최대 250 μMTcdA는 연구에 사용될 수 있습니다.
  2. 표 1 에 따라 TcdA의 해당 양을 적절하게 표시된 1.5 mL 원심 분리 튜브에 피펫 팅합니다. 1.6 MM 트리스 (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) (최종 농도)을 추가하고 피펫을 사용하여 부드럽게 섞는다. 뚜껑을 닫고 5 분 동안 실온에서 혼합물을 품어.
  3. 10 μM의 아데노신 트리 포스페이트 (ATP)와 50 mM MgCl 2 (최종 농도)를 첨가한다. 피펫과 혼합하고 실온에서 5 분 동안 혼합물을 품어.
  4. 표 1에 따라 정제 tRNA (UUU) (섹션 2.3)를 추가하고 피펫과 섞은 다음 5 분 동안 실온에서 배양하십시오.
  5. 최종 볼륨 100 μL까지 인산염 완충 식염수 (PBS)를 추가합니다. 제대로 혼합하고 10 % v / v의 최종 농도에 글리세롤을 첨가하십시오.
  6. 시료를 보텍스하고 튜브의 내용물을 잠깐 스핀 다운하십시오 (10,000 xg, 1 분, 4 ° C).

4. 겔 적재 및 전기 영동 개발

  1. 전기 영동을 수행하는 동안 챔버를 4 ° C로 유지하기 위해 분쇄 얼음으로 채워진 트레이에 전기 영동 장치를 놓습니다.
  2. 조심스럽게 각 샘플 5 μL를 해당 우물에 피펫 팅합니다. 적합한 DNA 크기 마커를 추가하십시오.
  3. 전극을 전원 공급 장치의 해당 슬롯에 꽂습니다. 전원 공급 장치를 켜고 전압을 100V로 설정하고 90 분 동안 젤을 실행하십시오.

5. tRNA- 단백질 상호 작용을 관찰하기위한 젤 염색

  1. TBE 50 ML과 적절한 DNA 얼룩 1X를 혼합하여 얼룩 솔루션을 준비합니다. 얼룩이있는 용기를 알루미늄 호일로 가려서 햇빛에 염색 용액을 노출시키지 마십시오.
    참고 : DNA 얼룩은 일반적으로 10,000 또는 20,000 배 농축 주식으로 저장됩니다.
  2. 전기 영동 90 분 후 조심스럽게 쟁반에서 젤을 제거하고 얼룩 솔루션과 컨테이너에 넣으십시오. 실내 온도에서 낮은 흔들림 속도로 로커에 올려 놓으십시오.30 분간 방치한다.
  3. 염색 용기에서 아가로 오스 겔을 꺼내어 셀룰로오스 조직이나 여과지에주의하여 가볍게 두드려 과잉 액을 제거하고 직접 투광기 위에 놓습니다. 자외선을 켜고 tRNA가 포함 된 밴드를 시각화하십시오. 젤의 사진을 찍으십시오.
  4. 단백질 염색 (선택).
    1. DNA 염색 용액을 안전하게 폐기하고 (안전 절차에 따라) 50 mL의 Coomassie Brilliant Blue (CBB) 용액으로 대체하십시오. 트레이를 실온에서 로커에 놓고 밤새 얼룩이 져야합니다 (> 12 시간). 과도한 염료를 제거 CBB 얼룩 솔루션을 폐기하고 50 ML PBS로 교체하십시오. 로커에서 1 시간 동안 처치하십시오.
  5. 가벼운 transilluminator에서 단백질 함유 tRNA 복합체를 시각화하고 젤의 사진을 찍어 tRNA UV 젤 그림과 비교하십시오.

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결과

강력한 유도 성 T7 프로모터의 제어하에 대장균 에서 tRNA 유전자를 발현시킴으로써 대량의 tRNA (UUU)를 얻을 수있다. 발현 된 tRNA (UUU)는 세포질에 축적되며 자연적으로 풍부한 tRNA 풀을 풍부하게합니다. 포획 / 추출 단계 및 겔 여과 / 연마 단계로 이루어진 2 단계 정제 공정을 이용하여 EMSA 급 tRNA를 수득 하였다. 포획 / 추출 단계는 단백질, 세포 파편, DNA 및 tRNA (및 기타 RNA 분자) 추출의 동시 침전을 달성하기 위해 pH 4.3 페놀을 사용합니다. 이 단계에서 총 tRNA 풀의 양은 2 % w / v 아가로 오스 겔에서 전기 영동으로 평가할 수 있습니다. 두 번째 단계는 RNA 종류를 분자 크기에 따라 분리하는 겔 여과 크로마토 그래피를 통합합니다. 254 nm의 UV 추적을 사용하여 분리를 모니터하고 주요 용리 피크를 확인합니다 ( 그림 1상단)....

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토론

본원에 기술 된 단백질 -tRNA 아가로 오스 겔 지연 분석법은 여러 가지 방법으로 변형 될 수있다. 첫째, 젤에서 아가로 오스의 비율은 여기 분석 (120 kDa)보다 훨씬 큰 단백질 - tRNA 복합체의 분리 및 시각화를 허용하기 위해 줄일 수 있습니다. 둘째, 목표 단백질이 열 안정성이있는 경우, 전기 영동 장치를 차가운 방으로 옮기거나 전기 영동 챔버 내부의 얼음 팩을 사용하여 생성 된 열을 즉시 소산시킴으로써 온도가 최대 허용 온도 이하로 유지되도록하는 추가 예방 조치가 취해 져야합니다 달리는 동안. 필요에 따라 또는 샘플 11에서 허용되는 경우 실행 시간을 단축하기 위해 다른 버퍼 조성물 ( 예 : 0.5X TB, 트리스 - 보레이트) 및 작동 매개 변수 (> 20V / cm)를 수정할 수 있습니다. 제안 된 MgCl 2 농도는 시료 준비 단계에서 RNA 분해가 관찰되면 감소 될 수 있는데, 이는 2가 cati잠재적으로 핵산의 절단을...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

MCV는 CIB 교내 프로그램 "더 나은 삶을위한 분자 기계"(MACBET)의 회원입니다. 이 결과를 이끌어 낸 연구는 Salut Carlos III 스페인 연구소 (PI12 / 01667에서 MCV), 스페인의 Competitividad Ministerio Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R 및 SAF2015-72961-MCV의 EXP)로부터 자금을 지원 받았다. ), 마드리드 지방 정부 (S2010 / BD-2316 ~ MCV) 및 유럽위원회 (Framework Program 7 (FP7)) 프로젝트 ComplexINC (계약 번호 279039 - MCV) 재단 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 작성에 아무런 역할을하지 못했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
E. coli BL21(DE3)Novagen70235DE3 lysogen은 IPTG 유도 시 T7 중합효소를 함유하고 있습니다.
pET23dNovagen69748-3pET23d는 암피실린에 대한 내성을 부여합니다. T7 프로모터.
LB 육수, 저염 (Lennox L Broth), 과립MelfordGL1703기존 LB 육수, 고염도 사용할 수 있습니다.
AmpicillinSigma-Aldrich10419313
인큐베이터 쉐이커 (온도조절 가능)NBSExcella E24 온도 조절 기능이 있는 모든 쉐이커 인큐베이터를 사용할 수 있습니다.
이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG), >=99%아크로스 오가닉스BP1755
소듐 아세테이트, 무수, >99%멜포드B4017
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디소듐 염, >99%아크로스 유기물AC327205000흡입하면 유해합니다.
원심분리기(냉장)Eppendorf5430
원심분리기(냉장) 로터Eppendorf5430/5430P
원심분리기SorvallRC5C
원심분리기 로터SorvallSLA-3000
페놀 용액, 0.1 M 구연산염 완충액으로 포화, pH 4.3 & 플러스 0.2Sigma-AldrichP4682급성 독성 (경구, 진피, 흡입),
분석을위한 부식성 에탄올 절대, 100 % v / vMerck Millipore
인산 나트륨 이염기성 이수화물, Na2< / sub>HPO4< / sub>, > = 99 %Sigma-Aldrich71643
인산 이수소 칼륨, KH2< / sub>PO4< / sub>Merck48,730,250
HiLoad 16/60 Superdex 75 GE 헬스케어28989333
아가로스MelfordMB1200
Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl]MelfordT1513
Boric AcidMelfordB0503
MicrowaveHaier HDA-2070M
TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride]Sigma-AldrichC4706금속과 피부를 부식시킵니다.
ATP[아데노신 5&프라임;-트리포스페이트 디소듐 염 수화물], 등급 I, >=99%시그마-알드리치A2383
염화마그네슘(MgCl2), 무수, >=98%시그마-알드리치M8266
염화나트륨(NaCl), >99%Fisher BioreagentsBP358
염화칼륨(KCl), >99%멜포드P0515
NZYDNA Ladder VINZYtechMB8901
전원 공급 장치ConsortEV261
전기 영동 장치Real LaboratoryRELSMINI10
Real Safe 핵산 염색Real LaboratoryRBMSAFE20,000X 재고
UV Transilluminator (G : Box / EF)Syngene2216498
Coomassie Brilliant Blue GSigma-AldrichB0770
록커 (자이로-록커)스튜어트SSL3
믹서 Vortex 피셔 브랜드13214789
100983

참고문헌

  1. Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
  2. López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606(2015).
  3. Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
  4. Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
  5. Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
  6. Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
  7. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
  8. Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
  9. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  10. Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
  11. Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
  12. Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 10, Unit 10.9 (2001).

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